Activering en conjugatie van oplosbare polysacchariden met behulp van 1-cyano-4-dimethylaminopyridinetetrafluorboraat (CDAP)

OPMERKING: Bereid de polysaccharide-oplossing, ADH-oplossing, DMAP-oplossing en CDAP-voorraadoplossing van tevoren voordat u de polysaccharideactiverings- en functionalisatieprocedures uitvoert. Plaats de oplossingen en apparatuur op een georganiseerde, handige en logische locatie. De beschreven reactie is voor 10 mg polysaccharide en kan omhoog of omlaag worden geschaald. Het wordt aanbevolen om het protocol op kleine schaal te evalueren voordat u opschaalt. 1. Bereid 5 mg / ml polysaccharide-oplossing, 2 ml. Voor lyofiliseerde polysaccharide Laat de polysaccharide container op kamertemperatuur komen voordat u deze opent. Weeg 10 mg polysaccharide af in een buis met schroefdop met behulp van een analytische balans. Gebruik een statische eliminator voor eenvoudigere bemonstering en nauwkeuriger wegen van het poeder. Voeg 2 ml 0,15 M natriumchloride (NaCl) toe aan de buis om de polysacharide op te lossen. Dop en vortex de buis.OPMERKING: Natriumchloride heeft geen invloed op de CDAP-reactie, maar het kan de secundaire structuur van polysaccharide beïnvloeden. Sommige polysacchariden zijn beter oplosbaar bij verschillende zoutconcentraties. Meng de buis door end-over-end rotatie gedurende 12-24 uur, afhankelijk van het molecuulgewicht van de polysacharide, zodat de polysaccharide volledig kan hydrateren. Verwarm de tube indien nodig voorzichtig om de oplosbaarheid te bevorderen. Voor oplosbare polysacharide in gebufferde oplossingOPMERKING: Voor een efficiënte CDAP-activering mag de polysaccharide-oplossing geen buffer bevatten, met name fosfaationen. Volg de onderstaande procedure om de buffer te vervangen door water of een zoutoplossing en om de polysaccharideconcentratie aan te passen tot 5 mg/ml. Verkrijg een 4 ml of 15 ml centrifugaal-spin filterapparaat van de juiste moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO).OPMERKING: De MWCO is idealiter 5-10 keer kleiner dan het molecuulgewicht van de polysaccharide. Voeg een volume van de gebufferde polysaccharide-oplossing met ~20 mg van de polysaccharide toe aan de filterinzet. Vul tot de volledige markering met water of een zoutoplossing. Sluit het filter goed af. Meng een paar keer end-over-end. Centrifugeer het filterapparaat met de door de fabrikant voorgestelde centrifugaalkracht. Zorg ervoor dat de centrifugatietijd lang genoeg is om na elke draai ten minste 5-voudige volumereductie te bereiken. Gooi de doorstroming weg. Monteer het filterapparaat opnieuw. Vul de filterinzet tot de volledige markering met zoet water of zoutoplossing. Sluit het filter goed af. Meng de inhoud in het filter door end-over-end rotatie ~ 10 keer of door zachte vortexing; herhaal de spin.OPMERKING: Polysaccharide kan zich ophopen aan de onderkant van de filterinzet van het centrifugaalapparaat en een gel vormen. Het wordt aanbevolen om de retentant in de filterinzet opnieuw te mengen met de verse navulling voor de volgende draaiing. Herhaal de navul- en spincyclus minimaal 3 keer. Volg de onderstaande oefening om de polysaccharide-retentant uit de filterinzet te herstellen. Voeg vers water of zoutoplossing toe aan de filterinzet zodat het volume ~ 1 ml is. Meng door op en neer te pipetteren of door zachtjes te vortexen. Breng alle gemengde retentanten over in een buis van 5 ml. Voeg 1 ml zoet water of zoutoplossing toe aan de filterinzet. Spoel het filter door op en neer te pipetteren of door zachtjes te vortexen. Breng alle spoelingen over en combineer ze met de teruggewonnen polysacharide. Bepaal de polysaccharideconcentratie (zie de polysacharidetest in rubriek 7.3). Verdun de polysaccharide met extra water of zoutoplossing tot 5 mg /ml. Wanneer de polysaccharide-oplossing is bereid, koelt u de buis met de polysaccharide-oplossing in een ijsemmer. 2. Bereid 0,5 M adipinezuur dihydrazide (ADH) oplossing, 10 ml. Weeg 0,87 g ADH in een analytische balans en solubiliteer in 8 ml van 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur), pH 8. Pas aan de beoogde pH aan met 1 M natriumhydroxide (NaOH), bewaakt door een pH-meter. Breng tot 10 ml met extra buffer en bevestig de pH opnieuw. 3. Bereid 2,5 M DMAP-oplossing, 10 ml. OPMERKING: DMAP is giftig en zal de huid binnendringen. Draag nitrilhandschoenen bij het uitvoeren van de procedure. Weeg 3 g DMAP voorzichtig af in een conische buis van 50 ml. Voeg 5 ml water toe aan DMAP en meng door gedurende 5 minuten te vortexen om een troebele oplossing (~ 7 ml) te verkrijgen. Voeg tijdens het mengen stappen van 50 μL van 10 N zoutzuur (HCl) toe aan de DMAP-oplossing. Meng tussen elke toevoeging. Stop met toevoegen wanneer de oplossing duidelijk wordt. Voeg 10 N NaOH toe in stappen van 25 μL om de DMAP-oplossing op ~pH 8 te brengen. Breng de DMAP-oplossing met water op 10 ml om een oplossing van 2,5 M te geven. Verfijn de pH van de 2,5 M DMAP-oplossing.OPMERKING: De pH van de DMAP-oplossing verandert met de concentratie en ionische sterkte. Deze oefening is om de 2,5 M DMAP-voorraad af te stemmen op een specifieke pH, zodat wanneer deze wordt gemengd met 10 volumes polysaccharide, de resulterende oplossing dicht bij de beoogde pH voor activering ligt. Bereid een reeks buizen van 1,5 ml met 1 ml water of de NaCl-oplossing, afhankelijk van wat werd gebruikt voor de bereiding van de polysaccharide-oplossing. Koel de buizen op ijs. Voeg 100 μL DMAP toe aan een gekoelde buis. Vortex en meet de pH met een pH-meter. Gooi vervolgens de gemeten buis weg. Als de gemeten pH niet in de buurt van de streefwaarde ligt, past u de pH van de DMAP-voorraad aan met 1 M NaOH of HCl, naargelang het geval. Herhaal stap 3.5.2 en 3.5.3 totdat de gemeten pH dicht bij de streef-pH ligt. 4. Bereid 100 mg/ml CDAP-stamoplossing OPMERKING: CDAP-poeder moet goed gesloten worden gehouden en worden bewaard bij -20 °C en vóór opening op kamertemperatuur worden gebracht. Draag nitrilhandschoenen bij het uitvoeren van de procedure. Gebruik een microcentrifugebuis met snap-cap van 1,5 ml op een analytische balans. Weeg met behulp van een kleine spatel 10-140 mg CDAP in de buis. Let op het werkelijke gewicht van CDAP. Bepaal het volume acetonitril dat nodig is om 100 mg / ml CDAP te bereiden. Open acetonitril in een zuurkast. Trek met behulp van een geschikt volumepipetter het acetonitril en laat het los om de damp in de pipetpunt in evenwicht te brengen. Wacht tot het oplosmiddel na een paar seconden uit de pipetpunt druipt en wees voorbereid om het rechtstreeks naar de CDAP-buis over te brengen. Teken het berekende volume acetonitril en breng het direct over naar de CDAP-buis. Klik de dop dicht.OPMERKING: Acetonitril kan ook worden overgebracht naar de CDAP-buis met behulp van een Hamilton-spuit of het equivalent daarvan van geschikte grootte. Vortex om de CDAP volledig op te laten. Plaats de CDAP-buis in een ijsemmer.OPMERKING: CDAP is stabiel in acetonitril in de kou. Oplosbare voorraden mogen gedurende >1 week bij -20 °C worden bewaard. Het verdient echter de voorkeur om verse CDAP-oplossingen te bereiden. 5. Polysaccharide activering en hydrazide functionalisatie Zorg ervoor dat alle volgende items klaar zijn en oplossingen gekoeld op ijs voordat de activering wordt gestart: 2 ml van een polysaccharide-oplossing van 5 mg / ml in een container met platte bodem en brede mond met een roerstaaf, bovenop een magnetische roerder geplaatst; 100 mg/ml CDAP-stamoplossing; 2,5 M DMAP-voorraadoplossing; een pH-meter met een semi-micro pH-sonde, zoals de sonde met een diameter van 6 mm, gekalibreerd voor 0 °C volgens de instructies van de fabrikant; een voor gebruiksklare pipet van 100 μL; een timer gewist en klaar voor gebruik; een autotitratordispenserkop geplaatst of 10 μL pipet klaar voor gebruik; 0,5 M ADH-oplossing. Pas de pH van de polysacharide vooraf aan de pH van het doel aan met behulp van DMAP. Plaats de pH-sonde in de polysaccharide-oplossing en laat deze tijdens de gehele activeringsprocedure in de oplossing. Breng 200 μL van de DMAP-stamoplossing over in de polysaccharide-oplossing door druppelsgewijs onder het roeren toe te komen. Pas de pH van de oplossing aan de beoogde pH van activering aan. Voeg 0,1 M HCl toe om de pH te verlagen en 0,1 M NaOH om de pH te verhogen. Vermijd het overschrijden van de beoogde pH met meer dan 0,1 pH-eenheid en houd de reactie gekoeld in een ijswaterbad gedurende de activering. CDAP-activering Pipetteer 100 μL CDAP op en neer om de damp in de pipetpunt in evenwicht te brengen. Breng onder roeren 100 μL CDAP over in de polysaccharide-oplossing.OPMERKING: Deze activering gebruikt 1 mg CDAP voor 1 mg polysaccharide als startverhouding. De verhouding kan worden verhoogd of verlaagd bij het optimaliseren van de activering. Start de timer en controleer de pH-verandering tijdens de gehele activering. Handhaaf de reactie op de pH van het doel door onmiddellijk stappen van 10 μL van 0,1 M NaOH aan de reactie toe te voegen, met behulp van een autotitratordispenser (of pipet).OPMERKING: Het kan helpen de pH-responstijd te verkorten om voorzichtig met een pH-sonde te roeren. De pH daalt in het begin sneller en het kan nodig zijn om de 0,1 M NaOH vaker toe te voegen. Naarmate de reactie vordert, wordt de pH-daling langzamer en wordt de toevoeging minder frequent. De pH moet in wezen ongewijzigd blijven bij het naderen van de optimale activeringstijd, die 10-15 minuten is voor pH 9-activering. ADH functionalisatie Wanneer de optimale activeringstijd is bereikt, voegt u onder roeren 2 ml van 0,5 M ADH in één keer toe aan de geactiveerde polysaccharide. Controleer of de pH binnen het doelbereik ligt (pH 8-9 voor ADH).OPMERKING: Eén toevoeging met snel mengen minimaliseert de kans dat beide uiteinden van het dihydrazide reageren met de geactiveerde polysaccharide, waardoor polysaccharide crosslinking wordt voorkomen. Blijf het reactiemengsel gedurende ten minste 1 uur roeren. Breng het reactiemengsel over op 4 °C, maar 0-20 °C is aanvaardbaar.OPMERKING: De ADH-functionalisatiereactie is niet sterk afhankelijk van de temperatuur. Omdat de grote overmaat aan dihydrazide fungeert als het blusreagens, is het niet nodig om de geactiveerde polysaccharide verder te doven. Bij het direct conjugateren van eiwitten moet de reactie echter worden geblust, meestal met 1 M glycine, pH 8-9. 6. Zuivering van ADH-gefunctionaliseerde polysaccharide door dialyse OPMERKING: Het ruwe product van de ADH-functionalisatiereactie bevat een hoge concentratie ADH (0,5 M), die het meest efficiënt kan worden verwijderd door uitgebreide dialyse. Gelfiltratie, hetzij met een kolom of een spin-ontsaltingsapparaat, is niet zo efficiënt, vooral wanneer het nodig is om de resterende ADH-verontreiniging te verwijderen. Bepaal de MWCO van het dialysemembraan. Gebruik een cutoff van 3 kDa voor kleinere polysacchariden.OPMERKING: De MWCO van het dialysemembraan is idealiter 5-10 keer kleiner dan de MW van polysaccharide. Kies het gewenste dialyseformaat (cassettes of slangen) en de juiste apparaatcapaciteit. Zorg ervoor dat de capaciteit van het apparaat 2 keer groter is dan het monstervolume. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het gebruik van het apparaat. Hydrateer het dialysemembraan in water voor gebruik. Breng de ruwe gederivatiseerde polysaccharide-oplossing over naar het dialyseapparaat volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: Draag nitrilhandschoenen om contact met DMAP te voorkomen. Dialyseer in een container gevuld met 2-4 L van 1 M NaCl en een roerstaaf. Plaats de container op een roerplaat in een koude ruimte of in een koelkast. Roer het dialysaat zacht en continu tijdens de dialyse. Na het dialyseren gedurende ten minste 4 uur, overschakelen op verse 1 M NaCl en dialyseren gedurende ten minste 12 uur. Dialyseer tegen 2 veranderingen van 0,15 M zoutoplossing, elk gedurende ten minste 12 uur. Indien gewenst dialyseren tegen 2 verversingen van water. Controleer of alle ADH is verwijderd door het dialysaat ‘s nachts te testen met behulp van een snelle TNBS-test. Verkrijg 3 borosilicaatbuizen, label ze als respectievelijk negatief besturingselement (ctrl), positieve ctrl en monster. Voeg aan de negatieve ctrl-buis 975 μL van 0,1 M boraat, pH 9 toe. Voeg aan de positieve ctrl-buis 100 μL van 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazide) en 875 μL van 0,1 M boraat, pH 9 toe. Voeg aan de monsterbuis 500 μL van het overnight dialysaat en 475 μL van 0,1 M boraat, pH 9, toe. Voeg 25 μL van 1% TNBS toe aan alle drie de buizen. Meng goed. Plaats in het donker gedurende 1 uur. Vergelijk de kleurintensiteit van de 3 buizen in 1 uur. Zorg ervoor dat de kleurintensiteit van de monsterbuis tussen die van de positieve ctrl en de negatieve ctrl ligt, wat aangeeft dat de ADH-verontreiniging tot 0,01 mM of lager is. Dialyze nog een keer.OPMERKING: Het is verstandig om het niveau van de ADH-verontreiniging zoveel mogelijk te verlagen, zodat de ADH-hydrazide minder dan 1% van de totale hydrazide in de gezuiverde hydrazide-polysaccharide uitmaakt. Herstel de gederivatiseerde polysaccharide uit dialyse. Bepaal de concentratie van de polysacchariden en hydrazide. Bereken de hydrazide/polysaccharideverhouding (zie rubriek 7). Als de gedialyseerde polysacharide geconcentreerd moet zijn tot 5-10 mg/ml, raadpleeg dan rubriek 1.2. 7. Analyse van hydrazide-gederivatiseerde polysacchariden OPMERKING: Het doel van de hier beschreven analyse is het bepalen van de polysaccharideconcentratie, de hydrazideconcentratie en het niveau van hydrazide-derivatisatie in termen van de hydrazide / polysaccharide-verhouding. MonstervoorbereidingOPMERKING: Polysacchariden die moeten worden getest, moeten vrij zijn van koolhydraten, amine of hydrazide-onzuiverheden met een laag molecuulgewicht. Gelyofiliseerde monsters moeten droog en zoutvrij zijn om een nauwkeurige gewichtsmeting te garanderen. Gewoonlijk is ~ 1 ml van een 1-2 mg / ml oplossing voldoende voor assays. Weeg ten minste 10 mg van het gelofiliseerde polysaccharidemonster af op een analytische balans, met behulp van een niet-statische spatel of een statische eliminator. Los de polysacharide op in water of zoutoplossing tot een concentratie (bv. 2 mg/ml) zodat de testsignalen binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen. Meng end-over-end en geef het monster voldoende tijd om het volledig op te lossen. Voer ‘s nachts hydratatie uit, afhankelijk van het molecuulgewicht van polysaccharide. Polysaccharide assay: resorcinol/zwavelzuur methodeOPMERKING: De juiste test voor polysacchariden is afhankelijk van de koolhydraatsamenstelling van de polymeren. De oorspronkelijke recircinol/zwavelzuurtest was bedoeld voor hexosesuikers10. De test werd hier aangepast door de temperatuur van de verwarmingsstap te verhogen van 90 °C naar 140 °C. Bij deze hogere temperatuur verliest de test enige specificiteit, maar kan worden gebruikt om veel suikers te testen. Het is echter nog steeds noodzakelijk om de geschiktheid van de test voor een bepaalde polysaccharide te bepalen. Triplicaten worden aanbevolen voor elk punt, maar sommige accommodatie kan nodig zijn vanwege de capaciteit van het verwarmingsblok.Bereid 75% zwavelzuurOPMERKING: Geconcentreerd zwavelzuur is extreem corrosief en kan ernstige brandwonden veroorzaken. Voer deze procedure uit in een chemische zuurkast. Giet geconcentreerd zuur altijd in water, niet andersom! Voeg 50 ml water toe aan een glazen fles van 200 ml. Plaats de fles in een koudwaterbad. Voeg langzaam 150 ml zwavelzuur toe. Dop de fles zo dat deze wordt geventileerd. Laat de oplossing op kamertemperatuur komen. Gebruik de oplossing binnen 3 maanden. Bereid koolhydraatstandaarden voor Bereid de ongewijzigde polysaccharide-oplossing met 1 mg/ml voor gebruik als standaard. Als alternatief kunt u een mix van individuele suikers gebruiken in de verhouding die wordt aangetroffen in de herhalingseenheid van de polysaccharide, bij 1 mg / ml van de totale suikerconcentratie, als standaard.OPMERKING: Hoewel de suikermix meestal hetzelfde resultaat geeft als het koolhydraatpolymeer met identieke suikersamenstelling, moet dit experimenteel worden bevestigd. Zorg ervoor dat het verwarmingsblok met buishouders voor 13 x 100 borosilicaat reageerbuizen functioneert. Gebruik een beschermende pad onder en rond het verwarmingsblok in geval van zuur morsen. Verwarm het verwarmingsblok voor op 140 °C gedurende minimaal 1 uur om een stabiele, uniforme temperatuur te bereiken door alle gebruikte blokken. Label 13 x 100 borosilicaat reageerbuizen, drievoud voor elke standaard en elk monster. Voeg 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (of μL) van de 1 mg/ml koolhydraatstandaard toe aan de overeenkomstig gelabelde standaardbuizen. Voeg water toe aan elke buis om het volume op 100 μL te brengen.OPMERKING: De gegenereerde kleur is afhankelijk van specifieke suikers. Omdat sommige suikers meer massa nodig hebben om het volledige absorptiebereik te genereren, kunnen de werkelijke hoeveelheden die voor de standaardcurve worden gebruikt, variëren. Stel monstertests in door een volume met ~ 5 μg van de gederivatiseerde polysaccharide toe te voegen aan drie monsterbuizen en breng het totale volume op 100 μL met water. Als alternatief, als de polysaccharideconcentratie in het monster onbekend is, voert u een reeks 4-voudige verdunningen uit. Test 100 μL van elke verdunning in drievoud. Bereid verse resorcinol met 6 mg / ml in gedeïoniseerd (dI) water onmiddellijk voor gebruik. Vortex totdat de resorcinol in oplossing is. Voeg 100 μL 6 mg/ml resorcinol toe aan elke buis. Giet voorzichtig de geschatte hoeveelheid 75% zwavelzuur in een klein bekerglas.OPMERKING: Draag een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril. Wees voorzichtig met druppels, morsen en spatten. Houd natte papieren handdoeken bij de hand om eventuele druppels op te vegen. Aangezien de activiteit van het zwavelzuur verandert bij langdurige blootstelling aan lucht, gebruikt u een uniform mengsel van zwavelzuur voor de gehele test. Voeg met behulp van een herhaalde pipetter gelijkmatig 300 μL 75% zwavelzuur toe aan elke buis. Vortex de buizen krachtig om goed te mengen, waarbij de buis tijdens het vortexen wordt weggenomen. Plaats de buizen in een verwarmingsblok in een gestaag tempo in opeenvolgende volgorde. Zodra alle buizen binnen zijn, stelt u de timer onmiddellijk in op 3 minuten. Verwijder na 3 minuten de buizen in een gestaag tempo in dezelfde volgorde en plaats ze direct in een rek in een ijswaterbad. Laat de buisjes staan tot ze ijskoud zijn. Verwijder de buizen en laat ze gedurende ~ 5 minuten op kamertemperatuur balanceren om condensatie op de cuvette tijdens het lezen te voorkomen. Stel een UV/VIS-spectrofotometer in om de absorptie bij 430 nm af te lezen met behulp van een 10 mm pathlengte cuvette. Blanco met een nul standaard buis. Lees de absorptie van alle buizen af bij 430 nm.OPMERKING: Plastic wegwerp cuvetten zijn handig in gebruik. Construeer een standaardcurve door μg koolhydraatstandaard versus A430uit te plotten. Zie figuur 4 voor een typische standaardcurve met glucose als referentiestandaard. Gebruik de monstertestbuizen met A430-waarden die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen, bereken de μg-hoeveelheid van de onbekende polysaccharide in de monstertestbuizen uit de standaardcurvevergelijking. Bepaal de concentratie van de onbekende polysaccharide uit het volume van de onbekende toegevoegde, rekening houdend met verdunningen. Converteer de concentratie naar mg/ml of μM herhalingseenheden zoals vereist. Hydrazide assay met behulp van trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)Bereid 0,9% NaCl met 0,02% natriumazide (monsterbuffer) door 9 g NaCl en 200 mg natriumazide in dI H2O op te lossen tot een eindvolume van 1 l. Bereid 0,1 M natriumboraat, pH 9 (assaybuffer), door 100 ml 0,5 M natriumboraat, pH 9, te mengen met 400 ml dI H2O. Bevestig dat de pH van de oplossing 9 ± 0,1 is; indien nodig aanpassen. Bereid 1% TNBS door 200 μL van 5% 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuuroplossing te verdunken tot 1 ml met dI H2O. Markeer de buis als 1% TNBS en bewaar bij 4 °C in het donker gedurende een week. Bereid 50 mM ADH-voorraad voor (equivalent aan 100 mM hydrazide). Weeg 871 mg adipisch dihyrazide (ADH) poeder af met behulp van een analytische balans. Los het poeder op in een reagensfles door monsterbuffer toe te voegen aan 100 ml met behulp van een bovenladerbalans. Label de fles als 100 mM hydrazide/50 mM ADH. Dek de fles goed af en bewaar gedurende 1 jaar bij 4 °C. Bereid hydrazidestandaarden voor (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 en 0,6 mM hydrazide). Bereid de 6 hydrazidestandaarden voor door de 100 mM hydrazidevoorraad te verdunnen met monsterbuffer met behulp van een bovenladerbalans. Bereid 100 ml van elke standaard voor om concentratiefouten te minimaliseren. Sluit de flessen goed af en bewaar gedurende 1 jaar bij 4 °C. Het instellen van testreactiesOPMERKING: De TNBS-test wordt uitgevoerd op een reactievolume van 1 ml. Elke testbuis bestaat uit 100 μL van een monster (of een standaard), 875 μL assaybuffer en 25 μl van 1% TNBS-oplossing. Alle testreacties (voor zowel monsters als normen) zijn in drievoud opgesteld. Label 3 borosilicaat glazen buizen (12 x 75 mm) voor elke standaard, inclusief de nulstandaard. Sorteer en rangschik de standaardbuizen in buizenrek in volgorde van toenemende concentratie. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 100 μL of 200 μL om nauwkeurig 100 μL van de normen aan elke overeenkomstige buis toe te voegen. Gebruik voor de nulstandaard 100 μL monsterbuffer. Etiketteer 3 borosilicaatglasbuizen (12 x 75 mm) voor elk verdund monster dat moet worden getest. Sorteer en schik de monsterbuizen dienovereenkomstig in het buizenrek. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 100 μL of 200 μL om nauwkeurig 100 μL van het monster toe te voegen aan elke overeenkomstige monsterbuis. Gebruik een gekalibreerde micropipette van 1000 μL om nauwkeurig 875 μL assaybuffer toe te voegen aan alle testbuizen: de normen en de monsters. Om de testreactie te starten, gebruikt u een gekalibreerde micropipette van 100 μL om nauwkeurig 25 μL 1% TNBS aan elke testbuis toe te voegen. Begin met de nul standaardbuizen, ga naar de standaardbuizen in volgorde van toenemende concentratie en vervolgens naar de monsterbuizen volgens de vooraf bepaalde volgorde. Verander tips bij het starten van een nieuwe standaard of een nieuw monster en houd de tijd die wordt besteed aan het toevoegen van TNBS aan alle buizen binnen 5 minuten. Vortex alle testbuizen gedurende 2 s met hoge snelheid of met een snelheidsinstelling waardoor de vloeistof in de testbuis naar boven kan wervelen om een hoogte van 1/2 inch van de buisopening te bereiken. Noteer de starttijd van de test en stel de timer in op 2 uur. Plaats het assaybuisrek gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur. Wanneer de tijd voorbij is, vortex je alle buizen nog een keer en ga je verder met het verzamelen van gegevens. Dataverzameling Laat de UV/VIS-spectrofotometer opwarmen en de basislijn stabiliseren. Stel de detectiegolflengte in op 500 nm voor de hydrazidetest. Gebruik een kwartscuvet van 1 ml van 1 cm pathlengte voor alle absorptiemetingen voor de gehele test. Begin de gegevensverzameling door een nulstandaardtest over te brengen naar de cuvette; leeg het instrument (stel de absorptie in op nul). Voer één keer uit op elke buis en noteer de absorptiewaarden in een gegevenstabel. Verwijder alle resterende vloeistof uit de cuvette voordat u een nieuw monster leest. Begin met de nulnormen, ga naar de normen van toenemende concentratie en vervolgens naar de monsters. Eenmaal gestart, voert u alle stappen efficiënt uit zonder te stoppen en leest u alle buizen binnen 10 minuten. Voorbeeldgegevens analyseren Maak een standaardcurve door mM hydrazide standaard vs. A500 te plotten. Zoek de standaardcurvevergelijking in de vorm van y = ax + b, waarbij y mM hydrazide vertegenwoordigt en x A500. Zie figuur 4 voor een typische standaardcurve. Bereken mM hydrazide in de monsters met behulp van de standaardcurvevergelijking, waarbij de verdunningsfactoren worden aangepast. Kies voor de berekening alleen de monstertestbuizen met A500-waarden die binnen het lineaire bereik van de standaardcurve vallen. Bereken de molaire verhouding van hydrazide/polysaccharide met behulp van vergelijking (1).Hydrazide/polysaccharide = h / c × MW (1)Waarbij h de mM hydrazide is, c de mg/ml concentratie van de polysacharide en MW het polysaccharide molecuulgewicht in kDa. Bereken de hydrazide-etiketteringsdichtheid per 100 kDa polysaccharide met behulp van vergelijking (2).Etiketteringsdichtheid per 100 kDa polysaccharide = h / c × 100 (2)Waarbij h de mM hydrazide is en c de mg/ml concentratie van de polysacharide.OPMERKING: Voor het gemak kunnen de polysacchariden worden beschouwd als een molecuulgewicht van 100.000 dalton. Dit maakt het mogelijk om een “etiketteringsdichtheid” te overwegen bij het vergelijken van het niveau van derivatisatie van verschillende polysacchariden. Bereken de hydrazide-etiketteringsdichtheid als gewichtspercentage ADH. Bepaal de effectieve mg/ml-concentratie van ADH met behulp van vergelijking(3).mg/ml ADH = (mM hydrazide / 1000) × 174 (3)waarbij 174 de MW van ADH is. Bereken het gewichts % ADH met behulp van vergelijking (4).gewicht % ADH = (mg/ml ADH) / (mg/ml polysaccharide) × 100 (4)