Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.
Abstract
Organoides renais gerados a partir de hPSCs forneceram uma fonte ilimitada de tecido renal. Os organoides renais humanos são uma ferramenta inestimável para estudar doenças e lesões renais, desenvolver terapias baseadas em células e testar novas terapêuticas. Para tais aplicações, um grande número de organoides uniformes e ensaios altamente reprodutíveis são necessários. Nós construímos nosso protocolo organoide renal publicado anteriormente para melhorar a saúde geral dos organoides. Este protocolo 3D simples e robusto envolve a formação de corpos embrióides uniformes em meio de componente mínimo contendo lipídios, suplemento de insulina-transferrina-selênio-etanolamina e álcool polivinyl com inibidor GSK3 (CHIR99021) por 3 dias, seguido pela cultura em meio contendo soro de reposição de soro de knock-out (KOSR). Além disso, ensaios agitados permitem a redução da aglomeração dos corpos embrionários e a manutenção de um tamanho uniforme, importante para reduzir a variabilidade entre organoides. No geral, o protocolo fornece um método rápido, eficiente e econômico para gerar grandes quantidades de organoides renais.
Introduction
Nos últimos anos, uma série de protocolos para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em organoides renais foram desenvolvidos 1,2,3,4,5. Os organoides renais forneceram uma importante ferramenta para auxiliar a pesquisa em novas abordagens de medicina regenerativa, doenças relacionadas ao rim, realizar estudos de toxicidade e desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. Apesar de sua ampla aplicabilidade, os organoides renais têm limitações como falta de maturação, capacidade de cultura limitada a longo prazo in vitro e uma escassez de vários tipos de células encontrados no rim humano 6,7,8. Trabalhos recentes têm focado na melhoria do nível de maturação organoide, ampliando os períodos culturais e ampliando a complexidade das populações de células renais, modificando os protocolos existentes 9,10,11,12. Nesta atual iteração do nosso protocolo estabelecido 5,13, modificamos os componentes médios na primeira etapa do protocolo para uma base sem soro complementada com insulina-transferrina-selênio-etanolamina (ITSE), lipídios, álcool polivinyl (E5-ILP) e CHIR99021 (Figura 1). Essas mudanças fornecem um meio de baixa proteína totalmente definido, sem soro, com menos componentes do que a nossa composição média anterior 5,13 e sem fatores adicionais de crescimento. Como resultado, o meio da primeira etapa é menos trabalhoso para preparar do que a nossa versão anteriormente publicada, e pode reduzir a variabilidade em lote paralote 5. Estudos anteriores mostraram que tanto a insulina quanto a transferrina são importantes na cultura livre de soro14,15, no entanto, altos níveis de insulina podem ser inibidores para a diferenciação de mesoderm16. Mantivemos os baixos níveis de insulina conforme previsto no protocolo original, e reduzimos ainda mais os níveis de KOSR (contendo insulina) no segundo estágio do ensaio. De acordo com outros protocolos para formação organoide renal, níveis mais baixos de KOSR são benéficos para manter um equilíbrio entre a proliferação e a diferenciação do tecido renal17. Além disso, reduzimos a concentração de glicose em nosso estágio II médio13.
Nosso método descreve uma configuração para ensaio de suspensão de organoides renais, produzindo até ~1.000 organoides de uma placa de cultura hPSC 100 mm confluente inicial de ~60% conforme descrito na publicação original 5,13. Este protocolo pode ser facilmente dimensionado até começar com várias placas de 100 mm ou 150 mm para aumentar ainda mais o número de organoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos anteriores mostraram que as etapas iniciais do protocolo são fundamentais para a diferenciação intermediária do mesoderm 5,19,20 e, portanto, é essencial implementar uma rigorosa composição média nesta fase. Remover componentes indefinidos como soro, albumina, híbridomoico livre de proteínas II do primeiro estágio do protocolo pode ajudar a melhorar a eficiência de diferenciação consistente entre os ensaios…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelos Institutos Nacionais de Saúde R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e asan Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
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