מאמר זה מדגים את הכנת חלון הדמיה בהתאמה אישית בתוספת קנולה עירוי והשתלתו על אזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים.
הדמיית פעילויות עצביות ברזולוציה של תא יחיד בבעלי חיים מתנהגים ערים היא גישה חזקה מאוד לחקירת פונקציות מעגל עצבי במערכות מדעי המוח. עם זאת, ספיגה גבוהה ופיזור של אור ברקמת יונקים מגבילים את ההדמיה התוך-וורידית בעיקר לאזורי מוח שטחיים, ומשאירים אזורים במוח עמוק, כגון ההיפוקמפוס, מחוץ להישג ידם של מיקרוסקופיה אופטית. בסרטון זה, אנו מראים את ההכנה וההשתלה של חלון ההדמיה המותאם אישית כדי לאפשר הדמיה כרונית ב- vivo של אזור CA1 ההיפוקמפוס הגבי בעכברים מתנהגים עם ראש קבוע. החלון בהתאמה אישית מתווסף קנולה עירוי המאפשר משלוח ממוקד של וקטורים ויראליים וסמים לאזור ההדמיה. על ידי שילוב הכנה זו עם הדמיה שדה רחב, ביצענו הקלטה ארוכת טווח של פעילות עצבית באמצעות מחוון סידן פלואורסצנטי מתת-קבוצות גדולות של נוירונים בעכברים מתנהגים במשך מספר שבועות. הדגמנו גם את הישימות של הכנה זו להדמיית מתח ברזולוציה חד-פעמית. אינדיקטורים מקודדים גנטית בעלי ביצועים גבוהים של פעילות עצבית ומצלמות CMOS מדעיות אפשרו הדמיה חוזרת ונשנית של פרטים מורפולוגיים תת-תאיים של נוירונים בודדים ברזולוציה זמנית גבוהה. כמו כן, אנו דנים ביתרונות ובמגבלות הפוטנציאליות של השיטה המתוארת ובתאימותה לטכניקות הדמיה אחרות.
ההיפוקמפוס הוא אזור מוח מרכזי האחראי על למידה וזיכרון1, כמו גם לניווט מרחבי2. ניוון היפוקמפוס קשורה להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות הכרוכות באובדן זיכרון וירידה קוגניטיבית3,4,5. בעכברים, ההיפוקמפוס הוא מודל מבוסס מאוד ללמוד היווצרות למידה מרחבית, הקשרית ואסוציאטיבית וזיכרון ברמות התא והרשת4,5. המחקרים המכניסטיים של למידה וזיכרון דורשים חקירה אורך של מבנה עצבי ותפקוד בעכברים מתנהגים. הדמיית פלואורסצנטיות בשילוב עם בדיקות מקודדותגנטית 6 מספקת יכולות חסרות תקדים לתיעוד דינמיקת מתח ממברנה7,8, סידן חולף9, ושינויים מבניים10 על תת קבוצות גדולות של נוירונים תוך ורידי. עם זאת, גישה אופטית להיפוקמפוס בעכברים נחסמת על ידי קליפת המוח, אשר יכול להגיע מעל 1 מ”מ עובי. כאן, תיארנו הליך להרכבת מכשיר הדמיה בהתאמה אישית וההשתלה הכרונית שלו בראש העכבר לגישה אופטית ארוכת טווח לתיבת המשנה CA1 של ההיפוקמפוס הגבי בעכברים מתנהגים. קנולה עירוי משולב שתל הדמיה מאפשר ניהול של וירוסים או תרופות ישירות על הנוירונים בתחום הראייה. ההכנה המתוארת בשילוב עם מיקרוסקופיה רחבת שדה מאפשרת הדמיה חוזרת ונשנית של תת-קבוצות גדולות של נוירונים בהתנהגות עכברים לאורך תקופות זמן ארוכות. השתמשנו בהכנה זו כדי לבטא אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן ומתח באזור CA1 ההיפוקמפוס באמצעות הזרקה ממוקדת של וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי (rAAV) עבור הקלטות פעילות עצבית ברזולוציה של תא יחיד. ביצענו גם הדמיית סידן אורך של תת-קבוצות העצבים המתאימות ברזולוציה גבוהה של מרחבי ספטיו-טמפורל בבעלי חיים מתנהגים. בנוסף, הכנה זו תואמת מיקרוסקופיה מולטי פוטון ומיקרואנדוסקופיה, ובכך להרחיב עוד יותר את ארגז הכלים של טכניקות הדמיה ללמוד רשתות עצביות ברמות הסלולר והתת-תאיות בעכברים מתנהגים. תיארנו שלבים קריטיים ופתרון בעיות בפרוטוקול. כמו כן דנו בחסרונות ובמגבלות האפשריות של השיטה.
כאן אנו מתארים שיטה להדמיה ארוכת טווח של אזור CA1 ההיפוקמפוס בעכברים מתנהגים. השיטה מבוססת על השתלה כרונית של חלון הדמיה בהתאמה אישית, המאפשר גם ניהול ממוקד של וירוסים או תרופות ישירות לנוירונים בעלי עניין. הפרוטוקול הנוכחי מורכב מארבעה חלקים עיקריים: i) הרכבה של שתל הדמיה; ii) התקנה של שתל הדמיה; iii) הזרקת וירוסים באמצעות שתל הדמיה; iv) הדמיה תפקודית בעכברים מתנהגים. להלן אנו מתארים ודנים בשלבים קריטיים בפרוטוקול, פתרון בעיות, שינויים ומגבלות של השיטה. כמו כן, אנו דנים בחשיבות השיטה וביישומיה החלופיים הפוטנציאליים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המתואר החשובים למדי לניתוח מוצלח: (i) הכנת שתל הדמיה באיכות גבוהה; (ii) מצבים כירורגיים סטריליים; (iii) השאיפה של קליפת המוח; (iv) מיקום מדויק של שתל ההדמיה; (v) זריקה ויראלית. כפי ששלב 1.6 מציין, עודף פח הלחמה ידרוש גולגולת גדולה יותר ובכך מגדיל את הסיכון לדלקת. כמו כן חשוב מאוד להשתמש בכמות המתאימה של הדבק האופטי דבק בעת תיקון זכוכית הכיסוי לקנולה הדמיה, כפי שצוין בשלב 1.11, כמו כמות מספקת עלולה לגרום דליפה של נוזל השדרתי לתוך הצינורית הדמיה ולהפוך אותו אטום. מצד שני, עודף דבק אופטי יכול לגרום לירידה בשקיפות של חלון הזכוכית. זיהום אפשרי של שתל ההדמיה יכול לגרום לשגשוג פעיל של רקמת חיבור מתחת לחלון האופטי ו/או דלקת חמורה, שתוביל לסיום מוקדם של הניסוי. לכן, הדמיה השתל הרכבה והכנה לפני הניתוח הוא כמעט חשוב כמו ההליך הכירורגי עצמו.
במהלך הניתוח, החלק של קליפת המוח תחת גולגולת הוא ablated על ידי שאיפה עדינה, אשר גורם לדימום בלתי נמנע. דם באתר הכירורגי מפחית באופן משמעותי את הראות של רקמת המוח שיש להסיר. זה מסבך את ההערכה המדויקת של העומק הנדרש של אבלציה רקמות. שטיפה זהירה של האתר הכירורגי עם PBS בכל פעם לפני החלת יניקה כדי להסיר את החלק הבא של הרקמה מספק שליטה טובה יותר של עומק. יש להסיר תמיד את רקמת המוח בחלקים קטנים צעד אחר צעד המאשרים את עומק הרקמה המהותית לפני שתמשיך עם יניקה נוספת. שליטה עדינה יותר של יניקה יכולה להיות מושגת גם עם מחט קהה דק יותר. אנו ממליצים להשתמש במחט 26 G, עם זאת, קטן יותר מאשר 26 G קוטר נוטה יותר סתימת. יתר על כן, בדרך כלל נדרש תרגול רב כדי לקבוע את עומק השאיפה המדויק הנדרש עבור כל בעל חיים, שכן צבע קליפת המוח, כפיס המוח וההיפוקמפוס עשוי להשתנות מעכבר לעכבר (איור 3).
הכנסה ואבטחת שתל ההדמיה צריך להיעשות בדיוק רב כדי להבטיח את המיקום הקרוב ביותר האפשרי של חלון ההדמיה אל פני השטח הגביים של ההיפוקמפוס. גודל הגולגולת המוכנה צריך להתאים באופן הדוק את השתל ולאפשר החדרתו ללא התנגדות משמעותית. במקביל, לא צריך להיות פער גלוי בין הגולגולת לשתל כדי להבטיח איטום תקין ולהימנע מחשיפה לרקמות המוח. לחץ עדין ויציב צריך להיות מיושם על החלק העליון של השתל במהלך האיטום שלה לגולגולת. זה כמעט בלתי נמנע יש דם מתחת לחלון ההדמיה במהלך התקנת השתל. אם ההליך הכירורגי נעשה כראוי, החלון צריך לנקות ב 3-7 ימים, ואת כלי הדם במוח הופך גלוי בבירור. חשוב גם לוודא כי וירוס מוזרק כראוי מתחת לחלון. במקרה של ביטוי נכשל, וירוס ניתן reinjected מספר פעמים.
הסיבוך העיקרי שנתקלנו בו במקרים מסוימים הוא ראות מופחתת של חלון ההדמיה. ישנן מספר סיבות אפשריות לאיכות הדמיה ירודה: i) דלקת מתמשכת; ii) צמיחת רקמת חיבור על הזכוכית; iii) פער גדול בין החלון והיפוקמפוס. דלקת נגרמת בדרך כלל על ידי זיהום במהלך הניתוח או על ידי לא מעוקר כראוי השתל הדמיה. אנו ממליצים לחבוש אוטומטית את המכשירים הכירורגיים לפני ואחרי כל ניתוח, לחטא את אזור הניתוח ממש לפני ההליך, וללבוש ציוד מגן אישי נקי במהלך הניתוח. יש לנקות שתלי הדמיה לאחר ההרכבה, לעקר ולאחסן אותם בתנאים סטריליים. צמיחת רקמת החיבור על שתל ההדמיה יכולה לנבע מזיהום מכני על פני הזכוכית או מטראומה מוגזמת של רקמת המוח במהלך אבלציה של קליפת המוח. לאחר הרכבת השתל, חשוב לאשר את משטח הזכוכית נקי וחלק. כמו כן, יש להסיר בזהירות את כל חתיכות רקמת המוח הפגועה לפני החדרת שתל הדמיה לתוך הגולגולת. במקרים מסוימים, הפער בין חלון הזכוכית והיפוקמפוס גורם להצטברות של נוזל השדרתי, מה שמפחית את איכות ההדמיה. לכן, במהלך התקנת השתל, חיוני להכניס אותו כל הדרך בהבטחת מגע טוב בין ההיפוקמפוס לחלון הזכוכית. לפעמים, קשה לזהות את הסיבה המדויקת לחלון הדמיה אטום. אנו מציעים לבצע ניתוח שלאחר המוות כדי לחשוף את התנאים מתחת לחלון האופטי ולהתאים בהתאמה את הניתוחים הבאים.
לשיטה מספר מגבלות בסיסיות וטכניות שיש לקחת בחשבון לפני ובמהלך הדמיית vivo. אחת המגבלות העיקריות היא אבלציה קליפת המוח. חלק מקליפת המוח החזותית והחושית מוסר במהלך הניתוח. אמנם קשה להעריך במדויק את ההשפעה של אבלציה קליפת המוח, כמו רקמת המוח הוסר אינו מקרין ישירות על ההיפוקמפוס, מספר מחקרים הראו שום פגיעה ניכרת של למידה תלויי היפוקמפוס או פונקציות אחרות ההיפוקמפוס הרלוונטי15,16. יש לשקול גם את המגבלות האופטיות, במיוחד כאשר נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות גבוהות של NA. לדוגמה, במחקר זה השתמשנו בקנולה באורך 1.75 מ”מ בקוטר פנימי של 1.9 מ”מ. הגיאומטריה של קנולה זו לא תשמר את המטרה המלאה NA של האוויר עם NA יותר ~ 0.5 או מטרת מים עם NA יותר ~ 0.6 כפי שהוא יהיה קליפ חלק מהאור. מגבלה נוספת, הנפוצה בכל שתלי הדמיית המוח, היא שחלק מהמוח נחשף, ובכך מקדם אובדן חום17,18. עם זאת, טמפרטורת המוח הפיזיולוגית ניתן לשחזר בקלות במהלך הדמיה על ידי זלוף של חיץ חם.
ניתן לשנות או להתאים בקלות את השיטה המתוארת עבור יישומים אחרים. לדוגמה, ההכנה יכולה להיות מותאמת להדמיה של סטריאום7. כמו הסטריאטום שוכב קצת יותר עמוק מאשר ההיפוקמפוס, הצינורית הדמיה ארוכה יותר יש להשתמש להרכבת שתל הדמיה. אנו ממליצים להשתמש בקנולה הדמיה 2.0 מ”מ. יש להתאים את הקואורדינטות של הגולגולת בהתאמה (AP: +0.8 מ”מ, ML: -1.8 מ”מ). בנוסף, הזרקת וירוסים באמצעות קנולה עירוי מאפשרת להשיג את הביטוי של transgene בשכבה דקה של נוירונים בעת שימוש בסרוטיפ AAV עם התפשטות מוגבלת19,20. היא מועילה במיוחד להדמיית פוטון אחד עקב פלואורסצנטיות מופחתת מחוץ למיקוד משכבות עמוקות יותר, וכתוצאה מכך, הדמיה משופרת ברזולוציה של תא יחיד. יתר על כן, ניתן להשתמש בהזרקת קנולה גם במהלך הדמיה תפקודית לניהול תרופות או כימיקלים אחרים ישירות על הנוירונים ב- FOV (איור 5B). קנולה אינפוזיה הכוללת מוסיפה פונקציות שימושיות לשתל ההדמיה, משפרת את איכות ההדמיה בשל הביטוי הנגיפי הממוקד ומאפשרת גירוי תרופתי של נוירונים ב- FOV. לוחית הראש המשומשת מספקת יציבות יוצאת דופן של השתלת הדמיה הממזערת חפצי תנועה גם בבעלי חיים הנעים באופן פעיל על הליכון. צלחת הראש קטנה וקלילה, גורמת לאי נוחות מינימלית לבעלי חיים, ונשארת יציבה במשך מספר חודשים לאחר ההתקנה. שתל ההדמיה תואם גם להדמיה מולטי פוטון15,16,21 וניתן לשלבו עם מיקרו אנדוסקופים22,23. שתל הדמיה דומה שימש גם להדמיה מולטי פוטון של מבני ההיפוקמפוס העמוקים יותר, כולל רדיואטום שכבתי, סטראטום לקונוז, ו gyrus שקע16,24,25,26,27. עם זאת, מיקוד מבני ההיפוקמפוס העמוקים יותר עם AAVs באמצעות קנולה עירוי עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת של סרוטיפ AAV ונפח19.
אנו מאמינים כי הפרוטוקול המתואר יקל על מחקרים שמטרתם לחקור פעילות עצבית עם רזולוציה מרחבית גבוהה בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים באמצעות הגדרות הדמיה פוטון אחד פשוט ובמחיר סביר.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לכל חברי קבוצת BioEngineering מולקולרית באוניברסיטת ווסטלייק על כל העזרה והדיון השימושי. אנו מודים גם לג’ינזה לי וג’יאה-מין ג’יה מאוניברסיטת ווסטלייק על העזרה בצילומי ההליך הכירורגי.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מקרן אוניברסיטת ווסטלייק, מענק החוקר הצעיר BBRF 2020, והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין להעניק 32050410298 הכל ל- K.D.P.
Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |