Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen
Summary
Dieser Artikel zeigt die Vorbereitung eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, ergänzt mit Infusionskanüle und deren Implantation in die CA1-Region des Hippocampus bei Mäusen.
Abstract
Die Abbildung neuronaler Aktivitäten mit Einzelzellauflösung bei wachen Tieren ist ein sehr leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung neuronaler Schaltkreisfunktionen in den Systemneurowissenschaften. Eine hohe Absorption und Streuung von Licht im Gewebe von Säugetieren beschränkt die intravitale Bildgebung jedoch hauptsächlich auf oberflächliche Hirnregionen, so dass tiefe Hirnareale wie der Hippocampus für die optische Mikroskopie unerreichbar sind. In diesem Video zeigen wir die Vorbereitung und Implantation des maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, um eine chronische In-vivo-Bildgebung der dorsalen Hippocampus-CA1-Region bei kopffixierten Mäusen zu ermöglichen. Das maßgeschneiderte Fenster wird durch eine Infusionskanüle ergänzt, die eine gezielte Abgabe von viralen Vektoren und Medikamenten in den Bildbereich ermöglicht. Durch die Kombination dieses Präparats mit der Weitfeldbildgebung führten wir eine Langzeitaufzeichnung der neuronalen Aktivität mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator von großen Untergruppen von Neuronen in sich verhaltenden Mäusen über mehrere Wochen durch. Wir haben auch die Anwendbarkeit dieses Präparats für die Spannungsbildgebung mit Single-Spike-Auflösung demonstriert. Leistungsstarke genetisch kodierte Indikatoren neuronaler Aktivität und wissenschaftliche CMOS-Kameras ermöglichten die wiederkehrende Visualisierung subzellulärer morphologischer Details einzelner Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung. Wir diskutieren auch die Vorteile und möglichen Einschränkungen der beschriebenen Methode und ihre Kompatibilität mit anderen bildgebenden Verfahren.
Introduction
Der Hippocampus ist eine schlüsselschwere Hirnregion, die für Lernen und Gedächtnis1 sowie für die räumliche Navigation 2 verantwortlichist. Hippocampus-Atrophie ist mit neurologischen und psychiatrischen Störungen verbunden, die Gedächtnisverlust und kognitiven Verfallbeinhalten 3,4,5. Bei Mäusen ist der Hippocampus ein sehr gut etabliertes Modell zur Untersuchung des räumlichen, kontextuellen und assoziativen Lernens und der Gedächtnisbildung auf der Zell- und Netzwerkebene4,5. Die mechanistischen Studien des Lernens und des Gedächtnisses erfordern eine longitudinale Befragung der neuronalen Struktur und Funktion bei sich verhaltenden Mäusen. Die Fluoreszenzbildgebung in Kombination mit genetisch kodierten Sonden6 bietet beispiellose Möglichkeiten, die Dynamik der Membranspannung7,8, Kalziumtransienten9und strukturelle Veränderungen10 über große Untergruppen von Neuronen intravital aufzuzeichnen. Der optische Zugang zum Hippocampus bei Mäusen wird jedoch durch den Kortex behindert, der eine Dicke von über 1 mm erreichen kann. Hier beschrieben wir ein Verfahren zum Zusammenbau eines maßgeschneiderten Bildgebungsgeräts und dessen chronische Implantation in den Mauskopf für den langfristigen optischen Zugang zur CA1-Subregion des dorsalen Hippocampus bei sich verhaltenden Mäusen. Die in das bildgebende Implantat integrierte Infusionskanüle ermöglicht die Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt auf die Neuronen im Sichtfeld. Das beschriebene Präparat in Kombination mit der Weitfeldmikroskopie ermöglicht die wiederkehrende Abbildung der großen Untergruppen von Neuronen in sich verhaltenden Mäusen über lange Zeiträume. Wir verwendeten dieses Präparat, um kalzium- und spannungsgenaue genetisch kodierte Indikatoren in der HIPPOCAMPUS-CA1-Region durch gezielte Injektion des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) für neuronale Aktivitätsaufzeichnungen mit Einzelzellauflösung zu exprimieren. Wir führten auch eine longitudinale Kalziumbildgebung der entsprechenden neuronalen Untergruppen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung bei sich verhaltenden Tieren durch. Darüber hinaus ist dieses Präparat mit der Multiphotonenmikroskopie und Mikroendoskopie kompatibel und erweitert so die Toolbox der bildgebenden Verfahren zur Untersuchung neuronaler Netzwerke auf zellulärer und subzellulärer Ebene in sich verhaltenden Mäusen. Wir haben kritische Schritte und die Fehlerbehebung des Protokolls beschrieben. Wir diskutierten auch die möglichen Fallstricke und Grenzen der Methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Langzeitbildgebung der Hippocampus CA1-Region bei sich verhaltenden Mäusen. Die Methode basiert auf der chronischen Implantation eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, das auch die gezielte Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt an die interessierenden Neuronen ermöglicht. Das vorliegende Protokoll besteht aus vier Hauptteilen: i) Montage des bildgebenden Implantats; ii) Installation eines bildgebenden Implantats; iii) Virusinjektion über bildgebendes Implantat; iv) funktionelle Bildgebung bei sich verhaltenden Mäusen. Im Folgenden beschreiben und diskutieren wir kritische Schritte im Protokoll, die Fehlerbehebung, Änderungen und Einschränkungen der Methode. Wir diskutieren auch die Bedeutung der Methode und ihre möglichen alternativen Anwendungen.
Es gibt mehrere kritische Schritte im beschriebenen Protokoll, die für eine erfolgreiche Operation ziemlich wichtig sind: (i) Vorbereitung eines hochwertigen bildgebenden Implantats; ii) sterile chirurgische Bedingungen; iii) Aspiration des Kortex; iv) genaue Platzierung des bildgebenden Implantats; v) Virusinjektion. Wie Schritt 1.6 zeigt, würde überschüssiges Lötzinn eine größere Kraniotomie erfordern und somit das Entzündungsrisiko erhöhen. Es ist auch sehr wichtig, eine angemessene Menge des adhäsiven optischen Klebstoffs zu verwenden, wenn das Deckglas an der bildgebenden Kanüle befestigt wird, wie in Schritt 1.11 angegeben, da eine unzureichende Menge dazu führen kann, dass Zerebrospinalflüssigkeit in die bildgebende Kanüle austritt und diese undurchsichtig macht. Auf der anderen Seite kann überschüssiger optischer Klebstoff zu einer verminderten Transparenz des Glasfensters führen. Eine mögliche Kontamination des bildgebenden Implantats kann zu einer aktiven Proliferation von Bindegewebe unter dem optischen Fenster und/oder zu schweren Entzündungen führen, die zu einem vorzeitigen Abbruch des Experiments führen. Daher ist die bildgebende Implantation und Vorbereitung vor der Operation fast so wichtig wie der chirurgische Eingriff selbst.
Während der Operation wird der Teil des Kortex unter Kraniotomie durch sanfte Aspiration abgetragen, was zu unvermeidlichen Blutungen führt. Blut an der Operationsstelle reduziert signifikant die Sichtbarkeit des Hirngewebes, das entfernt werden muss. Dies erschwert die genaue Beurteilung der erforderlichen Gewebeablationstiefe. Eine sorgfältige Spülung der Operationsstelle mit PBS jedes Mal vor dem Absaugen, um den nächsten Teil des Gewebes zu entfernen, sorgt für eine bessere Kontrolle der Tiefe. Das Hirngewebe sollte immer in kleinen Portionen Schritt für Schritt entfernt werden, um die Tiefe des abgetragenen Gewebes zu bestätigen, bevor mit mehr Absaugung fortgefahren wird. Eine feinere Kontrolle der Absaugung kann auch mit einer dünneren stumpfen Nadel erreicht werden. Wir empfehlen die Verwendung einer 26-G-Nadel, jedoch ist ein Durchmesser von weniger als 26 G anfälliger für Verstopfungen. Darüber hinaus erfordert es in der Regel viel Übung, um die genaue Tiefe der Aspiration zu bestimmen, die für jedes Tier erforderlich ist, da die Farbe des Kortex, des Corpus callosum und des Hippocampus von Maus zu Maus variieren kann (Abbildung 3).
Das Einsetzen und Sichern des bildgebenden Implantats sollte sehr präzise erfolgen, um eine möglichst nahe Position des Bildgebungsfensters zur dorsalen Oberfläche des Hippocampus zu gewährleisten. Die Größe der vorbereiteten Kraniotomie sollte eng mit dem Implantat übereinstimmen und sein Einsetzen ohne nennenswerten Widerstand ermöglichen. Gleichzeitig sollte es keine sichtbare Lücke zwischen dem Schädel und dem Implantat geben, um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten und eine Exposition des Gehirngewebes zu vermeiden. Während der Versiegelung des Schädels sollte ein sanfter und stabiler Druck auf die Oberseite des Implantats ausgeübt werden. Es ist fast unvermeidbar, während der Implantatinstallation Blut unter dem Bildgebungsfenster zu haben. Wenn der chirurgische Eingriff richtig durchgeführt wird, sollte sich das Fenster in 3-7 Tagen aufräumen und das Gefäßsystem des Gehirns wird deutlich sichtbar. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass der Virus ordnungsgemäß unter das Fenster injiziert wird. Im Falle eines fehlgeschlagenen Ausdrucks kann der Virus mehrmals neu ausgelöst werden.
Die Hauptkomplikation, auf die wir in einigen Fällen gestoßen sind, ist die eingeschränkte Sichtbarkeit des Bildgebungsfensters. Es gibt mehrere mögliche Gründe für eine schlechte Bildqualität: i) anhaltende Entzündung; ii) Auswachsen von Bindegewebe auf dem Glas; iii) große Lücke zwischen Fenster und Hippocampus. Entzündungen werden in der Regel durch Kontamination während der Operation oder durch nicht ordnungsgemäß sterilisierte bildgebende Implantate verursacht. Wir empfehlen, die chirurgischen Instrumente vor und nach jeder Operation zu autoklavieren, den Operationsbereich direkt vor dem Eingriff zu desinfizieren und während der Operation eine saubere persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Bildgebende Implantate sollten nach der Montage gereinigt, sterilisiert und unter sterilen Bedingungen gelagert werden. Das Auswachsen von Bindegewebe auf dem Glas des bildgebenden Implantats kann auf eine mechanische Kontamination auf der Oberfläche des Glases oder ein übermäßiges Trauma des Hirngewebes während der Kortexablation zurückzuführen sein. Nach der Montage des Implantats ist es wichtig zu bestätigen, dass die Glasoberfläche sauber und glatt ist. Außerdem müssen alle Teile des beschädigten Hirngewebes sorgfältig entfernt werden, bevor das bildgebende Implantat in die Kraniotomie eingesetzt wird. In bestimmten Fällen führt die Lücke zwischen dem Glasfenster und dem Hippocampus zur Ansammlung von Zerebrospinalflüssigkeit, was die Qualität der Bildgebung verringert. Daher ist es bei der Implantation wichtig, es ganz einzusetzen, um einen guten Kontakt zwischen Hippocampus und Glasfenster zu gewährleisten. Manchmal ist es schwierig, den genauen Grund für das undurchsichtige Imaging-Fenster zu identifizieren. Wir empfehlen, eine Post-Mortem-Analyse durchzuführen, um die Bedingungen unter dem optischen Fenster aufzudecken und nachfolgende Operationen entsprechend anzupassen.
Die Methode weist mehrere grundlegende und technische Einschränkungen auf, die vor und während der In-vivo-Bildgebung berücksichtigt werden sollten. Eine der Haupteinschränkungen ist die Kortexablation. Ein Teil des visuellen und sensorischen Kortex wird während der Operation entfernt. Während es schwierig ist, die Auswirkungen der Kortexablation genau zu bewerten, da entferntes Hirngewebe nicht direkt auf den Hippocampus projiziert wird, zeigten mehrere Studien keine merkliche Beeinträchtigung des hippocampusabhängigen Lernens oder anderer relevanter Hippocampus-Funktionen15,16. Die optischen Einschränkungen sollten ebenfalls berücksichtigt werden, insbesondere wenn Objektive mit hohem NA-Objektiv verwendet werden. Zum Beispiel haben wir in dieser Studie eine 1,75 mm lange Kanüle mit einem Innendurchmesser von 1,9 mm verwendet. Die Geometrie dieser Kanüle bewahrt nicht den vollen NA des Luftobjektivs mit NA mehr als ~ 0,5 oder das Wasserobjektiv mit NA mehr als ~ 0,6, da es etwas Licht abschneiden wird. Eine weitere Einschränkung, die für alle bildgebenden Implantate des Gehirns üblich ist, ist, dass ein Teil des Gehirns exponiert wird, wodurch der Wärmeverlust gefördert wird17,18. Die physiologische Gehirntemperatur kann jedoch während der Bildgebung durch Durchblutung eines warmen Puffers leicht wiederhergestellt werden.
Das beschriebene Verfahren kann leicht modifiziert oder für andere Anwendungen angepasst werden. Beispielsweise kann das Präparat für die Bildgebung von Striatum7angepasst werden. Da das Striatum etwas tiefer liegt als der Hippocampus, sollte die längere bildgebende Kanüle für die Montage des bildgebenden Implantats verwendet werden. Wir empfehlen die Verwendung von 2,0 mm Bildkanüle. Die Koordinaten der Kraniotomie sollten entsprechend angepasst werden (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Darüber hinaus ermöglicht die Virusinjektion über Infusionskanüle die Expression eines Transgens in einer dünnen Schicht von Neuronen bei Verwendung des AAV-Serotyps mit eingeschränkter Ausbreitung19,20. Es ist besonders vorteilhaft für die Ein-Photonen-Bildgebung aufgrund der reduzierten unsauzenten Fluoreszenz aus tieferen Schichten und infolgedessen einer verbesserten Einzelzellauflösung. Darüber hinaus kann die Injektionskanüle auch während der funktionellen Bildgebung zur Verabreichung von Medikamenten oder anderen Chemikalien direkt auf die Neuronen im FOV verwendet werden (Abbildung 5B). Die gesamte Infusionskanüle fügt dem bildgebenden Implantat nützliche Funktionalitäten hinzu, verbessert die Bildgebungsqualität aufgrund der gezielten Virusexpression und ermöglicht die pharmakologische Stimulation von Neuronen im FOV. Die verwendete Kopfplatte bietet eine außergewöhnliche Stabilität des bildgebenden Implantats und minimiert Bewegungsartefakte auch bei sich aktiv bewegenden Tieren auf einem Laufband. Die Kopfplatte ist klein und leicht, verursacht minimale Beschwerden für Tiere und bleibt nach der Installation mehrere Monate lang stabil. Das bildgebende Implantat ist auch kompatibel mit multiphotonenbildenden Bildgebung15,16,21 und kann mit Mikroendoskopen22,23kombiniert werden. Ein ähnliches bildgebendes Implantat wurde auch für die Multiphotonenbildgebung der tieferen Hippocampusstrukturen verwendet, einschließlich Stratum radiatum, Stratum lacunose und Gyrus dentatus16,24,25,26,27. Das Targeting der tieferen Hippocampus-Strukturen mit AAVs über Infusionskanülen kann jedoch eine weitere Optimierung des AAV-Serotyps und des Volumens19erfordern.
Wir glauben, dass das beschriebene Protokoll Studien erleichtern wird, die darauf abzielen, die neuronale Aktivität mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung im Hippocampus von sich verhaltenden Mäusen mit einfachen und erschwinglichen Ein-Photonen-Bildgebungsaufbauten zu untersuchen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern der Molecular BioEngineering Group an der Westlake University für die Hilfe und die nützliche Diskussion. Wir danken auch Jinze Li und Jie-Min Jia von der Westlake University für die Hilfe beim Filmen des chirurgischen Eingriffs.
Diese Arbeit wurde durch Eine Anschubfinanzierung der Foundation of Westlake University, den BBRF Young Investigator Grant 2020 und den Zuschuss der National Natural Science Foundation of China 32050410298 alle an K.D.P.
Materials
| Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
| denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
| Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
| Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
| Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
| Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
| Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
| Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
| Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
| UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
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