マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

ここに記載されているすべての方法は、ウェストレイク大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. インプラント組み立て 注: イメージングインプラントの組み立ては技術的に簡単で、市販のアイテムのみを必要とします(図1、材料表も参照)。ヘッドプレートは、ステンレス製またはチタンプレートを使用して、地元の機械店で製造することができます。手術を開始する前に、完全に組み立てられたインプラントの在庫を準備することをお勧めします。インビボ実験が行われた後、インプラントを回収し、複数回再利用することができます。場合によっては、カバーガラスをはんだ付けまたは交換して注入カニューレを再装着するだけで済む場合があります。 6 つの主要なハードウェア コンポーネントすべてを準備して、イメージングインプラントの組み立てと設置を行います (図 1)。 図1:イメージングインプラントの組み立てと設置のための6つの主要なハードウェアコンポーネント( A)ダミーカニューレ。(B)ガイドカニューレ。(C)イメージングカニューレ。(D) ガラスカバーガラス(E)ヘッドプレート。(F)内部カニューレ。スケールバー: 5 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 溶接機の電源を入れ、必要な温度まで加熱します。メモ:温度は溶接スズによって異なります。 微細なサンドペーパーを使用して酸化層を除去し、より強いはんだ付けを容易にして、イメージングカニューレの側面を研磨します。 画像カニューレと射出カニューレ(挿入されたダミーカニューレ付きガイドカニューレ)の位置を、手を助けて調整します(図2A、B)。 注射器を針で使用し、少量の適切なフラックスを、画像化とカンヌラの間の接続スポットに5秒間塗布し、液滴を取り除きます。注:この準備のために、我々は、イメージングと注入カニューラがステンレス鋼で作られているようにはんだ付けステンレス鋼部品のために、メーカーによって指定されている市販のフラックスを使用しました。カニューラの製造に使用する他の材料の場合、エンドユーザーは選択した材料を溶接できるフラックスを選択する必要があります。 スズを溶融し、フラックスで処理された接続スポットに適用します(図2)。注:手術中に不必要な大きな頭蓋切除術が必要になるため、余分なはんだ付けスズは避けてください。 図2:射出カニューレを組み立てるの概略図は、挿入されたダミーカニューレを有するガイドカニューレと、イメージングカニューレを有する。(A)射出カニューレとイメージングカニューレの間の角度は、近位45度である必要があります。(B)射出カニューレの先端は、イメージングカニューレの端に正しく置く必要があります。(C)はんだ撮像および注入カニューレに使用される溶接スズの適切なサイズ(赤い線は、スズのドロップレットの輪郭を示す)。(D) インプラント調製中に避けるべき溶接スズの不適切なサイズ(赤い線はスズ液滴の輪郭を示す)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 はんだ付けのスズが冷めるのを待ちます。通常、数秒かかります。 ダミーカニューレを両方向に挿入して、射出カニューレがブロックされないことを確認します。 爪楊枝または26Gシリンジ針を使用して、撮像カニューレの底面にUV硬化光学接着剤を塗布します。 ファイントゥイザーを使用して、画像カニューレに対応するサイズのカバーガラスを慎重に配置します。注:ガラスの位置は、光学接着剤に触れた後、ガラスを動かさずにイメージングカニューレに正確に配置する必要があります。それ以外の場合、ガラスが汚れ、イメージングの品質が低下します。 標準的なハンドヘルドUVランプから350-400 nm UV照明によって少なくとも1時間接着剤を硬化させます。注:使用する接着剤は、光学的に透明でなければなりません。それ以外の場合は、イメージングウィンドウの品質が低下します。注意:UV保護メガネ、手袋、ラボコートを着用して、皮膚や目の露出を避けてください。 カニューレを70%エタノールで洗浄し、空気乾燥し、手術まで滅菌容器に保管してください。注:カバーガラスをできるだけ清潔でそのままにしておくことは非常に重要です。使用した光学接着剤は、70%エタノール中で化学的に安定である。 2. ウィンドウの埋め込み 手術前の準備ステップ オートクレーブ内のすべての手術器具を殺菌します。 1x PBSと70%エタノールを2つの別々のペトリ皿に入れ準備します。 必要に応じて:手術手術を開始する前に少なくとも20分間、UV光を使用して手術領域を消毒する。注:可能な限り最も無菌状態で動作すると、ガラスで覆われた頭蓋窓が成功し、長持ち(6ヶ月)になります。汚染は、ほとんどの場合、窓の透明性を低下させるか、重度の炎症をもたらす可能性があります。 手術 手術の直前に70%エタノールで手術領域を殺菌します。 IACUC承認動物プロトコルに従って、動物の重量を量り、鎮痛皮下投与前投与を行う。 イオブルラン(誘導の場合は4%、維持する場合は1.5~2%、空気の流量は0.3~0.5 L/分)でマウスを麻酔します。動物が完全に鎮静されていることを確認するためにテールピンチとつま先ピンチ技術を使用してください。呼吸、SpO2、心拍数などの動物のバイタルサインを、処置の間観察する。 トリマーまたは脱毛クリームを使用して、目まで首の後ろから毛皮を取り除きます。 手術用加熱パッドの上に立体的なフレームにマウスを置きます(37°Cを維持)。耳の棒で頭を固定します。頭を少し押して、頭がしっかりと固定されていることを確認します。 眼軟膏を塗布して、手術中に動物の目が乾燥するのを防ぎます。 子宮切開を行う前に、ベタジンとそれに続いて70%エタノールを3回投与して外科部位を殺菌する。 頭蓋骨の上部の皮膚を取り除き、頭の基部に沿って水平カットから始まり、続いて眼道方向に2つのカットを行い、まぶたにほぼ達し、次に正中線に収束する2つの斜めのカットを行います。 2つの無菌綿棒で、つなぎの組織だけでなく、首の後ろの筋肉を頭蓋骨の縁に引き込みます。注:操作中に血管(特に筋肉に隠されたもの)に損傷を与えないようにしてください。 過度の痛みを避けるために、ペリオスの表面にリドカイン溶液(約0.1mL)を2分間塗布します。任意に頭蓋骨を除去した後に腫れから脳を減らすために、1%デキサメタゾンの0.1 mLを皮下注射することができる。 スカルの露出した領域全体をメスで静かに削り取り、接着剤と歯科用セメントをより良く付着させ、慢性的な移植をもたらす乾燥した粗い表面を作成します。 ステレオタキシックステーションに取り付けられた針の先端をブレグマに置き、3つの座標すべてを設定します(AP:前部後部;ML: 内側- 内側;DV: ドーサル-腹側) 0. 針の先端をラムダに置き、AP 座標が 0 であるかどうかを確認して、ヘッドの位置が垂直であることを確認し、また、ヘッドが水平に配置されていることを確認するために ML 座標が 0 であるかどうかを確認します。ない場合は、AP と ML 座標の両方が 0.1 mm 以内になるまで、ステレオタキシック ステーションの対応するノブを調整します。 針の先端を動かして頭蓋骨切り出し術の対応する点を見つけ、細かいマーカーを使用して頭蓋骨の位置をマークします。海馬の移植の場合、次の座標を持つ4点があります(AP:-0.68、 ML: -2.0) (AP: -3.68, ML: -2.0) (AP: -2.18, ML: -0.5) および (AP: -2.18, ML: -3.5)11, 同様に (AP: -4.0, ML: -2.0) 注射カニューラの最も大きいなポイント.注:このステップで使用するマーカーは、手術前に少なくとも1時間、UV照明を使用して滅菌する必要があります。ここに示す座標は、6-8週齢のC57BL/6Jマウス用です。座標は、異なる年齢やマウスの株によって異なる場合があります。 4つのマークされた点に基づいて円を描き、円の尾側の射出カニューレ領域の輪郭を描く(図3)。 10,000 rpmの速度で空気圧ドリルを使用して、頭蓋骨にマークされた輪郭に沿って優しく「描画」します。 骨の非常に薄い層が残るまで頭蓋骨を掘削し、通常は中央の穏やかなタッチの下で揺れ始めます。 頭蓋骨切除術の中心に無菌1x PBSの滴を適用し、非常に薄い先端鉗子または反対側から接近する2つの26 G針で頭蓋骨から骨のフラップを持ち上げます。注:PBSは頭蓋骨の部分を取り除き、dura12の出血の可能性を防ぐのに役立ちます。 PBSを適用し、続いて26G鈍い針を通して穏やかな吸引を数回行い、硬膜の表面をきれいにする。 抱負または眼用はさみによって、硬膜をそっと取り除きます。穏やかな吸引(〜-60kPa)を適用して、海馬の上の体の梁と同様に皮質をアブラ化します。注:皮質は、多くの場合、脳梁よりも黄色であり、脳梁は、通常、海馬よりも白いです。この脳梁は、通常、上から観察すると垂直および水平方向に行く神経線維によって区別が容易である(図3)。 図3:海馬の位置と脳切れ過程の立体的座標(A)頭蓋切り出し領域の縁の4つの座標。(B) 完全な頭蓋間術領域。(C-E)手術中に取得した代表的な画像(左)とその模式図(右)は、(A)の神経線維の異なる色と方向を示す(A)コルテックス(B)コーパスカロサム、および(C)皮質アブレーション中に見える海馬。スケールバー: 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 この時点での出血は、頭蓋切り出しにおける脳組織の視認性に影響を与える。血液を取り除くために皮質を吸引しながら、穏やかな吸引に続いて、1x PBSを適用します。注:このステップの間に連続出血は避けられず、ある程度、連続出血は正常な血圧の徴候である。皮質イメージングウィンドウの移植とは異なり、光学窓の下に血液の存在は、手術の数日後にクリアされるため許容されます。皮質をアブレイトした後、できるだけ早く作成された空洞への画像カニューレの挿入が最適です。 頭蓋切除術が画像カニューレよりも<0.5mm大きい場合は、スーパーボンドでインプラントを固定する前に、余分なKwik Silシーリングを使用してカニューレの設置をある程度救ってください。 開頭術がイメージングカニューレよりも<0.5mm小さい場合は、開頭術の縁部の残りの骨が頭蓋骨自体よりも薄いため、細かいツイーザーまたは眼用ハサミを使用して開頭術の端をトリミングすることによって、ある程度外科的処置を救助する。注:0.5ミリメートル以上の範囲を超えている頭蓋骨切除術は救助することはできません。これらの場合の対応するアクションは、動物のプロトコルに従って終了手順に従う必要があります。 インプラントを静かに頭蓋骨の骨組に挿入します。 L字針でインプラントの上にしっかりと押し付け、インプラントの光学窓を海馬の露出面にできるだけ近づけます。インプラントの挿入中に可能な限り血液を除去するために吸引を続けるインプラントの周りの頭蓋骨にPBSを繰り返し適用する。次に、インプラントと頭蓋骨の間にKwik Silの薄い層を適用して、歯科用セメントが頭蓋骨の下に浸透するのを防ぎます(図4)。 下の血液または他の液体の蓄積を避けるために、インプラントの光学窓の配置が海馬に対して正しいことを確認してください。注:重要なポイントは、イメージングカニューレのカバーガラスが海馬に対して正しく配置されていることを確認することです。光学窓が海馬に対して配置されている限り、イメージングカニューレの上側が頭蓋骨に平行であるかどうかは、最終的な光学アクセスにとって重要ではない。 CA1領域上の皮質の平均厚さに応じて、頭蓋骨へのカニューレの付着を容易にするために、画像カニューレの上面を頭蓋骨表面の上に~0.5mm保持する(図4)。 通常、約1分以下のKwik Silが治癒したら、頭蓋骨の表面、Kwik-Silの表面、およびインプラントの上面にスーパーボンドC&Bを均等に塗布します。 スーパーボンドC&Bが硬化したら、スーパーボンドC&Bの上に入れ歯ベース樹脂を塗布し、手術開始時に行った切開部の周りの皮膚を塗布します。注: セメントの代替タイプは、複数のベンダーから入手可能です。対応する製造元の指示に従います。 入れ歯ベース樹脂を硬化させた後、インプラントの周りの樹脂の上にヘッドプレートを置き、イメージングカニューレと同心円にします。ヘッドプレートの周りと上に入れ歯ベース樹脂を塗布して、その位置を固定します。数分間治しましょう。 カニューレの周りに厚いセメント層を構築することは避けて、対物レンズを使用してイメージングウィンドウへのアクセスを改善します(図4)。 図4:(A)コロナルおよび(B)矢状図における窓埋め込みの概略図。() ヘッドプレート;(b) 入れ歯ベース樹脂;(c) スーパーボンド;(d) クウィックシル;(e) イメージングカニューレ;(f)注射カニューレ;(g) はんだ付けスズ。(C):手術後にインプラントを装着したマウス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 入れ歯ベース樹脂を希釈して粘度を下げ、アプリケーターで手が届きにくい警告を満たします。 断熱したゴムテープを窓の上にそっと置き、動物の寝具から汚染される可能性を防ぎます。 手術が終わったら、炎症反応を防ぐために皮下に抗炎症薬を注入する。 麻酔から回復するまで、動物を暖かいケージに入れます。 一般的な行動を観察して、手術後72時間のマウスの健康状態を確認します。抗炎症薬および鎮痛薬は、痛みを解放し、炎症反応を軽減するために、24時間ごとに2〜3日間の皮下注射される。注:術後ケアのための代替監視手順、薬物および投与量は、正確な手順のためのIUCAC承認動物プロトコルを参照してください。 窓の下の血管系を観察するために、手術後5〜7日の窓をチェックしてください。透明なウィンドウの場合、動物はウイルス注射の準備ができています。 3. ウイルスの注入 注:ウイルス注射は通常、手術後5〜7日で行われます。ウイルス注射の前に、画像化窓がはっきりしていることを確認する必要があり、脳血管構造を観察することが可能である(図5)。場合によっては、ウィンドウをクリアするのに最大14〜16日かかる場合があり、脳の炎症が検出されない場合にも許容されます。 図5:高速グリーン色素を付加したウイルス注入後の光学窓(A)前及び(B)の代表的な画像。 矢印は同じ血管構造を示します。スケールバー: 1 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 高速緑色の染料ストック溶液をウイルス溶液に加え、PCRチューブ中の1:9の比で所望の抗度剤に希釈します。注: 高速緑色の染料が追加され、注射中のウイルス溶液の可視化が容易になります。 ポリエチレンチューブをシリンジと接続し、シリンジポンプを使用してミネラルオイルでチューブを埋め戻します。 内部カニューレをチューブの反対側に接続し、注入し、ミネラルオイルを数回引き出して、内部カニューレが詰まらないようにします。 イソフルラン(誘導の場合は4%、維持用1.5~2%、空気の0.3-0.5 L/分流量)で動物を麻酔し、ヘッドを加熱パッド(37°Cを維持)上で立体化フレームに固定し、目の軟膏を塗布します。 ウイルス溶液の600 nLを撤回し、ダミーカニューレを取り外し、注射器に接続された内部カニューレをガイドカニューレに挿入し、合計で10分間50 nL/minの速度でウイルスを注入する。メモ:ステレオ顕微鏡を使用して窓から色素が見えるかどうかを確認し、ウイルスの注入が成功したことを確認します(図5)。 注射後、ウイルスが窓の下に広がるように、内部カニューレを10分間接続し続けます。 ガイドカニューレから内側のカニューレをそっと取り出し、ダミーカニューレで再現します。 麻酔から回復するまで、動物を暖かいケージに入れます。注:通常、マウスはウイルス注射後10〜20日でイメージングの準備ができています。発現量と時間は、遺伝子発現を促進するために使用されるウイルス血清型およびプロモーターに依存する。 4. 広視野顕微鏡下での目覚めのマウスのイメージング。 注:準備されたヘッドプレートは、画像性インプラントの異常な安定性を提供し、したがって、目覚めと最小限の動きアーティファクトでマウスを振る舞う縦方向のイメージングを可能にします。 マウスを4%のイオブルランで数分間誘導し、ヘッドプレートをヘッドフォークに固定し、ヘッドフォークをトレッドミルに固定します。注:ヘッドフォークとトレッドミルは、この研究で使用されるヘッドプレート用にカスタマイズされています、 対応するCADファイルについては、サポート材料を参照してください。頭部固定前のマウスの誘導は、この手順のために動物を慣らすることが可能であるため、任意である。 トレッドミルを顕微鏡ステージの下に移動し、光学窓を対物レンズの下に置きます。 低倍率対物レンズを使用して機能イメージングに最適な視野(FOV)を見つけ、より高いNA対物レンズに切り替えて、単一細胞解像度でニューロンの活動を記録します。注: 射出カニューレが、その作業距離を達成するために、対物レンズの障害物である場合は、ワイヤークリッパーを使用してヘッドプレートから注入カニューレを切り落とします。