Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

I dendriti dei neuroni retinici formano schemi intricati, ma specifici, che influenzano la loro funzione all’interno dei circuiti neurali. Nella retina dei vertebrati, diversi tipi di cellule gangliari retiniche (RGC) e interneuroni a cellule amacrine portano morfologie dendritiche uniche che differiscono per dimensioni del pergolato, posizione, lunghezza del ramo e ^densità1. Durante lo sviluppo postnatale, gli RGC e le cellule amacrine estendono i processi dendritici esuberanti in un neuropil chiamato strato plessiforme interno (IPL), dove ricevono input di cellule bipolari che trasmettono segnali fotorecettori2. Come catturato dall’imaging time-lapse di popolazioni retiniche marcate fluorescentemente in larve di pulcino o zebrafish, la morfogenesi dei dendrite è altamente ^{dinamica3,4,5}. In pochi giorni, i pergole dendritiche si espandono, rimodellano e si ramificano in stretti sottostrati dell’IPL, dove si sinapsino con partner selezionati. I pergole mostrano diverse dinamiche strutturali rispetto allo sviluppo, con cambiamenti nei tassi relativi di aggiunta di rami, retrazione e stabilizzazione. I dendriti di amacrina e RGC mostrano anche diversi comportamenti di crescita e rimodellamento che potrebbero riflettere l’arborizzazione specifica del tipo. Tuttavia, questi studi hanno monitorato ampie popolazioni di amacrine o RGC e si sono concentrati sul targeting laminare, che è solo un aspetto della morfologia.

I meccanismi che producono la vasta diversità morfologica osservata tra i sottotipi di retina sono poco conosciuti. L’obiettivo di questo gruppo era quello di sviluppare un metodo per catturare la dinamica dei dendriti e il rimodellamento del pergolato di sottotipi retinici definiti nei topi. L’identificazione dei meccanismi specifici del tipo di cellula del pattern dendrite richiede metodi per visualizzare e misurare i comportamenti dei dendrite delle cellule di interesse. Le colture organotipiche di retine di topo sono adatte per studi di imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica. Le retine in via di sviluppo vengono sezionate e montate in un impianto piatto che può essere ripreso per diverse ore in una camera di registrazione o coltivato in pochi giorni con effetti limitati sul ^circuito6,7. I neuroni retinici vivi possono essere etichettati con una varietà di tecniche, tra cui il riempimento del colorante mediante elettrodi, l’elettroporazione, la somministrazione biolistica di particelle rivestite con coloranti lipofili o plasmidi che codificano proteine fluorescenti (ad esempio, Gene Gun), nonché etichette cellulari geneticamente codificate7,8,9,10 . Tuttavia, questi approcci sono inefficienti per l’imaging della dinamica dei dendriti di specifici sottotipi di retina. Ad esempio, i metodi di riempimento dei coloranti sono a bassa produttività e richiedono apparecchiature di elettrofisiologia ed etichette genetiche aggiuntive per indirizzare in modo affidabile le cellule di interesse. Inoltre, i forti segnali di fluorescenza nel soma possono oscurare i dendriti vicini.

I metodi di consegna dei geni biolistici possono etichettare simultaneamente dozzine di cellule, ma i passaggi che coinvolgono la consegna di particelle ad alta pressione e l’incubazione notturna della retina isolata possono compromettere la fisiologia cellulare e la crescita dendritica. Questo documento propone che i recenti strumenti genetici possano essere impiegati per catturare le prime dinamiche dei dendriti con il tipo di cellula e la risoluzione strutturale, dati i seguenti criteri sperimentali. In primo luogo, per risolvere i rami sottili e i filopodi che dominano i pergolati in via di sviluppo, il metodo dovrebbe etichettare i neuroni con proteine luminose e fluorescenti che riempiono i processi nell’intero pergolato. L’etichettatura a fluorescenza non deve sbiadire a causa del fotosbiancamento durante il periodo di imaging. È stata generata una varietà di varianti proteiche fluorescenti e confrontate per l’idoneità per l’imaging in vivo/ex ^vivo11 in base alla luminosità e alla fotostabilità. In secondo luogo, le proteine fluorescenti (XFP) devono essere espresse a livelli sufficientemente elevati dal primo stadio della morfogenesi della dendrite, in modo che non si perda la stretta finestra di sviluppo. Nelle analisi dei timepoint statici nella retina del topo, lo sviluppo di dendrite avviene durante la prima settimana postnatale e comprende fasi di crescita, rimodellamento e stabilizzazione10,12,13,14,15. In terzo luogo, il metodo dovrebbe portare a un’etichettatura selettiva o ad una maggiore probabilità di etichettatura della sottopopolazione neuronale di interesse. In quarto luogo, l’etichettatura della sottopopolazione bersaglio deve essere sufficientemente scarsa in modo che l’intero pergolato neuronale possa essere identificato e rintracciato. Sebbene i sottotipi di RGC e amacrina possano essere distinti per le loro caratteristiche morfologiche mature e i modelli di stratificazione IPL16,17,18,19,20, la sfida è identificare i sottotipi durante lo sviluppo basati su strutture immature. Questo compito è facilitato dall’espansione di strumenti transgenici per etichettare specifici tipi di cellule retiniche durante lo sviluppo.

Le linee di topo transgeniche e knock-in in cui l’espressione cellulare e temporale di proteine fluorescenti o Cre è determinata da elementi regolatori genici sono ampiamente utilizzate per studiare i tipi di cellule ^{retiniche13,21,22,23}. Osservazioni chiave sui modelli specifici del sottotipo di sviluppo di dendrite provengono da studi su retine di topi transgenici a timepoint statici10,14,24,25. Il sistema Cre-Lox, in particolare, consente una squisita manipolazione genica e il monitoraggio dei sottotipi utilizzando una varietà di reporter, sensori e attivatori optogenetici dipendenti dalla ricombinasi. Questi strumenti hanno portato alla scoperta di programmi molecolari specifici del sottotipo e proprietà funzionali che sono alla base dell’assemblaggio del circuito retinico26,27,28,29,30. Tuttavia, devono ancora essere sfruttati per studiare la dinamica dei dendriti specifici del sottotipo nella retina del topo. L’etichettatura a bassa densità può essere ottenuta combinando le linee di topo Cre con i transgeni introdotti dall’elettroporazione o dagli AAV ricombinanti. Se disponibili, possono essere utilizzate anche linee Cre inducibili dal tamoxifene o strategie genetiche intersezionali. Infine, la cellula deve essere marcata in modo minimamente invasivo e fotografata utilizzando parametri di acquisizione in modo da non compromettere il tessuto o interferire con la funzione cellulare richiesta per la morfogenesi dei dendriti.

Qui viene presentato un metodo per applicare strumenti transgenici e microscopia confocale per studiare la dinamica dei dendriti negli espianti retinici di topo vivo. Le linee di topo transgenico Cre sono state combinate con vettori AAV che esprimono proteine fluorescenti sulla ricombinazione cre, che consente l’etichettatura sparsa delle cellule retiniche di interesse. Gli AAV disponibili in commercio vengono consegnati alla retina neonatale mediante iniezioni intravitreali. Questo documento dimostra che gli AAV producono un’espressione fluorescente significativamente elevata e specifica del tipo di cellula di 4 dpi, consentendo l’accesso ai punti temporali postnatali. Per illustrare questo approccio, l’interneurone colinergico “starburst” amacrina è stato etichettato consegnando Brainbow AAV in topi neonatali che esprimono il sito di ingresso del ribosoma interno alla colina acetilsi (ChAT) (IRES)-Cre transgene, che è attivo nella retina postnatale ^precoce31,32. Le cellule amacrine Starburst sviluppano una morfologia stereotipata e radiale del pergolato che è modellata dall’auto-evitamento della dendrite mediata dalle protocadherine ^{raggruppate33,34}. Questo documento mostra che la risoluzione dei dendriti starburst e dei filopodi è significativamente migliorata dagli XFP alla membrana plasmatica con l’aggiunta del motivo CAAX che subisce la farnesilazione, come usato per gli AAV ^Brainbow31. Infine, sono stati determinati protocolli di imaging e post-elaborazione time-lapse che producono immagini di alta qualità suscettibili di ricostruzione di dendrite e quantificazione morfometrica. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare i fattori che controllano la morfogenesi dei dendriti e per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta.