Упрощенный метод получения органоидов почек из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
Здесь мы описываем протокол генерации почечных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs). Этот протокол генерирует почечные органоиды в течение двух недель. Полученные органоиды почек могут быть культивированы в крупномасштабных колбах спиннера или многолуночных магнитных пластинах перемешивания для параллельных подходов к тестированию лекарств.
Abstract
Почечные органоиды, полученные из hPSCs, обеспечили неограниченный источник почечной ткани. Органоиды почек человека являются бесценным инструментом для изучения заболеваний и повреждений почек, разработки клеточной терапии и тестирования новых терапевтических средств. Для таких применений необходимо большое количество однородных органоидов и высоковоспроизводимых анализов. Мы опираемся на наш ранее опубликованный протокол органоидов почек для улучшения общего состояния здоровья органоидов. Этот простой, надежный 3D-протокол включает в себя формирование однородных эмбриоидных тел в минимальной компонентной среде, содержащей липиды, добавку инсулин-трансферрин-селен-этаноламин и поливиниловый спирт с ингибитором GSK3 (CHIR99021) в течение 3 дней с последующей культивированием в нокаутирующей сывороточной замещающей среде (KOSR). Кроме того, агитационные анализы позволяют уменьшить слипание эмбриоидных тел и сохранить однородный размер, что важно для снижения изменчивости между органоидами. В целом, протокол обеспечивает быстрый, эффективный и экономически эффективный метод генерации большого количества почечных органоидов.
Introduction
В последние годы разработан ряд протоколов дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды почек 1,2,3,4,5. Почечные органоиды предоставили важный инструмент для содействия исследованиям новых подходов к регенеративной медицине, моделированию заболеваний, связанных с почками, проведению исследований токсичности и разработке терапевтических препаратов. Несмотря на их широкую применимость, почечные органоиды имеют такие ограничения, как отсутствие созревания, ограниченная долгосрочная культуральная способность in vitro и нехватка нескольких типов клеток, обнаруженных в почках человека 6,7,8. Недавняя работа была сосредоточена на улучшении уровня созревания органоидов, продлении периодов культивирования и расширении сложности популяций клеток почек путем изменения существующих протоколов 9,10,11,12. В данной итерации нашего установленного протокола 5,13 мы модифицировали компоненты среды на первом этапе протокола в безсывороточную базовую среду, дополненную инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSE), липидами, поливиниловым спиртом (E5-ILP) и CHIR99021 (рисунок 1). Эти изменения обеспечивают полностью определенную, не содержащую сыворотки, низкобелковую среду, с меньшим количеством компонентов, чем наша предыдущая средняя композиция 5,13 и без дополнительных факторов роста. В результате, среда первой ступени является менее трудоемкой в приготовлении, чем наша ранее опубликованная версия, и может снизить изменчивость от партии к партии5. Предыдущие исследования показали, что как инсулин, так и трансферрин важны в безсыворочной культуре14,15, однако высокие уровни инсулина могут быть ингибирующими дифференцировку мезодермы16. Мы сохранили низкий уровень инсулина, как это предусмотрено в первоначальном протоколе, и еще больше снизили уровни KOSR (содержащего инсулин) на втором этапе анализа. В соответствии с другими протоколами образования органоидов почек, более низкие уровни KOSR полезны для поддержания баланса между пролиферацией и дифференцировкойпочечной ткани 17. Кроме того, мы снизили концентрацию глюкозы в нашей среде стадии II13.
Наш метод описывает установку для суспензионного анализа почечных органоидов, получая до ~1000 органоидов из исходной ~60% сливающейся hPSC 100 мм культуральной пластины, как описано в оригинальной публикации 5,13. Этот протокол может быть легко масштабирован до начала с нескольких пластин 100 мм или 150 мм для дальнейшего увеличения числа органоидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования показали, что начальные этапы протокола имеют решающее значение для промежуточной дифференциации мезодермы 5,19,20 и, следовательно, на этом этапе необходимо реализовать строгий состав среды. Удаление неопредел?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Национальными институтами здравоохранения R01 DK069403, UC2 DK126122 и P30-DK079307 и ASN Foundation for Kidney Research Fellowship Program to AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
