طريقة مبسطة لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
هنا نصف بروتوكولا لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). يولد هذا البروتوكول عضويات الكلى في غضون أسبوعين. يمكن استزراع عضويات الكلى الناتجة في قوارير دوارة واسعة النطاق أو لوحات تحريك مغناطيسية متعددة الآبار لنهج اختبار الأدوية المتوازية.
Abstract
وقد وفرت المواد العضوية الكلى المتولدة من hPSCs مصدرا غير محدود للأنسجة الكلوية. تعد عضويات الكلى البشرية أداة لا تقدر بثمن لدراسة أمراض الكلى والإصابات ، وتطوير العلاجات القائمة على الخلايا ، واختبار علاجات جديدة. لمثل هذه التطبيقات ، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من المواد العضوية الموحدة والفحوصات القابلة للتكرار للغاية. لقد بنينا على بروتوكول الكلى العضوي المنشور سابقا لتحسين الصحة العامة للعضويات. يتضمن هذا البروتوكول ثلاثي الأبعاد البسيط والقوي تكوين أجسام جنينية موحدة في الحد الأدنى من وسط المكونات الذي يحتوي على الدهون ، وملحق الأنسولين – ترانسفيرين – السيلينيوم – الإيثانولامين وكحول البولي فينيل مع مثبط GSK3 (CHIR99021) لمدة 3 أيام ، تليها الثقافة في وسط يحتوي على استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR). بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الفحوصات التحريضية بتقليل تكتل الأجسام الجنينية والحفاظ على حجم موحد ، وهو أمر مهم لتقليل التباين بين المواد العضوية. بشكل عام ، يوفر البروتوكول طريقة سريعة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد كميات كبيرة من المواد العضوية في الكلى.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، تم تطوير عدد من البروتوكولات للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في الكلى العضوية1،2،3،4،5. وقد وفرت عضويات الكلى أداة هامة للمساعدة في البحث في نهج الطب التجديدي الجديدة، والأمراض المرتبطة بالكلى النموذجية، وإجراء دراسات السمية وتطوير الأدوية العلاجية. على الرغم من قابليتها للتطبيق على نطاق واسع ، فإن المواد العضوية الكلوية لها قيود مثل نقص النضج ، وقدرة الثقافة المحدودة على المدى الطويل في المختبر ، وندرة العديد من أنواع الخلايا الموجودة في الكلى البشرية6،7،8. وقد ركزت الأعمال الأخيرة على تحسين مستوى النضج العضوي ، وتمديد فترات الثقافة وتوسيع تعقيد مجموعات خلايا الكلى من خلال تعديل البروتوكولات الحالية9،10،11،12. في هذا التكرار الحالي لبروتوكولنا المعمول به 5,13 ، قمنا بتعديل المكونات المتوسطة في المرحلة الأولى من البروتوكول إلى وسط أساسي خال من المصل مكمل بالأنسولين – ترانسفيرين – السيلينيوم – الإيثانولامين (ITSE) ، والدهون ، وكحول البولي فينيل (E5-ILP) و CHIR99021 (الشكل 1). توفر هذه التغييرات وسيطا محددا بالكامل وخاليا من المصل ومنخفض البروتين ، مع مكونات أقل من تركيبتنا المتوسطة السابقة 5,13 وبدون عوامل نمو إضافية. ونتيجة لذلك، فإن وسيط المرحلة الأولى أقل كثافة في العمالة للتحضير من نسختنا المنشورة سابقا، وقد يقلل من التباين من دفعة إلى أخرى5. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن كلا من الأنسولين والترانسفيرين مهمان في الثقافة الخالية من المصل 14,15 ، ومع ذلك ، يمكن أن تكون المستويات العالية من الأنسولين مثبطة لتمايز الأديم المتوسط16. لقد حافظنا على مستويات الأنسولين المنخفضة كما هو منصوص عليه في البروتوكول الأصلي ، وخفضنا مستويات KOSR (التي تحتوي على الأنسولين) في المرحلة الثانية من الفحص. تمشيا مع البروتوكولات الأخرى لتشكيل الكلى العضوية، وانخفاض مستويات KOSR مفيدة للحفاظ على التوازن بين انتشار والتمايز من أنسجة الكلى17. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بخفض تركيز الجلوكوز في المرحلة الثانية المتوسطة13.
تصف طريقتنا إعدادا لفحص تعليق المواد العضوية في الكلى ، مما ينتج عنه ما يصل إلى ~ 1000 مادة عضوية من لوحة زراعة hPSC 100 مم الأولية المتقاربة بنسبة 60٪ كما هو موضح في المنشور الأصلي 5,13. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول بسهولة حتى يبدأ بألواح متعددة مقاس 100 مم أو 150 مم لزيادة أعداد المواد العضوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن خطوات البروتوكول الأولية حاسمة لتمايز الأديم المتوسطالوسيط 5،19،20 ، وبالتالي ، من الضروري تنفيذ تركيبة متوسطة صارمة في هذه المرحلة. قد تساعد إزالة المكونات غير المحددة مثل المصل والألبومين ووسط التهجين الخا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK069403 و UC2 DK126122 و P30-DK079307 ومؤسسة ASN لأبحاث الكلى برنامج زمالة بن ج. ليبس البحثي إلى AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
