Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Dendritos de neurônios da retina formam padrões intrincados, mas específicos, que influenciam sua função dentro de circuitos neurais. Na retina vertebrada, diversos tipos de células gânglios da retina (RGCs) e interneurônios de células amacrinas possuem morfologias dendríticas únicas que diferem em tamanho, localização, comprimento do ramo e ^densidade1. Durante o desenvolvimento pós-natal, RGCs e células amacrinas estendem processos dendráticos exuberantes em um neuropiloto chamado camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entradas de células bipolares transmitindo sinais fotorreceptores2. Como capturado por imagens de lapso de tempo de populações de retina fluorescentes rotuladas em larvas de filhotes ou zebrafish, a morfogênese dendrite é altamente ^{dinâmica3,4,5}. Em poucos dias, as arbóreas dendríticas expandem, remodelam e ramificam para subcamadas estreitas do IPL, onde sinapse com parceiros selecionados. As arbors apresentam dinâmicas estruturais diferentes sobre o desenvolvimento, com alterações nas taxas relativas de adição de filiais, retração e estabilização. Os dendritos amacrinos e RGC também apresentam diferentes comportamentos de crescimento e remodelação que podem refletir arborização específica do tipo. No entanto, esses estudos acompanharam populações de amacrinas ou RGC amplas e se concentraram na segmentação laminar, que é apenas um aspecto da morfologia.

Os mecanismos que produzem a vasta diversidade morfológica observada entre os subtipos da retina são mal compreendidos. O objetivo deste grupo foi desenvolver um método para capturar a dinâmica dendrite e a remodelação de arbor de subtipos de retina definidos em camundongos. Identificar mecanismos específicos do tipo celular de padronização de dendrite requer métodos para visualizar e medir comportamentos dendrite de células de interesse. Culturas organotípicas de retinas de camundongos são adequadas para estudos de imagem de células vivas usando microscopia confocal ou multifotífera. Retinas em desenvolvimento são dissecadas e montadas em uma explanta plana que pode ser imageda por várias horas em uma câmara de gravação ou cultivada ao longo de alguns dias com efeitos limitados no ^circuito6,7. Os neurônios de retina ao vivo podem ser rotulados por uma variedade de técnicas, incluindo preenchimento de corante por eletrodos, eletroporação, entrega biolística de partículas revestidas com corantes lipofílicos ou plasmídeos codificando proteínas fluorescentes (por exemplo, Gene Gun), bem como rótulos de células geneticamente ^{codificadas7,8, 9,10} . No entanto, essas abordagens são ineficientes para a dinâmica de dendrite de imagem de subtipos específicos da retina. Por exemplo, os métodos de enchimento de corantes são de baixa produtividade e requerem aparelhos de eletrofisiologia e rótulos genéticos adicionais para direcionar de forma confiável células de interesse. Além disso, os fortes sinais de fluorescência na soma podem obscurecer dendritos próximos.

Métodos de entrega de genes biolísticos podem simultaneamente rotular dezenas de células, mas etapas que envolvem a entrega de partículas de alta pressão e a incubação noturna de retina isolada podem comprometer a fisiologia celular e o crescimento dendrático. Este artigo propõe que ferramentas genéticas recentes podem ser empregadas para capturar dinâmicas dendrita precoces com tipo celular e resolução estrutural, dados os seguintes critérios experimentais. Primeiro, para resolver os ramos finos e filopodia que dominam as árvores em desenvolvimento, o método deve rotular neurônios com proteínas brilhantes e fluorescentes que preenchem processos em toda a arbor. A rotulagem de fluorescência não deve desaparecer devido ao fotobleaching durante o período de imagem. Uma variedade de variantes de proteína fluorescente foram geradas e comparadas para adequação para imagens in vivo/ex ^vivo11 baseadas em brilho e fotoestabilidade. Em segundo lugar, as proteínas fluorescentes (XFPs) devem ser expressas em níveis suficientemente altos pelo estágio inicial da morfogênese dendrite, de modo que a estreita janela de desenvolvimento não seja perdida. Em análises de pontos de tempo estáticos na retina do camundongo, o desenvolvimento do dendrite ocorre durante a primeira semana pós-natal e inclui fases de crescimento, remodelação e estabilização10,12,13,14,15. Em terceiro lugar, o método deve levar à rotulagem seletiva ou a uma maior probabilidade de rotulagem da subpopulação neuronal de interesse. Em quarto lugar, a rotulagem da subpopulação alvo deve ser suficientemente escassa para que toda a árvore neuronal possa ser identificada e rastreada. Embora os subtipos de RGC e amacrine possam ser distinguidos por suas características morfológicas maduras e padrões de estratificação de IPL16,17,18,19,20, o desafio é identificar subtipos durante o desenvolvimento com base em estruturas imaturas. Essa tarefa é facilitada pela expansão de ferramentas transgênicas para rotular tipos específicos de células da retina durante o desenvolvimento.

Linhas transgênicas e de camundongos em que a expressão celular e temporal de proteínas fluorescentes ou Cre é determinada por elementos regulatórios genéticos são amplamente utilizadas para estudar os tipos de células da retina13,21,22,23. Observações-chave sobre padrões específicos de desenvolvimento de dendrítos de subtipo vieram de estudos de retinas de camundongos transgênicos em momentos estáticos10,14,24,25. O sistema Cre-Lox, em particular, permite a manipulação genética requintada e o monitoramento de subtipos usando uma variedade de repórteres, sensores e ativadores optogenéticos dependentes de recombinase. Essas ferramentas levaram a descobertas de programas moleculares específicos do subtipo e propriedades funcionais que estão por trás do conjunto do circuito de retina26,27,28,29,30. No entanto, eles ainda não foram aproveitados para estudar a dinâmica dendrite específica do subtipo na retina do rato. A rotulagem de baixa densidade pode ser alcançada combinando linhas de mouse Cre com transgênicos introduzidos por eletroporação ou por AAVs recombinantes. Se disponível, linhas cre indutíveis de tamoxifen ou estratégias genéticas interseccionais também podem ser usadas. Finalmente, a célula deve ser rotulada de forma minimamente invasiva e imageada usando parâmetros de aquisição para não comprometer o tecido ou interferir com a função celular necessária para morfogênese dendrita.

Apresentado aqui é um método para aplicar ferramentas transgênicas e microscopia confocal para investigar a dinâmica do dendrite em explants de retina de rato vivo. Linhas de camundongos transgênicos cre foram combinadas com vetores AAV que expressam proteínas fluorescentes após a recombinação de Cre, o que permite rotulagem esparsa de células de interesse da retina. As AAVs disponíveis comercialmente são entregues à retina neonatal por injeções intravitreal. Este artigo demonstra que os AAVs produzem expressões fluorescentes significativamente altas e específicas do tipo celular por 4 dpi, permitindo o acesso aos pontos de tempo pós-natal. Para ilustrar essa abordagem, o interneuron amacrina “starburst” cholinergic “starburst” foi rotulado pela entrega de Brainbow AAV em camundongos neonatais expressando o site de entrada de acetiltransferase de colina (ChAT)-internal ribosome (IRES)-Cre transgene, que está ativo na retina pós-natal ^inicial31,32. As células amacrinas starburst desenvolvem uma morfologia arbórea estereotipada e radial que é moldada pela auto-evasão dendrite mediada pelas protocadherinas ^{agrupadas33,34}. Este artigo mostra que a resolução de dendritos e filopodia de starburst é significativamente melhorada pelos XFPs para a membrana plasmática com a adição do motivo CAAX que sofre farnesylation, como usado para o Brainbow ^AAVs31. Finalmente, foram determinados protocolos de imagem e pós-processamento de lapso de tempo que produzem imagens de alta qualidade para reconstrução dendrito e quantificação morfométrica. Este protocolo pode ser usado para identificar fatores que controlam a morfogênese dendrita e para capturar vários comportamentos celulares na retina intacta.