Eine vereinfachte Methode zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). Dieses Protokoll erzeugt Nierenorganoide innerhalb von zwei Wochen. Die resultierenden Nierenorganoide können in großflächigen Spinnerkolben oder magnetischen Multi-Well-Rührplatten für parallele Drogentestansätze kultiviert werden.
Abstract
Nierenorganoide, die aus hPS-Zellen erzeugt werden, haben eine unbegrenzte Quelle für Nierengewebe bereitgestellt. Menschliche Nierenorganoide sind ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung von Nierenerkrankungen und -verletzungen, die Entwicklung zellbasierter Therapien und die Erprobung neuer Therapeutika. Für solche Anwendungen wird eine große Anzahl von einheitlichen Organoiden und hochreproduzierbaren Assays benötigt. Wir haben auf unserem zuvor veröffentlichten Nierenorganoidprotokoll aufgebaut, um die allgemeine Gesundheit der Organoide zu verbessern. Dieses einfache, robuste 3D-Protokoll beinhaltet die Bildung einheitlicher embryoider Körper in Medium mit minimalen Komponenten, die Lipide, Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin-Ergänzung und Polyvinylalkohol mit GSK3-Inhibitor (CHIR99021) für 3 Tage enthalten, gefolgt von Kultur in Knock-out-Serumersatz (KOSR)-haltigem Medium. Darüber hinaus ermöglichen rührende Assays eine Verringerung der Verklumpung der embryonalen Körper und die Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Größe, was wichtig ist, um die Variabilität zwischen den Organoiden zu reduzieren. Insgesamt bietet das Protokoll eine schnelle, effiziente und kostengünstige Methode zur Erzeugung großer Mengen von Nierenorganoiden.
Introduction
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Protokollen zur Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Nierenorganoide entwickelt 1,2,3,4,5. Nierenorganoide haben ein wichtiges Werkzeug zur Unterstützung der Erforschung neuer Ansätze der regenerativen Medizin, zur Modellierung von Nierenerkrankungen, zur Durchführung von Toxizitätsstudien und zur Entwicklung therapeutischer Medikamente bereitgestellt. Trotz ihrer breiten Anwendbarkeit haben Nierenorganoide Einschränkungen wie mangelnde Reifung, begrenzte langfristige Kulturkapazität in vitro und einen Mangel an mehreren Zelltypen, die in der menschlichen Niere gefundenwurden 6,7,8. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf die Verbesserung des Reifegrades von Organoiden, die Verlängerung der Kulturperioden und die Erweiterung der Komplexität von Nierenzellpopulationen durch Änderung der bestehenden Protokolle 9,10,11,12. In dieser vorliegenden Iteration unseres etablierten Protokolls 5,13 haben wir die Mediumkomponenten in der ersten Stufe des Protokolls zu einem serumfreien Basismedium modifiziert, das mit Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITSE), Lipiden, Polyvinylalkohol (E5-ILP) und CHIR99021 (Abbildung 1) ergänzt ist. Diese Veränderungen liefern ein vollständig definiertes, serumfreies, proteinarmes Medium mit weniger Komponenten als unsere vorherige mittlere Zusammensetzung 5,13 und ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren. Infolgedessen ist die Vorbereitung des Mediums der ersten Stufe weniger arbeitsintensiv als unsere zuvor veröffentlichte Version und kann die Variabilität von Charge zu Charge verringern5. Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl Insulin als auch Transferrin in der serumfreien Kultur wichtig sind14,15, jedoch können hohe Insulinspiegel die Mesodermdifferenzierung hemmen 16. Wir haben die niedrigen Insulinspiegel gemäß dem ursprünglichen Protokoll beibehalten und die KOSR-Spiegel (insulinhaltig) in der zweiten Stufe des Assays weiter reduziert. In Übereinstimmung mit anderen Protokollen für die Bildung von Nierenorganoiden sind niedrigere KOSR-Spiegel vorteilhaft für die Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts zwischen Proliferation und Differenzierung des Nierengewebes17. Darüber hinaus haben wir die Glukosekonzentration in unserem Stadium II Medium13 gesenkt.
Unsere Methode beschreibt einen Aufbau für den Suspensionsassay von Nierenorganoiden, wobei bis zu ~ 1.000 Organoide aus einer anfänglichen ~ 60% konfluierenden hPSC 100 mm Kulturplatte wie in der Originalpublikation 5,13 beschrieben ergeben. Dieses Protokoll kann leicht skaliert werden, um mit mehreren 100-mm- oder 150-mm-Platten zu beginnen, um die Organoidzahlen weiter zu erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ersten Protokollschritte für die intermediäre Mesodermdifferenzierung 5,19,20 entscheidend sind, und daher ist es wichtig, in diesem Stadium eine stringente Mediumzusammensetzung zu implementieren. Die Entfernung undefinierter Komponenten wie Serum, Albumin, proteinfreies Hybridommedium II aus der ersten Phase des Protokolls kann dazu beitragen, die konsistente Differenzierungseffizienz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 und P30-DK079307 und ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program zu AP finanziert.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
