הפעלה והטיאה של פוליסכרידים מסיסים באמצעות 1-Cyano-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP)

הערה: הכן מראש את פתרון הפוליסכריד, פתרון ADH, פתרון DMAP ופתרון מלאי CDAP לפני ביצוע הליכי ההפעלה והפונקציונליזציה של הפוליסכריד. מקם את הפתרונות והציוד במיקום מאורגן, נוח והגיוני. התגובה המתוארת היא עבור 10 מ”ג של פוליסכריד וניתן לשנות את קנה המידה למעלה או למטה. מומלץ להעריך את הפרוטוקול בקנה מידה קטן לפני שינוי קנה המידה. 1. הכן פתרון פוליסכריד 5 מ”ג/מ”ל, 2 מ”ל. עבור פוליסכריד ליופילי אפשר למיכל הפוליסכריד להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. לשקול 10 מ”ג של פוליסכריד בתוך צינור בורג-cap באמצעות איזון אנליטי. השתמש מבטל סטטי לדגימה קלה יותר ושקילה מדויקת יותר של האבקה. הוסף 2 מ”ל של 0.15 M נתרן כלורי (NaCl) לצינור כדי להמיס את הפוליסכריד. כובע ומערבולת הצינור.הערה: נתרן כלורי אינו משפיע על תגובת CDAP, אך הוא עשוי להשפיע על המבנה המשני של הפוליסכריד. כמה פוליסכרידים מסיסים יותר בריכוזים שונים של מלח. מערבבים את הצינור על ידי סיבוב סוף סוף במשך 12-24 שעות, בהתאם למשקל המולקולרי של הפוליסכריד, כדי לאפשר לפוליסכריד לחות מלאה. במידת הצורך, לחמם בעדינות את הצינור כדי לקדם solubilization. עבור פוליסכריד solubilized בפתרון חוצץהערה: להפעלת CDAP יעילה, פתרון הפוליסכריד לא אמור להכיל כל מאגר, במיוחד יון פוספט. בצע את ההליך שלהלן כדי להחליף את המאגר עם מים או תמיסת מלח ולהתאים את ריכוז פוליסכריד ל 5 מ”ג / מ”ל. השג מכשיר מסנן צנטריפוגלי 4 מ”ל או 15 מ”ל של ניתוק המשקל המולקולרי המתאים (MWCO).הערה: MWCO הוא אידיאלי 5-10 פעמים קטן יותר מאשר המשקל המולקולרי של פוליסכריד. הוסף אמצעי אחסון של פתרון פוליסכריד במאגר המכיל ~ 20 מ”ג של פוליסכריד להוספת המסנן. ממלאים לסימן המלא במים או בתמיסת מלח. מכסים את המסנן בחוזקה. מערבבים עד סוף-סוף כמה פעמים. צנטריפוגות התקן המסנן בכוח הצנטריפוגלי המוצע על ידי היצרן. ודא שזמן הצנטריפוגה ארוך מספיק כדי להשיג לפחות פי 5 הפחתת נפח לאחר כל סיבוב. זרוק את הזרימה דרך. הרכב מחדש את התקן המסנן. מלאו מחדש את המסנן לסימן המלא במים מתוקים או בתמיסת מלח. מכסים את המסנן בחוזקה. ערבבו את התוכן במסנן לפי סיבוב מקצה לקצה ~10 פעמים או על ידי מערבולת עדינה; חזור על הספין.הערה: פוליסכריד יכול להצטבר בתחתית הכנס המסנן של המכשיר הצנטריפוגלי, ויוצר ג’ל. מומלץ לערבב מחדש את retentant בתוך המסנן להוסיף עם מילוי טרי לפני הסיבוב הבא. חזור על מילוי וסיבוב מחזור מינימום של 3 פעמים. בצע את התרגיל שלהלן כדי לשחזר את retentant פוליסכריד מהוספת המסנן. הוסף מים מתוקים או מלוחים להוספת המסנן כך שהנפח הוא ~ 1 מ”ל. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה או על ידי מערבולת עדינה. מעבירים את כל המתרס המעורב לצינור 5 מ”ל. יש להוסיף 1 מ”ל של מים מתוקים או תמיסת מלח. יש לשטוף את המסנן על ידי צנרת מעלה ומטה או על ידי מערבולת עדינה. מעבירים ומשלבים את כל השטיפות עם הפוליסכריד שנמצא. קבע את ריכוז הפוליסכריד (ראה בדיקת פוליסכריד בסעיף 7.3). לדלל את הפוליסכריד עם מים נוספים או מלוחים ל 5 מ”ג / מ”ל. כאשר פתרון פוליסכריד מוכן, לצנן את הצינור המכיל את פתרון פוליסכריד בדלי קרח. 2. הכן 0.5 M חומצה אדיפית דיהידרזיד (ADH) פתרון, 10 מ”ל. שקול 0.87 גרם ADH באיזון אנליטי, ו solubilize ב 8 מ”ל של 0.1 M HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה), pH 8. התאימו ל-pH היעד עם 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH), המנוטר על ידי מד pH. הביאו ל-10 מ”ל עם חוצץ נוסף ואשרו מחדש את ה-pH. 3. הכן פתרון DMAP 2.5 M, 10 מ”ל. הערה: DMAP רעיל ויחדר לעור. ללבוש כפפות ניטריל בעת ביצוע ההליך. בזהירות לשקול 3 גרם של DMAP לתוך צינור חרוט 50 מ”ל. מוסיפים 5 מ”ל מים ל- DMAP ומערבבים על ידי מערבולת במשך 5 דקות כדי להשיג פתרון מעונן (~ 7 מ”ל). תוך כדי ערבוב, להוסיף 50 תוספת של 50 μL של 10 N חומצה הידרוכלורית (HCl) לפתרון DMAP. מערבבים בין כל תוספת. הפסק להוסיף כאשר הפתרון מתבהר. הוסף 10 N NaOH במרווחים של 25 μL כדי להביא את פתרון DMAP ל- ~ pH 8. הביאו את פתרון DMAP ל-10 מ”ל עם מים כדי לתת פתרון של 2.5 M. כוונן את רמת ה-pH של פתרון DMAP של 2.5 M.הערה: פתרון DMAP pH משתנה עם ריכוז וכוח יוני. תרגיל זה הוא לכוונן את מלאי 2.5 M DMAP ל- pH מסוים, כך שכאשר הוא מעורבב עם 10 כרכים של פוליסכריד, הפתרון המתקבל קרוב ל- pH היעד להפעלה. הכן סדרה של צינורות 1.5 מ”ל המכילים 1 מ”ל של מים או פתרון NaCl, המוקדם מכונן להכנת פתרון פוליסכריד. תרגיע את הצינורות על קרח. הוסף 100 μL של DMAP לצינור צונן. מערבולת ולמדוד את ה- pH עם מד pH. לאחר מכן, להשליך את הצינור הנמדד. אם ה- pH הנמדד אינו קרוב לערך היעד, התאם את ה- pH של מניית DMAP עם 1 M NaOH או HCl בהתאם לצורך. חזור על שלבים 3.5.2 ו- 3.5.3 עד שה- pH הנמדד קרוב ל- pH היעד. 4. הכן 100 מ”ג / מ”ל פתרון מלאי CDAP הערה: אבקת CDAP צריך להישמר סגור היטב ומאוחסן ב -20 °C (70 °F) מותר להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. ללבוש כפפות ניטריל בעת ביצוע ההליך. Tare a 1.5 מ”ל צינור microcentrifuge snap-cap על איזון אנליטי. באמצעות מרית קטנה, לשקול 10-140 מ”ג של CDAP לתוך הצינור. שים לב למשקל בפועל של CDAP. לקבוע את עוצמת הקול של acetonitrile הדרוש כדי להכין 100 CDAP mg/mL. פתח את האצטוניטריליה במכסה המנוע של האדים. באמצעות צינור נפח מתאים, לצייר ולשחרר את acetonitrile כדי שיווי משקל האדים שלה בקצה הצינור. המתן עד שהממס יטפטף מהקצה לאחר מספר שניות, והינו מוכנים להעביר אותו ישירות לצינור ה- CDAP. צייר את אמצעי האחסון המחושב של acetonitrile והעבר אותו ישירות לצינור CDAP. תסגור את המכסה.הערה: Acetonitrile ניתן גם להעביר לצינור CDAP באמצעות מזרק המילטון או שווה ערך לגודל מתאים. מערבולת כדי להפוך את CDAP באופן מלא. הנח את צינור ה- CDAP בדלי קרח.הערה: CDAP יציב באצטוניטריל בקור. מניות מסיסות עשויות להישמר ב -20 °C (50 °F) למשך שבוע > אחד. עם זאת, עדיף להכין פתרונות CDAP טריים. 5. הפעלת פוליסכריד ופונקציונליזציה של הידראזיד ודא שכל הפריטים הבאים מוכנים ופתרונות מצוננים על קרח לפני תחילת ההפעלה: 2 מ”ל של פתרון פוליסכריד 5 מ”ג / מ”ל במיכל שטוח תחתון, רחב פה המכיל מוט ערבוב, מונח על גבי stirrer מגנטי; 100 מ”ג / mL פתרון מלאי CDAP; 2.5 M פתרון מניות DMAP; מד pH עם בדיקה pH חצי מיקרו, כגון בדיקה בקוטר 6 מ”מ, מכויל עבור 0 °C על פי הוראות היצרן; צינור 100 μL מוכן לשימוש; שעון שעון הים מנוקה ומוכן לשימוש; ראש מתקן אוטומטי ממוקם או 10 μL pipet מוכן לשימוש; פתרון 0.5 M ADH. כוונן מראש את רמת ה-pH של הפוליסכריד ל-pH היעד באמצעות DMAP. מניחים את בדיקת ה- pH לתוך פתרון הפוליסכריד ומשאירים אותו בפתרון במהלך כל הליך ההפעלה. העבר 200 μL של פתרון מלאי DMAP לפתרון פוליסכריד על ידי תוספת dropwise תחת ערבוב. התאם את ה- pH של הפתרון ל- pH של הפעלת היעד. הוסף 0.1 M HCl כדי להוריד את ה- pH ו- 0.1 M NaOH כדי להגדיל את ה- pH. הימנעו מחריגה מה-pH של היעד ביותר מיחידת pH של 0.1, ושמרתם על התגובה מקוררת באמבט מי קרח למשך ההפעלה. הפעלת CDAP Pipet 100 μL CDAP למעלה ולמטה כדי לשוות את האדים בקצה הצינור. העבר 100 μL של CDAP לפתרון פוליסכריד עם ערבוב.הערה: הפעלה זו משתמשת 1 מ”ג של CDAP עבור 1 מ”ג של פוליסכריד כיחס התחלה. ניתן להגדיל או להקטין את היחס בעת מיטוב ההפעלה. הפעל את שעון השעון והצג את שינוי ה- pH במהלך ההפעלה כולה. שמור על התגובה ב- pH היעד על ידי הוספת מיידית 10 רווחי μL של 0.1 M NaOH לתגובה, בעזרת מתקן autotitrator (או pipet).הערה: זה עשוי לעזור להפחית את זמן התגובה pH לערבב עם בדיקת pH בעדינות. ה- pH יורד מהר יותר בהתחלה, וייתכן שיהיה צורך להוסיף את 0.1 M NaOH בתדירות גבוהה יותר. ככל שהתגובה מתקדמת, הירידה ב- pH הופכת איטית יותר, והתוספת הופכת פחות תכופה. ה- pH צריך להישאר כמעט ללא שינוי כאשר מתקרבים לזמן ההפעלה האופטימלי, שהוא 10-15 דקות להפעלת pH 9. פונקציונליזציה של ADH כאשר זמן ההפעלה האופטימלי מגיע, להוסיף 2 מ”ל של 0.5 M ADH בבת אחת לפוליסכריד מופעל תחת ערבוב. בדוק כי ה- pH נמצא בטווח היעד (pH 8-9 עבור ADH).הערה: תוספת אחת עם ערבוב מהיר ממזערת את ההסתברות ששני קצות הדיהידרזיד יגיבו עם הפוליסכריד הפעיל, ומונעת קישור פוליסכריד. ממשיכים לערבב את תערובת התגובה לפחות 1 שעה. מעבירים את תערובת התגובה ל 4 °C (75 °F), אבל 0-20 °C מקובל.הערה: תגובת הפונקציונליזציה של ADH אינה תלויה מאוד בטמפרטורה. כמו עודף גדול של דיהידרזיד פועל כמו ריאגנט מרווה, אין צורך להרוות עוד יותר את פוליסכריד מופעל. עם זאת, כאשר ישירות הצמדת חלבונים, התגובה צריכה להיות מרווה, בדרך כלל עם 1 M גליצין, pH 8-9. 6. טיהור פוליסכריד בפונקציונליות ADH על ידי דיאליזה הערה: המוצר הגולמי מתגובת הפונקציונליזציה של ADH מכיל ריכוז גבוה של ADH (0.5 M), אשר ניתן להסיר ביעילות רבה ביותר על ידי דיאליזה נרחבת. סינון ג’ל, עם עמודה או התקן התפלת ספין, אינו יעיל באותה מידה, במיוחד כאשר הוא נדרש להסיר את שאריות מזהם ADH. לקבוע את MWCO של קרום הדיאליזה. השתמש בחיתוך של 3 kDa עבור פוליסכרידים קטנים יותר.הערה: MWCO של קרום הדיאליזה הוא אידיאלי 5-10 פעמים קטן יותר מאשר MW של פוליסכריד. בחר את תבנית הדיאליזה הרצויה (קלטות או צינורות) ואת קיבולת ההתקן הנכונה. ודא שקיבולת ההתקן גדולה פי 2 מאמצעי האחסון לדוגמה. עיין בהוראות היצרנים לשימוש במכשיר. יש להרטיב את קרום הדיאליזה במים לפני השימוש. העבר את פתרון הפוליסכריד הגולמי שמקורו בהתקן הדיאליזה בהתאם להוראות היצרנים.הערה: ללבוש כפפות ניטריל כדי למנוע מגע עם DMAP. דיאליזה במיכל מלא 2-4 L של 1 M NaCl ובר ערבוב. מניחים את המיכל על צלחת ערבוב בחדר קר או בתוך מקרר. מערבבים את הדיאליזה בעדינות ובהתמדה במהלך הדיאליזה. לאחר חיוג למשך 4 שעות לפחות, החלף ל- 1 M NaCl טרי וחיוג למשך 12 שעות לפחות. דיאליזה נגד 2 שינויים של תמיסת מלח 0.15 M, כל אחד לפחות 12 שעות. אם תרצה, חייגו נגד 2 שינויים במים. ודא אם כל ה- ADH מוסר על-ידי בדיקת הדיאליזה הלילית באמצעות בדיקת TNBS מהירה. להשיג 3 צינורות borosilicate, לתייג אותם כמו שליטה שלילית (ctrl), ctrl חיובי, ודוגמה, בהתאמה. לצינור ctrl השלילי, להוסיף 975 μL של 0.1 M borate, pH 9. לצינור ctrl החיובי, להוסיף 100 μL של 0.05 mM ADH (0.1 mM הידרזיד) ו 875 μL של 0.1 M borate, pH 9. לצינור לדוגמה, להוסיף 500 μL של דיאליזה לילה ו 475 μL של 0.1 M borate, pH 9. הוסף 25 μL של 1% TNBS לכל שלושת הצינורות. מערבבים היטב. מניחים בחושך במשך שעה. השווה את עוצמת הצבע של 3 הצינורות בשעה אחת. ודא שעוצמת צבע צינור המדגם היא בין זו של ctrl החיובי לבין ctrl השלילי, המציין כי מזהם ADH הוא למטה ל 0.01 mM ומטה. חייג עוד פעם אחת.הערה: זה נבון כדי להפחית את רמת מזהם ADH ככל האפשר, כך הידרזיד ADH מהווה פחות מ 1% של הידראזיד הכולל הידרזיד הידרזיד מטוהר הידרזיד-פוליסכריד. לשחזר את הפוליסכריד נגזר דיאליזה. לקבוע את הריכוז של פוליסכרידים הידרזיד. חשב את יחס הידרזיד/פוליסכריד (ראה סעיף 7). אם יש לרכז את הפוליסכריד המחויג ל-5-10 מ”ג/מ”ל, יש להתייעץ עם סעיף 1.2. 7. ניתוח של פוליסכרידים שמקורם בהידראזיד הערה: מטרת הניתוח המתואר כאן היא לקבוע את ריכוז הפוליסכריד, ריכוז ההידרזיד, ואת רמת נגזרת הידראזיד במונחים של יחס הידרזיד / פוליסכריד. הכנת דוגמההערה: פוליסכרידים שיש להיבחן צריכים להיות נקיים מפחמימות במשקל מולקולרי נמוך, אמין או זיהומים בהידראזיד. דגימות ליופיליות צריכות להיות יבשות וללא מלח כדי להבטיח מדידת משקל מדויקת. בדרך כלל, ~ 1 מ”ל של פתרון 1-2 מ”ג / מ”ל מתאים לבדיקות. שקול לפחות 10 מ”ג של מדגם פוליסכריד ליופילי על איזון אנליטי, באמצעות מרית לא סטטית או מחסל סטטי. ממיסים את הפוליסכריד במים או מלוחים לריכוז (למשל, 2 מ”ג/מ”ל) כך שאותות ה-assay נופלים בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית. מערבבים מקצה לקצה ומאפשרים מספיק זמן כדי שהדגימה תתמוסס לחלוטין. בצע הידרציה לילה בהתאם למשקל המולקולרי של פוליסכריד. בדיקת פוליסכריד: שיטת רסורצינול/חומצה גופרתיתהערה: בדיקת ה- assay המתאימה לפוליסכרידים תהיה תלויה בהרכב הפחמימות של הפולימרים. בדיקת resorcinol/חומצה גופרתית המקורית נועדה לסוכרים משוקסים10. ההסתה שונתה כאן על ידי העלאת הטמפרטורה של שלב החימום מ 90 °C (50 °F) ל 140 °C (50 °F). בטמפרטורה גבוהה יותר זו, ההסתה מאבדת קצת ספציפיות אבל יכול לשמש כדי assay סוכרים רבים. עם זאת, עדיין יש צורך לקבוע את ההתאמה של בדיקת פוליסכריד מסוים. טריפליקאטים מומלצים לכל נקודה, אך ייתכן שיהיה צורך באירוח מסוים בשל הקיבולת של בלוק החימום.הכן 75% חומצה גופרתיתהערה: חומצה גופרתית מרוכזת היא מאכלת מאוד ויכולה לגרום לכוויות קשות. בצע הליך זה במכסה אדים כימי. תמיד לשפוך חומצה מרוכזת לתוך מים, לא להיפך! הוסף 50 מ”ל של מים לבקבוק זכוכית 200 מ”ל. מניחים את הבקבוק באמבט מים קרים. לאט לאט להוסיף 150 מ”ל של חומצה גופרתית. מכסים את הבקבוק כך שהוא מאוורר. אפשר לפתרון להתכווות לטמפרטורת החדר. השתמש בפתרון תוך 3 חודשים. הכנת תקני פחמימות הכן את פתרון פוליסכריד שלא שנופץ ב 1 מ”ג / מ”ל כדי לשמש כסטנדרט. לחלופין, השתמש בתערובת של סוכרים בודדים ביחס שנמצא ביחידה החוזרת של הפוליסכריד, ב 1 מ”ג / מ”ל של ריכוז הסוכר הכולל, כסטנדרט.הערה: למרות תערובת הסוכר בדרך כלל ייתן את אותה תוצאה כמו פולימר פחמימות של הרכב סוכר זהה, זה צריך להיות מאושר באופן ניסיוני. ודא כי בלוק החימום עם מחזיקי צינור עבור 13 x 100 מביצות בורוסיליקט מתפקד. השתמש כרית מגן מתחת וסביב בלוק החימום במקרה של שפיכות חומצה. מחממים מראש את בלוק החימום ל 140 °C (70 °F) למשך שעה לפחות כדי להשיג טמפרטורה יציבה ואחידה דרך כל הבלוקים מנוצלים. תווית 13 x 100 מביצות בורוסיליקט, משולש עבור כל תקן וכל מדגם. הוסף 0, 2.5, 5, 7.5, 10 מיקרוגרם (או μL) של תקן פחמימות 1 mg / mL לצינורות הסטנדרטיים המסומנים בהתאמה. הוסף מים לכל צינור כדי להביא את הנפח ל 100 μL.הערה: הצבע שנוצר תלוי בסוכרים ספציפיים. כמו סוכרים מסוימים דורשים מסה רבה יותר כדי ליצור את טווח הספיגה המלא, הכמויות בפועל המשמשות עבור העקומה הסטנדרטית עשויות להשתנות. הגדר בדיקות מדגם על ידי הוספת נפח המכיל ~ 5 מיקרוגרם של פוליסכריד נגזר לשלושה צינורות מדגם ולהביא את הנפח הכולל ל 100 μL עם מים. לחלופין, אם ריכוז הפוליסכריד במדגם אינו ידוע, בצע סדרה של דילול פי 4. מבחן 100 μL של כל דילול משולש. הכן resorcinol טרי ב 6 מ”ג / מ”ל במים deionized (dI) מיד לפני השימוש. מערבולת עד ביטול העורקים הוא בפתרון. הוסף 100 μL של 6 מ”ג / מ”ל resorcinol לכל צינור. יוצקים בזהירות את הכמות המשוערת של 75% חומצה גופרתית לתוך קטנה.הערה: לבש חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות. היזהר מטפטפות, שפיכות והתזות. שמור מגבות נייר רטובות בהישג יד כדי לנגב את כל טפטופים. כאשר הפעילות של החומצה הגופרתית משתנה על חשיפה ממושכת לאוויר, השתמש בתערובת אחידה של חומצה גופרתית לכל ההסתה. באמצעות pipettor חוזר, באופן אחיד להוסיף 300 μL של 75% חומצה גופרתית לכל צינור. מערבולת הצינורות במרץ לערבב היטב, מכוון את הצינור משם תוך מערבולת. מניחים את הצינורות בבלוק תנור בקצב קבוע בסדר רציף. ברגע שכל הצינורות נמצאים, להגדיר את טיימר במשך 3 דקות מיד. בשעה 3 דקות, להסיר את הצינורות בקצב קבוע באותו סדר, ולהניח אותם ישירות על מתלה באמבט מי קרח. השאירו את הצינורות עד שהם קרים כקרח. הסר את הצינורות ולאפשר להם שיווי משקל לטמפרטורת החדר במשך ~ 5 דקות כדי למנוע עיבוי על cuvette במהלך הקריאה. הגדר ספקטרופוטומטר UV /VIS כדי לקרוא את הספיגה ב 430 ננומטר באמצעות cuvette אורך 10 מ”מ. ריק עם צינור סטנדרטי אפס. קרא את הספיגה של כל הצינורות ב 430 ננומטר.הערה: cuvettes פלסטיק חד פעמי נוח לשימוש. לבנות עקומה סטנדרטית על ידי התוויית מיקרוגרם של תקן פחמימות לעומתA 430. ראו איור 4 לעקומה סטנדרטית טיפוסית המשתמשת בגלוקוז כסטנדרט הייחוס. השתמש בצינורות בדיקת הדגימה עם ערכי A430 הנופלים בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית, חשב את כמות ה- μg של הפוליסכריד הלא ידוע בצינורות בדיקת הדגימה משוואת העקומה הסטנדרטית. לקבוע את הריכוז של פוליסכריד לא ידוע מן הנפח של הלא נודע הוסיף, חשבונאות דילול. להמיר את הריכוז mg / mL או יחידות חוזרות μM כנדרש. הידרזיד אסייד באמצעות חומצה גופרתית טריניטרבנזן (TNBS)הכן 0.9% NaCl המכיל 0.02% נתרן אזיד (חוצץ מדגם) על ידי המסת 9 גרם של NaCl ו 200 מ”ג של נתרן אזיד ב dI H2O לנפח סופי של 1 L. הכן 0.1 M נתרן בוראט, pH 9 (חוצץ אסאי), על ידי ערבוב 100 מ”ל של 0.5 M נתרן בוראט, pH 9, עם 400 מ”ל של dI H2O. לאשר כי pH הפתרון הוא 9 ± 0.1; להתאים במידת הצורך. הכן 1% TNBS על ידי דילול 200 μL של 5% 2,4,6-טריניטרבנזן פתרון חומצה גופרתית ל 1 מ”ל עם dI H2O. לסמן את הצינור כמו 1% TNBS ולאחסן ב 4 °C (5 °F) בחושך במשך שבוע. הכן מלאי ADH 50 mM (שווה ערך ל 100 mM הידראזיד). שקול 871 מ”ג של אבקת דיהיראזיד אדיפיק (ADH) באמצעות איזון אנליטי. ממיסים את האבקה בבקבוק ריאגנט על ידי הוספת חוצץ מדגם ל-100 מ”ל בעזרת איזון מטעין עליון. סמן את הבקבוק כ- 100 mM הידרזיד / 50 mM ADH. מכסים את הבקבוק בחוזקה ומאחסנים ב 4 °C (75 °F) במשך שנה אחת. הכן תקני הידראזיד (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ו-0.6 מ”מ הידראזיד). הכן את 6 תקני הידראזיד על ידי דילול מלאי הידרזיד 100 mM עם חוצץ מדגם בעזרת איזון מטעין העליון. הכן 100 מ”ל מכל תקן כדי למזער את שגיאת הריכוז. סגור בחוזקה את הבקבוקים ולאחסן ב 4 °C (5 °F) במשך שנה אחת. הגדרת תגובות ת’א-סאזהערה: TNBS assay מופעל בנפח תגובה של 1 מ”ל. כל צינור בדיקת מורכב 100 μL של מדגם (או סטנדרטי), 875 μL של חוצץ Assay, ו 25 μL של פתרון 1% TNBS. כל תגובות ההסתה (הן עבור דגימות והן עבור סטנדרטים) מוגדרות משולשות. תווית 3 צינורות זכוכית בורוסיליקט (12 x 75 מ”מ) עבור כל תקן, כולל תקן אפס. מיין וסדר את הצינורות הסטנדרטיים בארון צינור על מנת להגדיל את הריכוז. השתמש במיקרופיט 100 μL או 200 μL מכויל כדי להוסיף במדויק 100 μL של התקנים לכל צינור מתאים. עבור תקן האפס, השתמש ב- 100 μL של מאגר לדוגמה. תווית 3 צינורות זכוכית בורוסיליקט (12 x 75 מ”מ) עבור כל מדגם מדולל להיבחנות. מיין וסדר את צינורות הדגימה בארון הצינורות בהתאם. השתמש 100 μL מכויל או 200 מיקרופיט μL כדי להוסיף במדויק 100 μL של המדגם לכל צינור מדגם מתאים. השתמש במיקרופיט 1000 μL מכויל כדי להוסיף במדויק 875 μL של חוצץ Assay לכל צינורות ה- assay: הסטנדרטים והדגימות. כדי להתחיל את תגובת ה- assay, השתמש במיקרופיט 100 μL מכויל כדי להוסיף במדויק 25 μL של 1% TNBS לכל צינור בדיקות. התחל מאפס צינורות סטנדרטיים, לעבור צינורות סטנדרטיים על מנת להגדיל את הריכוז, ולאחר מכן צינורות מדגם על פי הסדר שנקבע מראש. שנה טיפים בעת הפעלת תקן חדש או מדגם חדש ולשמור את הזמן בילה בהוספת TNBS לכל הצינורות בתוך 5 דקות. מערבולת כל צינורות assay עבור 2 s במהירות גבוהה או בהגדרת מהירות המאפשרת לנוזל בתוך צינור assay להסתובב כלפי מעלה כדי להגיע לגובה של 1/2 אינץ ‘מפתיחת הצינור. הקלט את שעת ההתחלה של ההסרה והגדר את הטיימר ל- 2 שעות. מניחים את מתלה צינור ה- assay בחושך בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. בסיום הזמן, מערבולת כל הצינורות עוד פעם אחת ולהמשיך לאיסוף נתונים. איסוף נתונים תן לספקטרופוטומטר UV/VIS להתחמם וקו הבסיס יתייצב. הגדר את אורך הגל גילוי ב 500 ננומטר לבדיקת הידראזיד. השתמש בקובט קוורץ 1 מ”ל של אורך אורך פתיל של 1 ס”מ לכל מדידות הספיגה לכל ההגשה. התחל את איסוף הנתונים על ידי העברת מבחן סטנדרטי אפס לקובט; ריק את המכשיר (הגדר ספיגה לאפס). בצע קריאה בודדת בכל שפופרת ורשום את ערכי הספיגה בטבלת נתונים. הסר כל נוזל שיורית מן cuvette לפני קריאת מדגם חדש. התחל מסטנדרטים אפס, לעבור לסטנדרטים של הגדלת הריכוז, ולאחר מכן אל הדגימות. לאחר תחילת, לבצע את כל השלבים ביעילות מבלי לעצור ולקרוא את כל הצינורות בתוך 10 דקות. ניתוח נתונים לדוגמה צור עקומה סטנדרטית על ידי התוויית תקן הידראזיד mM לעומתA 500. מצא את משוואת העקומה הסטנדרטית בצורה של y =x + b, כאשר y מייצג את הידרזיד mM ו- x מייצג A500. ראו איור 4 לעקומה סטנדרטית טיפוסית. חשב הידרזיד mM בדגימות באמצעות משוואת העקומה הסטנדרטית, התאמה לגורמי הדילול. בחר רק את צינורות ה- assay לדוגמה עם ערכי A500 הנופלים בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית לחישוב. חשב את יחס הטוחנת של הידרזיד/פוליסכריד באמצעות משוואה (1).הידרזיד/פוליסכריד = h / c × MW (1)כאשר h הוא הידרזיד mM, c הוא ריכוז mg / mL של פוליסכריד, ו MW הוא המשקל המולקולרי פוליסכריד ב kDa. חשב את צפיפות תיוג הידראזיד לכל 100 kDa של פוליסכריד באמצעות משוואה (2).צפיפות תיוג לכל 100 kDa פוליסכריד = h / c × 100 (2)איפה h הוא הידראזיד mM, ו c הוא ריכוז mg / mL של פוליסכריד.הערה: לנוחות, הפוליסכרידים יכולים להיחשב כמשקל מולקולרי של 100,000 דלטון. זה מאפשר לשקול “צפיפות תיוג” בהשוואת רמת ההפקה של פוליסכרידים שונים. חשב את צפיפות תיוג הידראזיד כאחוז משקל ADH. לקבוע את הריכוז mg/mL יעיל של ADH באמצעות משוואה (3).מ”ג/מ”ל ADH = (הידרזיד mM / 1000) × 174 (3)איפה 174 הוא MW של ADH. חשב את המשקל % ADH באמצעות משוואה (4).משקל % ADH = (מ”ג / מ”ל ADH) / (מ”ג / מ”ל פוליסכריד) × 100 (4)