Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Dendrieten van retinale neuronen vormen ingewikkelde, maar specifieke patronen die hun functie binnen neurale circuits beïnvloeden. In het netvlies van gewervelde dieren dragen verschillende soorten retinale ganglioncellen (RGC’s) en interneuronen van amacrinecellen unieke dendritische morfologieën die verschillen in arborgrootte, locatie, taklengte en ^dichtheid1. Tijdens de postnatale ontwikkeling breiden RGC’s en amacrinecellen uitbundige dendritische processen uit tot een neuropil die de binnenste plexiforme laag (IPL) wordt genoemd, waar ze bipolaire celingangen ontvangen die fotoreceptorsignalen ^verzenden2. Zoals vastgelegd door time-lapse beeldvorming van fluorescerend gelabelde retinale populaties in kuiken- of zebravislarven, is de morfogenese van dendriet zeer ^{dynamisch3,4,5}. Binnen enkele dagen breiden dendritische priëlen zich uit, vervormen en vertakken ze naar smalle sublagen van de IPL, waar ze synapsen met geselecteerde partners. De priëlen vertonen verschillende structurele dynamieken gedurende de ontwikkeling, met veranderingen in relatieve snelheden van taktoevoeging, terugtrekking en stabilisatie. Amacrine- en RGC-dendrieten vertonen ook verschillende uitgroei- en remodelleringsgedragingen die typespecifieke arborisatie kunnen weerspiegelen. Deze studies volgden echter brede amacrine- of RGC-populaties en richtten zich op laminaire targeting, wat slechts één aspect van morfologie is.

De mechanismen die de enorme morfologische diversiteit produceren die wordt waargenomen in retinale subtypen zijn slecht begrepen. Het doel van deze groep was om een methode te ontwikkelen om dendrietdynamica en arbor remodeling van gedefinieerde retinale subtypen bij muizen vast te leggen. Het identificeren van celtypespecifieke mechanismen van dendrietpatronen vereist methoden om dendrietgedrag van interessante cellen te visualiseren en te meten. Organotypische culturen van het netvlies van muizen zijn zeer geschikt voor live-cell imaging studies met behulp van confocale of multifotonenmicroscopie. Ontwikkelende netvliezen worden ontleed en gemonteerd in een platte explant die gedurende enkele uren in een opnamekamer kan worden afgebeeld of gedurende enkele dagen kan worden gekweekt met beperkte effecten op het ^circuit6,7. Levende retinale neuronen kunnen worden gelabeld door een verscheidenheid aan technieken, waaronder kleurstofvulling door elektroden, elektroporatie, biolistische afgifte van deeltjes bedekt met lipofiele kleurstoffen of plasmiden die coderen voor fluorescerende eiwitten (bijv. Gene Gun), evenals genetisch gecodeerde cellabels7,8,9,10 . Deze benaderingen zijn echter inefficiënt voor het afbeelden van dendrietdynamica van specifieke retinale subtypen. Verfvulmethoden hebben bijvoorbeeld een lage doorvoer en vereisen elektrofysiologische apparatuur en aanvullende genetische labels om op betrouwbare wijze cellen van belang te targeten. Bovendien kunnen de sterke fluorescentiesignalen in de soma nabijgelegen dendrieten verdoezelen.

Biolistische genafgiftemethoden kunnen tegelijkertijd tientallen cellen labelen, maar stappen met hogedrukdeeltjesafgifte en nachtelijke incubatie van geïsoleerd netvlies kunnen de celfysiologie en dendritische uitgroei in gevaar brengen. Dit artikel stelt voor dat recente genetische hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om vroege dendrietdynamica vast te leggen met celtype en structurele resolutie, gezien de volgende experimentele criteria. Ten eerste, om de fijne takken en filopodia op te lossen die zich ontwikkelende priëlen domineren, moet de methode neuronen labelen met heldere, fluorescerende eiwitten die processen in het hele prieel vullen. De fluorescentielabeling mag niet vervagen als gevolg van fotobleaching tijdens de beeldvormingsperiode. Er zijn verschillende fluorescerende eiwitvarianten gegenereerd en vergeleken voor geschiktheid voor in vivo/ex vivo ^{beeldvorming11} op basis van helderheid en fotostabiliteit. Ten tweede moeten de fluorescerende eiwitten (XFP’s) in voldoende hoge niveaus tot expressie worden gebracht door het vroegste stadium van dendrietmorfogenese, zodat het smalle ontwikkelingsvenster niet wordt gemist. In analyses van statische tijdpunten in het netvlies van de muis vindt dendrietontwikkeling plaats tijdens de eerste postnatale week en omvat fasen van uitgroei, remodellering en stabilisatie10,12,13,14,15. Ten derde moet de methode leiden tot selectieve etikettering of tot een grotere kans op etikettering van de neuronale subpopulatie van belang. Ten vierde moet de etikettering van de doelsubpopulatie voldoende dun zijn om het gehele neuronale prieel te kunnen identificeren en traceren. Hoewel RGC- en amacrine-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun volwassen morfologische kenmerken en IPL-stratificatiepatronen16,17,18,19,20, is de uitdaging om subtypen tijdens de ontwikkeling te identificeren op basis van onvolgroeide structuren. Deze taak wordt vergemakkelijkt door de uitbreiding van transgene hulpmiddelen om specifieke retinale celtypen tijdens de ontwikkeling te labelen.

Transgene en knock-in muislijnen waarin cellulaire en temporele expressie van fluorescerende eiwitten of Cre wordt bepaald door genregulerende elementen worden veel gebruikt om retinale celtypen te bestuderen13,21,22,23. Belangrijke observaties over subtypespecifieke patronen van dendrietontwikkeling zijn afkomstig van studies van transgene muizenvliezen op statische tijdpunten10,14,24,25. Met name het Cre-Lox-systeem maakt uitstekende genmanipulatie en monitoring van subtypen mogelijk met behulp van een verscheidenheid aan recombinase-afhankelijke reporters, sensoren en optogenetische activatoren. Deze hulpmiddelen hebben geleid tot ontdekkingen van subtypespecifieke moleculaire programma’s en functionele eigenschappen die ten grondslag liggen aan retinale circuitassemblage26,27,28,29,30. Ze moeten echter nog worden gebruikt om subtypespecifieke dendrietdynamica in het netvlies van de muis te bestuderen. Labeling met lage dichtheid kan worden bereikt door Cre-muislijnen te combineren met transgenen die worden geïntroduceerd door elektroporatie of door recombinante AAV’s. Indien beschikbaar, kunnen tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen of intersectionele genetische strategieën ook worden gebruikt. Ten slotte moet de cel op een minimaal invasieve manier worden geëtiketteerd en in beeld worden gebracht met behulp van acquisitieparameters om het weefsel niet in gevaar te brengen of de cellulaire functie te verstoren die nodig is voor de morfogenese van dendriet.

Hier wordt een methode gepresenteerd om transgene hulpmiddelen en confocale microscopie toe te passen om dendrietdynamiek in retinale explantaten van levende muizen te onderzoeken. Cretransgene muislijnen zijn gecombineerd met AAV-vectoren die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen bij Cre-recombinatie, wat een schaarse labeling van retinale cellen van belang mogelijk maakt. Commercieel verkrijgbare AAV’s worden geleverd aan neonatale netvlies door intravitreale injecties. Dit artikel toont aan dat AAV’s een significant hoge en celtypespecifieke fluorescerende expressie produceren met 4 dpi, waardoor toegang tot postnatale tijdspunten mogelijk is. Om deze benadering te illustreren, werd de cholinerge “starburst” amacrine interneuron gelabeld door Brainbow AAV af te leveren bij neonatale muizen die de choline-acetyltransferase (ChAT) -interne ribosoom entry site (IRES) -Cre transgen tot expressie brengen, dat actief is in het vroege postnatale ^retina31,32. Starburst amacrine cellen ontwikkelen een stereotiepe en radiale arbor morfologie die wordt gevormd door dendriet zelfvermijding gemedieerd door de geclusterde protocadherinen33,34. Dit artikel toont aan dat de resolutie van starburst dendrieten en filopodia aanzienlijk wordt verbeterd door XFP’s aan het plasmamembraan met de toevoeging van het CAAX-motief dat farnesylatie ondergaat, zoals gebruikt voor de Brainbow ^AAV’s31. Ten slotte zijn time-lapse beeldvorming en nabewerkingsprotocollen vastgesteld die beelden van hoge kwaliteit produceren die vatbaar zijn voor dendrietreconstructie en morfometrische kwantificering. Dit protocol kan worden gebruikt om factoren te identificeren die de morfogenese van dendriet regelen en om verschillende cellulaire gedragingen in het intacte netvlies vast te leggen.