ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

近年、ヒト多能性幹細胞を腎臓オルガノイドに分化させるための多くのプロトコールが^{開発されている1}、²、^3、4、5。腎臓オルガノイドは、新しい再生医療アプローチの研究、腎臓関連疾患のモデル化、毒性試験の実施、治療薬開発を支援するための重要なツールを提供してきました。その幅広い適用性にもかかわらず、腎臓オルガノイドは、成熟の欠如、インビトロでの限られた長期培養能力、およびヒト腎臓に見られるいくつかの細胞型の不足などの限界を有する^6,7,8。最近の研究は、オルガノイド成熟のレベルを改善し、培養期間を延長し、既存のプロトコル⁹、^10、11、12を修正することによって腎臓細胞集団の複雑さを拡大することに焦点を当てている。我々の確立されたプロトコル^5,13のこの現在の反復において、我々は、プロトコルの第¹段階における培地成分を、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン(ITSE)、脂質、ポリビニルアルコール(E5-ILP)およびCHIR99021を添加した無血清ベース培地に改変した(図1)。これらの変更により、完全に定義された無血清の低タンパク質培地が提供され、以前の培地組成物^5,13よりも成分が少なく、追加の成長因子が存在しません。その結果、第1段階培地は、以前に公開されたバージョンよりも調製に労力がかからず、バッチ間の変動性を低減する可能性があります⁵。これまでの研究では、インスリンとトランスフェリンの両方が無血清培養において重要であることが示されている^14,15が、高レベルのインスリンは中胚葉分化を阻害し得る¹⁶。我々は、元のプロトコールで提供されたように低いインスリンレベルを維持し、アッセイの第2段階でKOSR(インスリンを含む)のレベルをさらに低下させた。腎臓オルガノイド形成のための他のプロトコールに沿って、より低いレベルのKOSRは、腎臓組織の増殖と分化との間のバランスを維持するのに有益である¹⁷。また、ステージII培地¹³におけるグルコース濃度を低下させた。

我々の方法は、腎臓オルガノイドの懸濁アッセイのためのセットアップを記載し、元の刊行物⁵、13に記載されているように、初期〜60%コンフルエントhPSC 100mm培養プレートから最大〜^1,000個のオルガノイドを生じる。このプロトコルは、複数の100 mmまたは150 mmプレートから始めて簡単にスケールアップして、オルガノイド数をさらに増やすことができます。