1-Cyano-4-Dimetilamiopyridine Tetrafluoroborate (CDAP) kullanılarak Çözünür Polisakkaritlerin Aktivasyonu ve Konjugasyonu

NOT: Polisakkarit aktivasyon ve fonksiyonelleştirme prosedürlerini gerçekleştirmeden önce polisakkarit çözeltisini, ADH çözeltisini, DMAP solüsyonunu ve CDAP stok çözeltisini önceden hazırlayın. Çözümleri ve ekipmanları organize, kullanışlı ve mantıklı bir konuma yerleştirin. Açıklanan reaksiyon 10 mg polisakkarit içindir ve yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Ölçeklendirmeden önce protokolün küçük bir ölçekte değerlendirilmesi önerilir. 1. 5 mg/mL polisakkarit çözeltisi, 2 mL hazırlayın. Liyofilize polisakkarit için Açmadan önce polisakkarit kabının oda sıcaklığına gelmesini izin verin. Analitik bir terazi kullanarak vidalı kapak tüpünün içinde 10 mg polisakkarit tartın. Tozun daha kolay örneklenmesi ve daha doğru tartımı için statik bir ortadan kaldırıcı kullanın. Polisakkarit çözmek için tüpe 2 mL 0,15 M sodyum klorür (NaCl) ekleyin. Kapağı ve girdabı tüp.NOT: Sodyum klorür CDAP reaksiyonu etkilemez, ancak polisakkarit ikincil yapısını etkileyebilir. Bazı polisakkaritler farklı tuz konsantrasyonlarında daha çözünür. Polisakkarit moleküler ağırlığına bağlı olarak 12-24 saat boyunca uç-uç dönüşü ile tüpü karıştırın, böylece polisakkarit tam olarak nemlendirilemez. Gerekirse, çözünürlüğü teşvik etmek için tüpü hafifçe ısıtın. Tamponlu çözeltide çözünür polisakkarit içinNOT: Verimli CDAP aktivasyonu için, polisakkarit çözeltisi, özellikle fosfat iyonu olmak üzere herhangi bir tampon içermemelidir. Tamponu su veya tuzlu su çözeltisi ile değiştirmek ve polisakkarit konsantrasyonu 5 mg / mL’ye ayarlamak için aşağıdaki prosedürü izleyin. Uygun moleküler ağırlık kesme (MWCO) 4 mL veya 15 mL santrifüj dönüş filtre cihazı edinin.NOT: MWCO, polisakkaritin moleküler ağırlığından ideal olarak 5-10 kat daha küçüktür. Filtre kesici ucuna ~20 mg polisakkarit içeren tamponlanmış polisakkarit çözeltisinin bir hacmini ekleyin. Su veya tuzlu su çözeltisi ile tam işarete doldurun. Filtreyi sıkıca kapla. Birkaç kez uç-uç ile karıştırın. Filtre cihazını üretici tarafından önerilen santrifüj kuvvetine santrifüjleyin. Santrifüjleme süresinin her dönüşte en az 5 kat hacim azaltma elde edecek kadar uzun olduğundan emin olun. Akışa geç. Filtre cihazını yeniden bir araya edin. Filtre kesici ucu tam işarete tatlı su veya tuzlu su çözeltisi ile yeniden doldurun. Filtreyi sıkıca kapla. Filtredeki içeriği uç-uç dönüşü ~10 kez veya nazik girdap ile karıştırın; dönüşü tekrarlayın.NOT: Polisakkarit, santrifüj cihazının filtre kesici ucunun altında birikerek bir jel oluşturabilir. Filtre kesici ucunun içindeki retentant’ın bir sonraki dönüşten önce taze dolumla yeniden karıştırılması önerilir. Dolum ve spin döngüsünü en az 3 kez tekrarlayın. Polisakkarit retentantını filtre kesici uçtan kurtarmak için aşağıdaki egzersizi izleyin. Filtre ucuna tatlı su veya tuzlu su ekleyin, böylece hacim ~1 mL olacaktır. Yukarı ve aşağı pipetleme veya nazik girdap ile karıştırın. Tüm karışık retentantları 5 mL’lik bir tüpe aktarın. Filtre ucuna 1 mL tatlı su veya tuzlu su ekleyin. Filtreyi yukarı ve aşağı pipetleme veya nazik girdaplama ile durulayın. Tüm durulamaları geri kazanılan polisakkarit ile aktarın ve birleştirin. Polisakkarit konsantrasyonu belirleyin (bkz. bölüm 7.3’teki polisakkarit test). Polisakkarit ek su veya tuzlu su ile 5 mg / mL seyreltin. Polisakkarit çözeltisi hazırlandığında, polisakkarit çözeltisini içeren tüpü bir buz kovasında soğutun. 2. 0,5 M adipik asit dihidrazit (ADH) çözeltisi, 10 mL hazırlayın. Analitik bir dengede 0,87 g ADH ağırlığında ve 8 mL’de 0,1 M HEPES (4-(2-hidroksetil)-1-piperazineethanesulfonic asit), pH 8’de çözün. Bir pH metre ile izlenen 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ile hedef pH’a ayarlayın. Ek tampon ile 10 mL’ye getirin ve pH’ı yeniden onaylayın. 3. 2,5 M DMAP çözeltisi, 10 mL hazırlayın. NOT: DMAP toksiktir ve cilde nüfuz edecektir. İşlemi yaparken nitril eldiven giyin. 50 mL konik bir tüpe 3 g DMAP dikkatlice tartın. DMAP’ye 5 ml su ekleyin ve bulutlu bir çözelti (~ 7 mL) elde etmek için 5 dakika boyunca girdap yaparak karıştırın. Karıştırırken, DMAP çözeltisine 10 N hidroklorik asit (HCl) 50 μL artış ekleyin. Her ekleme arasında karıştırın. Çözüm netleştiğinde eklemeyi durdurun. DMAP çözümünü ~pH 8’e getirmek için 25 μL artışlarla 10 N NaOH ekleyin. 2,5 M’lik bir çözelti vermek için DMAP çözeltisini su ile 10 mL’ye getirin. 2,5 M DMAP çözümünün pH’ını hassas bir şekilde ayarlayın.NOT: DMAP çözelti pH konsantrasyon ve iyonik mukavemet ile değişir. Bu alıştırma, 2,5 M DMAP stoğuna belirli bir pH’a ince ayar yapmaktır, böylece 10 hacim polisakkarit ile karıştırıldığında, elde elde eden çözelti aktivasyon için hedef pH’a yakındır. Polisakkarit çözeltisini hazırlamak için hangisi kullanıldısa, 1 mL su veya NaCl çözeltisi içeren bir dizi 1,5 mL tüp hazırlayın. Tüpleri buzda soğutun. Soğutulmuş bir tüpe 100 μL DMAP ekleyin. Girdap ve bir pH metre ile pH ölçmek. Ardından, ölçülen tüpü atın. Ölçülen pH hedef değere yakın değilse, DMAP stoğunun pH’ını uygun şekilde 1 M NaOH veya HCl ile ayarlayın. Ölçülen pH hedef pH’a yakın olana kadar 3.5.2 ve 3.5.3 adımlarını yineleyin. 4. 100 mg/mL CDAP stok çözeltisi hazırlayın NOT: CDAP tozu sıkıca kapalı tutulmalı ve -20 °C’de saklanmalı ve açılmadan önce oda sıcaklığına gelmesine izin verilmelidir. İşlemi yaparken nitril eldiven giyin. Analitik bir dengede 1,5 mL snap-cap mikrosantrifüj tüpünü dara. Küçük bir spatula kullanarak, tüpe 10-140 mg CDAP ağırlığındadır. CDAP’nin gerçek ağırlığına dikkat edin. 100 mg/mL CDAP hazırlamak için gereken asetonitril hacmini belirleyin. Duman kapüşonlu asetonitrile açın. Uygun hacimli bir pipet kullanarak, boru ucundaki buharını aşındırmak için asetonitrili çizin ve serbest bırakın. Çözücünün birkaç saniye sonra pipet ucundan damlamasını bekleyin ve doğrudan CDAP tüpüne aktarmaya hazır olun. Hesaplanan asetonitril hacmini çizin ve doğrudan CDAP tüpüne aktarın. Kapağı kapat.NOT: Asetonitril, Bir Hamilton şırıngı veya uygun boyut eşdeğeri kullanılarak CDAP tüpüne de aktarılabilir. CDAP’yi tamamen yatıştırmak için girdap. CDAP tüpünü bir buz kovasına yerleştirin.NOT: CDAP soğukta asetonitrilde stabildir. Çözünür stoklar >1 hafta boyunca -20 °C’de tutulabilir. Ancak, taze CDAP çözümleri hazırlamak tercih edilir. 5. Polisakkarit aktivasyonu ve hidrazit fonksiyonelleştirme Aktivasyona başlamadan önce aşağıdaki öğelerin tümünün hazır olduğundan ve çözeltilerin buz üzerinde soğutulduğundan emin olun: manyetik bir karıştırıcının üzerine yerleştirilmiş, bir karıştırma çubuğu içeren düz tabanlı, geniş ağızlı bir kapta 5 mg / mL polisakkarit çözeltisinin 2 mL’si; 100 mg/mL CDAP stok çözümü; 2.5 M DMAP stok çözümü; üreticinin talimatlarına göre 0 °C için kalibre edilmiş 6 mm çapında prob gibi yarı mikro pH probuna sahip bir pH ölçer; kullanıma hazır 100 μL pipet; zamanlayıcı temizlendi ve kullanıma hazır; bir ototitrator dağıtıcı kafası yerleştirilmiş veya kullanıma hazır 10 μL pipet; 0,5 M ADH çözümü. DMAP kullanarak polisakkaritin pH’ını hedef pH’a önceden ayarlayın. pH probunu polisakkarit çözeltisine yerleştirin ve tüm aktivasyon prosedürü sırasında çözeltide bırakın. DMAP stok çözeltisinin 200 μL’lik kısmını karıştırma altında damla damla ilave ile polisakkarit çözeltisine aktarın. Çözümün pH’ını hedef aktivasyon pH’ına ayarlayın. pH’ı düşürmek için 0,1 M HCl ve pH’ı artırmak için 0,1 M NaOH ekleyin. Hedef pH’ı 0,1 pH’dan fazla aşmaktan kaçının ve aktivasyon süresince reaksiyonu buzlu su banyosunda soğutun. CDAP etkinleştirmesi Pipet ucundaki buharı aşındırmak için pipet 100 μL CDAP yukarı ve aşağı. 100 μL CDAP’yi karıştırma ile polisakkarit çözeltisine aktarın.NOT: Bu aktivasyon başlangıç oranı olarak 1 mg polisakkarit için 1 mg CDAP kullanır. Etkinleştirme en iyi duruma getirilirken oran artırılabilir veya azaltılabilir. Zamanlayıcıyı başlatın ve tüm etkinleştirme sırasında pH değişimini izleyin. Bir ototitratör dağıtıcısı (veya pipet) yardımıyla reaksiyona derhal 0,1 M NaOH 10 μL artış ekleyerek hedef pH’daki reaksiyonu koruyun.NOT: Bir pH probu ile hafifçe karıştırmak için pH tepki süresini azaltmaya yardımcı olabilir. pH başlangıçta daha hızlı düşer ve 0.1 M NaOH’yi daha sık eklemek gerekebilir. Reaksiyon ilerledikçe, pH düşüşü yavaşlar ve ekleme daha az sıklaşır. pH 9 aktivasyonu için 10-15 dakika olan en uygun aktivasyon süresine yaklaşırken pH esasen değişmeden kalmalıdır. ADH işlevselleştirme En uygun aktivasyon süresine ulaşıldığında, karıştırma altında aktif polisakkaride aynı anda 0,5 M ADH’nin 2 mL’lik kısmını ekleyin. pH’ın hedef aralıkta olup olmadığını kontrol edin (ADH için pH 8-9).NOT: Hızlı karıştırmalı bir ekleme, dihidrazitin her iki ucunun da aktif polisakkarit ile reaksiyona girme olasılığını en aza indirir ve polisakkarit çapraz bağlantısını önler. Reaksiyon karışımını en az 1 saat karıştırmaya devam edin. Reaksiyon karışımını 4 °C’ye aktarın, ancak 0-20 °C kabul edilebilir.NOT: ADH fonksiyonelleştirme reaksiyonu sıcaklığa güçlü bir şekilde bağlı değildir. Dihidrazit’in büyük fazlalığı söndürme reaktifi olarak işlev görür, aktif polisakkaritin daha fazla söndürülmesi gerekmez. Bununla birlikte, proteinleri doğrudan konjugat ederken, reaksiyon tipik olarak 1 M glisinin, pH 8-9 ile söndürülmelidir. 6. ADH fonksiyonelleştirilmiş polisakkaritin diyaliz ile saflaştırılması NOT: ADH fonksiyonelleştirme reaksiyonundan elde edilen ham ürün, kapsamlı diyaliz ile en verimli şekilde çıkarılabilen yüksek konsantrasyonda BIR ADH (0,5 M) içerir. Jel filtrasyonu, bir sütun veya spin tuzdan arındırma cihazı ile, özellikle artık ADH kirleticisini çıkarmak gerektiğinde o kadar verimli değildir. Diyaliz zarının MWCO’sını belirleyin. Daha küçük polisakkaritler için 3 kDa kesme kullanın.NOT: Diyaliz zarının MWCO’su, polisakkarit MW’sinden ideal olarak 5-10 kat daha küçüktür. İstediğiniz diyaliz formatını (kasetler veya borular) ve doğru cihaz kapasitesini seçin. Cihaz kapasitesinin örnek ses biriminden 2 kat daha büyük olduğundan emin olun. Cihazı kullanmak için üreticilerin talimatlarına bakın. Kullanmadan önce diyaliz zarını suya nemlendirin. Ham türetilmiş polisakkarit çözeltisini üreticilerin talimatlarına göre diyaliz cihazına aktarın.NOT: DMAP ile teması önlemek için nitril eldiven giyin. Dialyze, 2-4 L 1 M NaCl ve bir karıştırma çubuğu ile dolu bir kapta. Kabı soğuk bir odada veya buzdolabının içine bir karıştırma tabağına yerleştirin. Diyaliz sırasında kadranı hafifçe ve sürekli karıştırın. En az 4 saat diyalze ettikten sonra, taze 1 M NaCl’ye değiştirin ve en az 12 saat boyunca dialyze edin. Her biri en az 12 saat boyunca 0,15 M salin 2 değişikliğe karşı dialyze. İstenirse, 2 su değişikliğine karşı dialyze edin. Hızlı bir TNBS testi kullanarak gecelik kadranı test ederek tüm ADH’nin kaldırılıp kaldırıldığını doğrulayın. Sırasıyla 3 borosilikat tüp alın, negatif kontrol (ctrl), pozitif ctrl ve örnek olarak etiketlenin. Negatif ctrl tüpüne 0,1 M borat, pH 9’un 975 μL’sini ekleyin. Pozitif ctrl tüpüne 100 μL 0,05 mM ADH (0,1 mM hidrazit) ve 875 μL 0,1 M borat, pH 9 ekleyin. Numune tüpüne, gecelik kadranda 500 μL ve 0,1 M borat 475 μL, pH 9 ekleyin. Her üç tüpe de 25 μL% 1 TNBS ekleyin. İyice karıştırın. 1 saat boyunca karanlıkta yerleştirin. 3 tüpün renk yoğunluğunu 1 saat içinde karşılaştırın. Örnek tüp renk yoğunluğunun, ADH kirleticisinin 0,01 mM veya altına düştüğünü gösteren pozitif ctrl ile negatif ctrl arasında olduğundan emin olun. Dialyze bir kez daha.NOT: ADH hidrazürün saflaştırılmış hidrazür-polisakkaritteki toplam hidrazürün% 1’inden daha azını oluşturabilmesi için ADH kirletici seviyesini mümkün olduğunca azaltmak ihtiyatlıdır. Türetilmiş polisakkaritleri diyalizden kurtarın. Polisakkaritlerin ve hidrazitlerin konsantrasyonunu belirleyin. Hidrazür/polisakkarit oranını hesaplayın (bkz. bölüm 7). Diyalze polisakkarit 5-10 mg/mL’ye konsantre edilmesi gerekiyorsa, bölüm 1.2’ye bakın. 7. Hidrazit türevi polisakkaritlerin analizi NOT: Burada açıklanan analizin amacı, hidraskarit konsantrasyonunu, hidrazit konsantrasyonunu ve hidrazit/polisakkarit oranı açısından hidrazit derivazizasyon seviyesini belirlemektir. Numune hazırlamaNOT: Test edilecek polisakkaritlerin düşük moleküler ağırlıklı karbonhidrat, amin veya hidrazür safsızlıklarından arındırılması gerekir. Doğru ağırlık ölçümü sağlamak için liyofilize numuneler kuru ve tuzsuz olmalıdır. Genellikle, 1-2 mg/mL’lik bir çözeltinin ~1 mL’si tahliller için yeterlidir. Statik olmayan bir spatula veya statik bir ortadan kaldırıcı kullanarak analitik bir dengede en az 10 mg liyofilize polisakkarit örneği tartın. Polisakkaritleri su veya salin içinde bir konsantrasyonda (örneğin, 2 mg/mL) çözün, böylece test sinyalleri standart eğrinin doğrusal aralığına girer. Uç-uç karıştırın ve numunenin tamamen çözünmesi için yeterli zaman bırakın. Polisakkarit moleküler ağırlığına bağlı olarak gece hidrasyon gerçekleştirin. Polisakkarit tahlil: resorcinol/sülfürik asit yöntemiNOT: Polisakkaritler için uygun test, polimerlerin karbonhidrat bileşimine bağlı olacaktır. Orijinal resorsinol/sülfürik asit tahlili heksoz şekerleri için tasarlanmıştır.10. Test burada ısıtma adımının sıcaklığını 90 °C’den 140 °C’ye yükselterek değiştirildi. Bu yüksek sıcaklıkta, test bazı özgüllük kaybeder, ancak birçok şekeri test etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, tahlilin belirli bir polisakkarit için uygunluğunu belirlemek hala gereklidir. Her nokta için triplicates tavsiye edilir, ancak ısıtma bloğunun kapasitesi nedeniyle bazı konaklamalar gerekebilir. sülfürik asit hazırlayınNOT: Konsantre sülfürik asit son derece aşındırıcıdır ve ciddi yanıklara neden olabilir. Bu işlemi kimyasal duman kaputunda gerçekleştirin. Konsantre asidi her zaman suya dökün, tam tersideğil! 200 mL’lik bir cam şişeye 50 mL su ekleyin. Şişeyi soğuk bir su banyosuna yerleştirin. Yavaşça 150 mL sülfürik asit ekleyin. Şişeyi havalandırılana kadar kaplayın. Çözeltinin oda sıcaklığına eşdeğer olmasını izin verin. Çözeltiyi 3 ay içinde kullanın. Karbonhidrat standartlarını hazırlayın Değiştirilmemiş polisakkarit çözeltisini standart olarak kullanılmak üzere 1 mg/mL’de hazırlayın. Alternatif olarak, standart olarak, toplam şeker konsantrasyonunun 1 mg / mL’sinde, polisakkaritin tekrar ünitesinde bulunan oranda tek tek şekerlerin bir karışımını kullanın.NOT: Şeker karışımı genellikle aynı şeker bileşiminin karbonhidrat polimeri ile aynı sonucu verecek olsa da, bu deneysel olarak doğrulanmalıdır. 13 x 100 borosilikat test tüpleri için tüp tutuculu ısıtma bloğunun çalıştığından emin olun. Asit dökülmesi durumunda ısıtma bloğunun altında ve çevresinde koruyucu bir ped kullanın. Kullanılan tüm bloklar aracılığıyla istikrarlı, düzgün sıcaklık elde etmek için ısıtma bloğunu en az 1 saat boyunca 140 °C’ye önceden ısıtın. Etiket 13 x 100 borosilikat test tüpleri, her standart ve her örnek için üç taraflı. İlgili etiketli standart tüplere 1 mg/mL karbonhidrat standardının 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (veya μL) ekleyin. Hacmi 100 μL’ye getirmek için her tüpe su ekleyin.NOT: Üretilen renk belirli şekerlere bağlıdır. Bazı şekerler tam absorbans aralığını oluşturmak için daha fazla kütle gerektirdiğinden, standart eğri için kullanılan gerçek miktarlar değişebilir. Üç numune tüpüne ~5 μg türetilmiş polisakkarit içeren bir hacim ekleyerek numune tahlilleri ayarlayın ve toplam hacmi su ile 100 μL’ye getirin. Alternatif olarak, numunedeki polisakkarit konsantrasyonu bilinmiyorsa, bir dizi 4 kat seyreltme gerçekleştirin. Üç taraflı her seyreltmenin 100 μL’sini test edin. Kullanmadan hemen önce deiyonize (dI) suda 6 mg/mL’de taze resorcinol hazırlayın. Resorcinol çözüme gelene kadar girdap. Her tüpe 100 μL 6 mg/mL resorcinol ekleyin. Tahmini% 75 sülfürik asit miktarını dikkatlice küçük bir kabın içine dökün.NOT: Laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve güvenlik gözlüğü takın. Damlamalara, dökülmelere ve sıçramalara dikkat edin. Damlaları silmek için ıslak kağıt havluları elinizin altında tutun. Sülfürik asidin aktivitesi havaya uzun süre maruz kalmada değiştiğinden, tüm test için tekdüze bir sülfürik asit karışımı kullanın. Tekrar pipettör kullanarak, her tüpe 300 μL% 75 sülfürik asit ekleyin. Vortexs iyi karıştırmak için tüpleri kuvvetlice, girdap sırasında tüpü uzağa yönlendirin. Tüpleri sıralı olarak sabit bir hızda bir ısıtıcı bloğuna yerleştirin. Tüm tüpler girdikten sonra, zamanlayıcıyı hemen 3 dakika ayarlayın. 3 dakikada, tüpleri aynı sırayla sabit bir hızda çıkarın ve doğrudan buzlu su banyosundaki bir rafa yerleştirin. Tüpleri buz gibi olana kadar bırakın. Tüpleri çıkarın ve okuma sırasında cuvette yoğunlaşmayı önlemek için ~ 5 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmelerine izin verin. 10 mm’lik bir patlength cuvette kullanarak absorbansı 430 nm’de okumak için bir UV/VIS spektrofotometre ayarlayın. Sıfır standart tüple boş. 430 nm’deki tüm tüplerin emiciliğini okuyun.NOT: Tek kullanımlık plastik cuvettes kullanımı uygundur. A430’akarşı μg karbonhidrat standardı çizerek standart bir eğri oluşturun. Referans standart olarak glikoz kullanan tipik bir standart eğri için Şekil 4’e bakın. Standart eğrinin doğrusal aralığına düşenA 430 değerlerine sahip örnek test tüplerini kullanın, standart eğri denkleminden örnek tahlil tüplerindeki bilinmeyen polisakkarit miktarını hesaplayın. Bilinmeyen polisakkarit konsantrasyonu bilinmeyen eklenen hacminden, seyreltmeler için muhasebe belirlemek. Konsantrasyonu gerektiği gibi mg/mL veya μM tekrar ünitelerine dönüştürün. Trinitrobenzen sülfik asit (TNBS) kullanılarak hidrazid tahlilDI H 2 O’da 9 g NaCl ve 200 mg sodyum azid çözünerek%0,02 sodyum azit (Örnek tampon) içeren%0,9NaCl’yi 1 L’lik son hacme hazırlayın. 0,1 M sodyum borat, pH 9 (Test tamponu), 100 mL 0,5 M sodyum borat, pH 9, 400 mL dI H2O karıştırarak hazırlayı ±n. gerekirse ayarlayın. 200 μL%2,4,6-trinitrobenzen sülfikonik asit çözeltisini dI H 2 O ile 1 mL’ye seyrelterek %1TNBS hazırlayın. 50 mM ADH stoğu hazırlayın (100 mM hidrazide eşdeğer). Analitik bir denge kullanarak 871 mg adipik dihidrazür (ADH) tozu tartın. Üst yükleyici dengesi yardımıyla 100 mL’ye Numune tamponu ekleyerek tozu bir reaktif şişesinde çözün. Şişeyi 100 mM hidrazit/50 mM ADH olarak etiketleyin. Şişeyi sıkıca kaplayın ve 1 yıl boyunca 4 °C’de saklayın. Hidrazit standartlarını hazırlayın (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ve 0.6 mM hidrazit). 100 mM hidrazit stoğunu numune tamponu ile üst yükleyici dengesi yardımıyla seyrelterek 6 hidrazit standardını hazırlayın. Konsantrasyon hatasını en aza indirmek için her standardın 100 mL’sini hazırlayın. Şişeleri sıkıca kapatın ve 1 yıl boyunca 4 °C’de saklayın. Tahlil reaksiyonları ayarlamaNOT: TNBS tahlili 1 mL reaksiyon hacminde çalıştırılır. Her test tüpü 100 μL numune (veya standart), 875 μL Tahlil tamponu ve 25 μL% 1 TNBS çözeltiden oluşur. Tüm tahlil reaksiyonları (hem numuneler hem de standartlar için) üç taraflı olarak ayarlanır. Etiket 3 borosilikat cam tüpler (12 x 75 mm) sıfır standart dahil her standart için. Standart tüpleri artan konsantrasyon sırasına göre tüp rafında sıralayın ve düzenleyin. İlgili her tüpe standartlardan 100 μL’yi doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL veya 200 μL mikropipette kullanın. Sıfır standart için 100 μL Numune tamponu kullanın. Etiket 3 borosilikat cam tüpler (12 x 75 mm) her seyreltilmiş numune için test edilecek. Tüp rafındaki numune tüplerini sıralayın ve buna göre düzenleyin. İlgili her numune tüpüne numunenin 100 μL’lik kısmını doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL veya 200 μL mikropipette kullanın. Tüm test tüplerine doğru bir şekilde 875 μL Test tamponu eklemek için kalibre edilmiş 1000 μL mikropipette kullanın: standartlar ve numuneler. Test reaksiyonuna başlamak için, her test tüpüne% 1 TNBS’nin 25 μL’sini doğru bir şekilde eklemek için kalibre edilmiş 100 μL mikropipette kullanın. Sıfır standart tüplerden başlayın, artan konsantrasyon sırasına göre standart tüplere, daha sonra önceden belirlenen sıraya göre numune tüplerine geçin. Yeni bir standart veya yeni bir örnek başlatırken ipuçlarını değiştirin ve tüm tüplere TNBS eklemek için harcanan zamanı 5 dakika içinde tutun. Vortex tüm test tüpleri için 2 s yüksek hızda veya bir hız ayarında test tüpünün içindeki sıvının yukarı doğru dönerek tüp açıklığından 1/2 inç yüksekliğe ulaşmasını sağlar. Test başlangıç saatini kaydedin ve zamanlayıcıyı 2 saat olarak ayarlayın. Test tüpü rafını 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin. Zaman bittiğinde, tüm tüpleri bir kez daha girdapla ve veri toplamaya devam edin. Veri toplama UV/VIS spektrofotometrenin ısınmasını ve taban çizgisinin sabitlenmesine izin verin. Hidrazid tahlili için algılama dalga boyunu 500 nm olarak ayarlayın. Tüm test için tüm absorbans ölçümleri için 1 cm pathlength’lik 1 mL kuvars cuvette kullanın. Cuvette sıfır standart test aktararak veri toplamayı başlatın; cihazı boşlayın (emiciliği sıfıra ayarlayın). Her tüpte tek bir okuma gerçekleştirin ve absorbans değerlerini bir veri tablosuna kaydedin. Yeni bir örnek okumadan önce cuvette’den kalan sıvıyı çıkarın. Sıfır standarttan başlayın, artan konsantrasyon standartlarına ve ardından örneklere geçin. Başladıktan sonra, tüm adımları durmadan verimli bir şekilde gerçekleştirin ve tüm tüpleri 10 dakika içinde okuyun. Örnek verileri çözümleme MM hidrazide standard ve A500’içizerek standart bir eğri oluşturun. Standart eğri denklemini y = ax + b biçiminde bulun, burada y mM hidrazidini ve x A500’ü temsil eder. Tipik bir standart eğri için Şekil 4’e bakın. Seyreltme faktörlerine göre ayar yaparak standart eğri denklemini kullanarak numunelerdeki mM hidrazidini hesaplayın. Hesaplama için standart eğrinin doğrusal aralığına düşenA 500 değerlerine sahip örnek test tüplerini seçin. Denklemi kullanarak hidrazit/polisakkarit molar oranını hesaplayın (1).Hidrazit/polisakkarit = h / c × MW (1)Burada h mM hidrazit, c polisakkarit mg / mL konsantrasyonudur ve MW kDa’daki polisakkarit moleküler ağırlığıdır. Denklemi kullanarak 100 kDa polisakkarit başına hidrazit etiketleme yoğunluğunu hesaplayın (2).100 kDa polisakkarit başına etiketleme yoğunluğu = h / c × 100 (2)Burada h mM hidrazit, ve c polisakkarit mg / mL konsantrasyonudur.NOT: Kolaylık sağlamak için, polisakkaritlerin 100.000 dalton moleküler ağırlığa sahip olduğu düşünülebilir. Bu, çeşitli polisakkaritlerin türetme seviyesini karşılaştırırken bir “etiketleme yoğunluğunu” göz önünde bulundurmaya izin verir. Hidrazid etiketleme yoğunluğunu ağırlık yüzdesi ADH olarak hesaplayın. Denklem (3) kullanarak ADH’nin etkili mg/mL konsantrasyonunun belirlenmesi.mg/mL ADH = (mM hidrazit / 1000) × 174 (3)burada 174, ADH’nin MW’ıdır. Denklemi (4)kullanarak % ADH ağırlığını hesaplayın.ağırlık % ADH = (mg/mL ADH) / (mg/mL polisakkarit) × 100 (4)