Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Dendriten von Netzhautneuronen bilden komplizierte, aber spezifische Muster, die ihre Funktion innerhalb neuronaler Schaltkreise beeinflussen. In der Netzhaut von Wirbeltieren tragen verschiedene Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs) und Amacrinzell-Interneuronen einzigartige dendritische Morphologien, die sich in Baumgröße, Lage, Astlänge und Dichte ^{unterscheiden1.} Während der postnatalen Entwicklung verlängern RGCs und Amacrinzellen überschwängliche dendritische Prozesse in einen Neuropil, der als innere plexiforme Schicht (IPL) bezeichnet wird, wo sie bipolare Zelleingänge empfangen, die Photorezeptorsignale ^{übertragen2.} Wie durch Zeitraffer-Bildgebung fluoreszierend markierter Netzhautpopulationen in Küken- oder Zebrafischlarven erfasst, ist die Dendritenmorphogenese hochdynamisch3,4,5. Innerhalb weniger Tage dehnen sich dendritische Lauben aus, remodellieren und verzweigen sich zu engen Unterschichten des IPL, wo sie mit ausgewählten Partnern synapsieren. Die Dornen weisen im Laufe der Entwicklung unterschiedliche strukturelle Dynamiken auf, mit Änderungen der relativen Raten der Zweigaddition, des Rückzugs und der Stabilisierung. Amacrin- und RGC-Dendriten zeigen auch unterschiedliche Auswuchs- und Umbauverhaltensweisen, die eine typspezifische Arborisierung widerspiegeln können. Diese Studien verfolgten jedoch breite amakrine oder RGC-Populationen und konzentrierten sich auf laminares Targeting, das nur ein Aspekt der Morphologie ist.

Die Mechanismen, die die enorme morphologische Vielfalt erzeugen, die bei retinalen Subtypen beobachtet wird, sind kaum verstanden. Ziel dieser Gruppe war es, eine Methode zur Erfassung der Dendritendynamik und des Dornumbaus definierter retinaler Subtypen in Mäusen zu entwickeln. Die Identifizierung zelltypspezifischer Mechanismen der Dendritenmusterung erfordert Methoden zur Visualisierung und Messung des Dendritenverhaltens von Zellen von Interesse. Organotypische Kulturen von Mausretinas eignen sich gut für Lebendzellbildgebungsstudien mit konfokaler oder Multiphotonenmikroskopie. Sich entwickelnde Netzhäute werden seziert und zu einem flachen Explant montiert, das für mehrere Stunden in einer Aufnahmekammer abgebildet oder über einige Tage mit begrenzten Auswirkungen auf die Schaltung kultiviert werden ^kann6,7. Lebende retinale Neuronen können durch eine Vielzahl von Techniken markiert werden, einschließlich Farbstofffüllung durch Elektroden, Elektroporation, biolistische Abgabe von Partikeln, die mit lipophilen Farbstoffen oder Plasmiden, die für fluoreszierende Proteine (z. B. Gene Gun) beschichtet sind, sowie genetisch kodierte Zellmarkierungen7,8,9,10 . Diese Ansätze sind jedoch ineffizient für die Bildgebung der Dendritendynamik bestimmter retinaler Subtypen. Zum Beispiel sind Farbstofffüllmethoden mit geringem Durchsatz und erfordern elektrophysiologische Geräte und zusätzliche genetische Markierungen, um zuverlässig auf Zellen von Interesse abzuzielen. Darüber hinaus können die starken Fluoreszenzsignale im Soma benachbarte Dendriten verdecken.

Biolistische Genabgabemethoden können gleichzeitig Dutzende von Zellen markieren, aber Schritte, die die Hochdruckpartikelabgabe und die Inkubation isolierter Netzhaut über Nacht beinhalten, können die Zellphysiologie und das dendritische Auswachsen beeinträchtigen. Dieses Papier schlägt vor, dass neuere genetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die frühe Dendritendynamik mit Zelltyp und struktureller Auflösung zu erfassen, wobei die folgenden experimentellen Kriterien berücksichtigt werden. Erstens, um die feinen Zweige und Filopodien aufzulösen, die sich entwickelnde Lauben dominieren, sollte die Methode Neuronen mit hellen, fluoreszierenden Proteinen markieren, die Prozesse in der gesamten Laube füllen. Die Fluoreszenzmarkierung sollte aufgrund von Photobleichen während der Bildgebungsphase nicht verblassen. Eine Vielzahl von fluoreszierenden Proteinvarianten wurde generiert und auf Eignung für in vivo/ex vivo ^imaging11 basierend auf Helligkeit und Photostabilität verglichen. Zweitens müssen die fluoreszierenden Proteine (XFPs) im frühesten Stadium der Dendritenmorphogenese in ausreichend hohen Mengen exprimiert werden, damit das enge Entwicklungsfenster nicht übersehen wird. Bei Analysen statischer Zeitpunkte in der Netzhaut der Maus tritt die Entwicklung der Dendriten während der ersten postnatalen Woche auf und umfasst Phasen des Auswachsens, des Umbaus und der Stabilisierung10,12,13,14,15. Drittens sollte die Methode zu einer selektiven Markierung oder zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit der Markierung der interessierenden neuronalen Subpopulation führen. Viertens muss die Markierung der Zielsubpopulation ausreichend spärlich sein, damit die gesamte neuronale Laube identifiziert und verfolgt werden kann. Obwohl RGC- und amakrine Subtypen durch ihre reifen morphologischen Eigenschaften und IPL-Schichtungsmuster unterschieden werden ^{können16,17,18,19,20,} besteht die Herausforderung darin^, Subtypen während der Entwicklung basierend auf unreifen Strukturen zu identifizieren. Diese Aufgabe wird durch die Erweiterung transgener Werkzeuge erleichtert, um bestimmte retinale Zelltypen während der Entwicklung zu markieren.

Transgene und Knock-in-Mauslinien, in denen die zelluläre und zeitliche Expression fluoreszierender Proteine oder Cre durch genregulatorische Elemente bestimmt wird, werden häufig zur Untersuchung von Netzhautzelltypen ^{verwendet13,21,22,23}. Wichtige Beobachtungen zu subtypspezifischen Mustern der Dendritenentwicklung stammen aus Studien an transgenen Mausnetzhäuten zu statischen Zeitpunkten10,14,24,25. Insbesondere das Cre-Lox-System ermöglicht eine exquisite Genmanipulation und Überwachung von Subtypen mit einer Vielzahl von rekombinaseabhängigen Reportern, Sensoren und optogenetischen Aktivatoren. Diese Werkzeuge haben zur Entdeckung subtypspezifischer molekularer Programme und funktioneller Eigenschaften geführt, die der retinalen Schaltkreismontage zugrunde liegen26,27,28,29,30. Sie müssen jedoch noch genutzt werden, um die subtypspezifische Dendritendynamik in der Netzhaut der Maus zu untersuchen. Eine Markierung mit geringer Dichte kann durch die Kombination von Cre-Mauslinien mit Transgenen erreicht werden, die durch Elektroporation oder durch rekombinante AAVs eingeführt werden. Falls verfügbar, können auch Tamoxifen-induzierbare Cre-Linien oder intersektionale genetische Strategien verwendet werden. Schließlich sollte die Zelle minimal-invasiv markiert und unter Verwendung von Erfassungsparametern abgebildet werden, um das Gewebe nicht zu beeinträchtigen oder die für die Dendritenmorphogenese erforderliche Zellfunktion zu beeinträchtigen.

Hier wird eine Methode zur Anwendung transgener Werkzeuge und konfokaler Mikroskopie vorgestellt, um die Dendritendynamik in lebenden Netzhautexplantationen von Mäusen zu untersuchen. Cre transgene Mauslinien wurden mit AAV-Vektoren kombiniert, die fluoreszierende Proteine bei Cre-Rekombination exprimieren, was eine spärliche Markierung von Netzhautzellen von Interesse ermöglicht. Kommerziell erhältliche AAVs werden durch intravitreale Injektionen an die neonatale Netzhaut abgegeben. Diese Arbeit zeigt, dass AAVs eine signifikant hohe und zelltypspezifische Fluoreszenzexpression von 4 dpi erzeugen, was den Zugang zu postnatalen Zeitpunkten ermöglicht. Um diesen Ansatz zu veranschaulichen, wurde das cholinerge “Starburst” amacrine Interneuron markiert, indem Brainbow AAV in neonatalen Mäusen verabreicht wurde, die das Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-interne Ribosom-Entry-Site (IRES)-Cre-Transgen exprimierten, das in der frühen postnatalen Netzhaut aktiv ^ist31,32. Starburst-Amakrinzellen entwickeln eine stereotype und radiale Dornmorphologie, die durch die Selbstvermeidung von Dendriten geformt wird, die durch die geclusterten Protocadherine vermittelt ^wird33,34. Diese Arbeit zeigt, dass die Auflösung von Starburst-Dendriten und Filopodien durch XFPs zur Plasmamembran durch Zugabe des CAAX-Motivs, das einer Farnesylierung unterzogen wird, wie es für den Brainbow ^AAVs31 verwendet wird, signifikant verbessert wird. Schließlich wurden Zeitraffer-Bildgebungs- und Nachbearbeitungsprotokolle bestimmt, die qualitativ hochwertige Bilder erzeugen, die für die Dendritenrekonstruktion und morphometrische Quantifizierung geeignet sind. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Dendritenmorphogenese kontrollieren, und um mehrere zelluläre Verhaltensweisen in der intakten Netzhaut zu erfassen.