إجراء استئصال القحف لتصور الأنشطة العصبية في قرن آمون من الفئران Behaving
Summary
توضح هذه المقالة إعداد نافذة تصوير مصنوعة خصيصا تكملها قنية التسريب وزرعها على منطقة CA1 في قرن آمون في الفئران.
Abstract
تصوير الأنشطة العصبية في قرار خلية واحدة في الحيوانات يتصرف مستيقظا هو نهج قوي جدا للتحقيق في وظائف الدائرة العصبية في نظم علم الأعصاب. ومع ذلك، فإن ارتفاع امتصاص وتناثر الضوء في أنسجة الثدييات يحد من التصوير داخل الجسم في الغالب إلى مناطق الدماغ السطحية، مما يترك مناطق الدماغ العميق، مثل قرن آمون، بعيدة المنال لإجراء المجهر البصري. في هذا الفيديو، نعرض إعداد وزرع نافذة التصوير المصنوعة خصيصا لتمكين التصوير المزمن في الجسم الحي لمنطقة فرس النهر الظهري CA1 في الفئران التي تتصرف بشكل ثابت. يتم استكمال النافذة المصنوعة خصيصا بقنية ضخ تسمح بالتسليم المستهدف لناقلات الفيروس والأدوية إلى منطقة التصوير. من خلال الجمع بين هذا الإعداد والتصوير على نطاق واسع المجال، قمنا بتسجيل طويل الأجل لنشاط الخلايا العصبية باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلوري من مجموعات فرعية كبيرة من الخلايا العصبية في الفئران behaving على مدى عدة أسابيع. كما أظهرنا إمكانية تطبيق هذا الإعداد للتصوير الجهد مع قرار ارتفاع واحد. سمحت المؤشرات المشفرة وراثيا عالية الأداء لنشاط الخلايا العصبية وكاميرات CMOS العلمية بالتصور المتكرر للتفاصيل المورفولوجية دون الخلوية للخلايا العصبية الفردية بدقة زمنية عالية. كما نناقش مزايا والقيود المحتملة للطريقة الموصوفة وتوافقها مع تقنيات التصوير الأخرى.
Introduction
الحصين هو منطقة الدماغ الرئيسية المسؤولة عن التعلم والذاكرة1 وكذلك للملاحة المكانية2. ويرتبط ضمور فرس النهر مع الاضطرابات العصبية والنفسية التي تنطوي على فقدان الذاكرة والتدهور المعرفي3,4,5. في الفئران، قرن آمون هو نموذج راسخ جدا لدراسة المكانية والسياقية، والتعلم النقابي وتكوين الذاكرة على مستويات الخلوية والشبكة4،5. تتطلب الدراسات الميكانيكية للتعلم والذاكرة استجوابا طوليا للبنية العصبية والوظيفة في سلوك الفئران. التصوير الفلوري في تركيبة مع المجسات المشفرة وراثيا6 يوفر قدرات غير مسبوقة لتسجيلدينامياتالجهد الغشاء 7،8، عابري الكالسيوم9، والتغيرات الهيكلية10 على مجموعات فرعية كبيرة من الخلايا العصبية intravitally. ومع ذلك ، يتم إعاقة الوصول البصري إلى قرن آمون في الفئران من قبل القشرة ، والتي يمكن أن تصل إلى أكثر من 1 مم في السماكة. هنا ، وصفنا إجراء لتجميع جهاز تصوير مصنوع خصيصا وزرعه المزمن في رأس الماوس للوصول البصري على المدى الطويل إلى منطقة CA1 دون الإقليمية في قرن آمون الظهري في الفئران behaving. ضخ cannula متكاملة في زرع التصوير يسمح إدارة الفيروسات أو الأدوية مباشرة على الخلايا العصبية في مجال الرؤية. الإعداد الموصوف في تركيبة مع المجهر واسعة المجال تمكن التصوير المتكرر للمجموعات الفرعية الكبيرة من الخلايا العصبية في الفئران تتصرف على مدى فترات طويلة من الزمن. لقد استخدمنا هذا الإعداد للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم والجهد المشفرة وراثيا في منطقة فرس النهر CA1 عن طريق الحقن المستهدف للفيروس المرتبط بال أدينو المؤتلف (rAAV) لتسجيلات نشاط الخلايا العصبية بدقة خلية واحدة. كما قمنا بتصوير الكالسيوم الطولي للمجموعات الفرعية العصبية المقابلة بدقة عالية في سلوك الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الإعداد مع المجهر متعدد الفوتون والتنظير الدقيق ، وبالتالي توسيع مجموعة أدوات تقنيات التصوير لدراسة شبكات الخلايا العصبية على المستويات الخلوية ودون الخلوية في الفئران behaving. وصفنا الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للبروتوكول. كما ناقشنا المزالق والقيود المحتملة للطريقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نصف طريقة للتصوير على المدى الطويل لمنطقة قرن آمون CA1 في الفئران behaving. وتستند هذه الطريقة على زرع مزمن من نافذة التصوير حسب الطلب، والتي تمكن أيضا الإدارة المستهدفة من الفيروسات أو الأدوية مباشرة إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. يتكون هذا البروتوكول من أربعة أجزاء رئيسية: 1) تجميع زرع التصوير؛ و (2) تركيب الغرسات؛ و (2) زراعة الأسنان؛ و (3) زراعة الأسنان؛ و (3) زراعة الأسنان؛ و (ه 2) تركيب زرع التصوير؛ 3) حقن الفيروس عن طريق زرع التصوير؛ 4) التصوير الوظيفي في الفئران behaving. فيما يلي وصف ومناقشة الخطوات الهامة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات والقيود المفروضة على الأسلوب. كما نناقش أهمية الأسلوب وتطبيقاته البديلة المحتملة.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الموصوف التي هي مهمة إلى حد ما لعملية جراحية ناجحة: (1) إعداد زرع التصوير عالية الجودة; ‘2’ الحالات الجراحية العقيمة؛ ‘3’ طموح القشرة؛ ‘4’ وضع غرسة التصوير بدقة؛ ‘5’ الحقن الفيروسي. وكما تشير الخطوة 1.6، فإن القصدير اللحام الزائد سيتطلب استئصال قرنية أكبر وبالتالي يزيد من خطر الالتهاب. من المهم جدا أيضا استخدام كمية مناسبة من الغراء البصري اللاصق عند تثبيت زجاج الغطاء إلى قنية التصوير ، كما هو مبين في الخطوة 1.11 ، حيث أن كمية غير كافية قد تؤدي إلى تسرب السائل النخاعي إلى قنية التصوير وجعلها مبهمة. من ناحية أخرى، يمكن أن يؤدي لاصق بصري الزائدة في انخفاض الشفافية من النافذة الزجاجية. يمكن أن يسبب التلوث المحتمل لزرع التصوير انتشارا نشطا للأنسجة الضامة تحت النافذة البصرية و / أو التهابا شديدا ، مما سيؤدي إلى الإنهاء المبكر للتجربة. لذلك ، فإن تجميع وإعداد غرسة التصوير قبل الجراحة لا يقل أهمية تقريبا عن العملية الجراحية نفسها.
أثناء الجراحة ، يتم استئصال جزء القشرة تحت استئصال القحف من خلال الطموح اللطيف ، مما يؤدي إلى نزيف لا مفر منه. الدم في موقع الجراحة يقلل بشكل كبير من رؤية أنسجة الدماغ التي يجب إزالتها. وهذا يعقد التقييم الدقيق للعمق المطلوب من استئصال الأنسجة. التنظيف الدقيق للموقع الجراحي مع برنامج تلفزيوني في كل مرة قبل تطبيق شفط لإزالة الجزء التالي من الأنسجة يوفر تحكما أفضل في العمق. يجب دائما إزالة أنسجة الدماغ في أجزاء صغيرة خطوة بخطوة مما يؤكد عمق الأنسجة الاجتثاث قبل الشروع في المزيد من الشفط. ويمكن أيضا السيطرة الدقيقة على الشفط يمكن أن يتحقق مع إبرة حادة أرق. نقترح استخدام إبرة 26 G، ومع ذلك، أصغر من قطر 26 G هو أكثر عرضة للانسداد. وعلاوة على ذلك، فإنه عادة ما يستغرق الكثير من الممارسة لتحديد عمق دقيق للطموح المطلوب لكل حيوان، كما لون القشرة، كالوسوم الجسم، وفرس النهر قد تختلف من الماوس إلى الماوس(الشكل 3).
يجب أن يتم إدخال وتأمين زرع التصوير بدقة شديدة لضمان أقرب موضع ممكن لنافذة التصوير إلى السطح الظهري للقرن آمون. يجب أن يتطابق حجم استئصال القحف المعد بشكل وثيق مع الغرسة ويسمح بإدخالها دون مقاومة كبيرة. وفي الوقت نفسه، لا ينبغي أن تكون هناك فجوة مرئية بين الجمجمة والزرع لضمان الختم السليم وتجنب التعرض لأنسجة الدماغ. يجب تطبيق ضغط لطيف ومستقر على الجزء العلوي من الزرع أثناء ختمه على الجمجمة. يكاد يكون من المحتم أن يكون الدم تحت نافذة التصوير أثناء تركيب زرع. إذا تم إجراء العملية الجراحية بشكل صحيح ، فيجب إزالة النافذة في غضون 3-7 أيام ، ويصبح الأوعية الدموية في الدماغ مرئية بوضوح. ومن المهم أيضا التأكد من أن الفيروس يتم حقنه بشكل صحيح تحت النافذة. في حالة فشل التعبير، يمكن إعادة حقن الفيروسات عدة مرات.
المضاعفات الرئيسية التي واجهناها في بعض الحالات هي انخفاض الرؤية لنافذة التصوير. هناك عدة أسباب محتملة لضعف جودة التصوير: ‘1’ الالتهاب المستمر؛ ‘2’ الالتهاب المستمر؛ ‘2’ الإصابة بالالتهاب؛ ‘2’ الإصابة بالالتهاب؛ ‘2’ ال 2) نمو النسيج الضام على الزجاج؛ 3) فجوة كبيرة بين النافذة والحصين. وعادة ما يحدث الالتهاب بسبب التلوث أثناء الجراحة أو عن طريق زرع التصوير غير المعقم بشكل صحيح. نقترح الاستئصال التلقائي للأدوات الجراحية قبل وبعد كل عملية جراحية، وتطهير منطقة الجراحة قبل العملية مباشرة، وارتداء معدات الحماية الشخصية النظيفة أثناء الجراحة. يجب تنظيف غرسات التصوير بعد التجميع والتعقيم وتخزينها في ظروف معقمة. يمكن أن يكون نمو النسيج الضام على زجاج زرع التصوير بسبب التلوث الميكانيكي على سطح الزجاج أو الصدمة المفرطة لأنسجة الدماغ أثناء استئصال القشرة. بعد تجميع الزرع ، من المهم التأكد من أن السطح الزجاجي نظيف وسلس. أيضا، يجب إزالة جميع قطع أنسجة الدماغ التالفة بعناية قبل إدخال زرع التصوير في استئصال القحف. في بعض الحالات، تؤدي الفجوة بين النافذة الزجاجية والحصين إلى تراكم السائل النخاعي، مما يقلل من جودة التصوير. لذلك، أثناء تركيب الزرع، من المهم إدراج كل ذلك في ضمان اتصال جيد بين قرن آمون ونافذة زجاجية. في بعض الأحيان ، من الصعب تحديد السبب الدقيق لنافذة التصوير المبهمة. نقترح إجراء تحليل ما بعد الوفاة للكشف عن الظروف تحت النافذة البصرية وتعديل العمليات الجراحية اللاحقة.
وبهذه الطريقة عدة قيود أساسية وتقنية ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار قبل وأثناء التصوير في الجسم الحي. أحد القيود الرئيسية هو استئصال القشرة. تتم إزالة جزء من القشرة البصرية والحسية أثناء الجراحة. في حين أنه من الصعب تقييم تأثير استئصال القشرة بدقة ، حيث أن أنسجة الدماغ التي تمت إزالتها لا تظهر مباشرة على قرن آمون ، أظهرت العديد من الدراسات عدم وجود ضعف ملحوظ في التعلم المعتمد على فرس النهر أو وظائف قرن آمون الأخرى ذات الصلة15،16. وينبغي أيضا النظر في القيود البصرية ، وخصوصا عندما تستخدم العدسات عالية NA الهدف. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، استخدمنا قنية طولها 1.75 مم بقطر داخلي 1.9 ملم. هندسة هذه القنية لن تحافظ على NA الكامل من هدف الهواء مع NA أكثر من ~ 0.5 أو هدف المياه مع NA أكثر من ~ 0.6 كما أنها سوف مقطع بعض الضوء. وهناك قيد آخر، شائع لجميع يزرع تصوير الدماغ، هو أن جزءا من الدماغ هو الحصول على يتعرض، وبالتالي تعزيز فقدان الحرارة17،18. ومع ذلك، يمكن استعادة درجة حرارة الدماغ الفسيولوجية بسهولة أثناء التصوير عن طريق التشوه من عازل دافئ.
يمكن تعديل الطريقة الموصوفة بسهولة أو تعديلها للتطبيقات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن تكييف التحضير لتصوير المخطط7. كما يضع المخطط أعمق قليلا من قرن آمون، وينبغي استخدام قنية التصوير أطول لتجميع زرع التصوير. نقترح استخدام قنية تصوير 2.0 مم. يجب تعديل إحداثيات استئصال القحف في المقابل (AP: +0.8 مم، ML: −1.8 مم). وبالإضافة إلى ذلك، حقن الفيروس عن طريق ضخ cannula يسمح تحقيق التعبير عن متحولة في طبقة رقيقة من الخلايا العصبية عند استخدام النمط المصلي AAV مع انتشار مقيد19،20. وهو مفيد بشكل خاص للتصوير الفوتون الواحد بسبب انخفاض الفلورسينس خارج التركيز من الطبقات العميقة ، ونتيجة لذلك ، تحسين التصوير بدقة الخلية الواحدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام قنية الحقن أثناء التصوير الوظيفي لإدارة الأدوية أو غيرها من المواد الكيميائية مباشرة على الخلايا العصبية في FOV(الشكل 5B). يضيف القنية التسريبية بشكل عام وظائف مفيدة لزرع التصوير ، مما يحسن جودة التصوير بسبب التعبير الفيروسي المستهدف وتمكين التحفيز الدوائي للخلايا العصبية في FOV. لوحة الرأس المستخدمة يوفر الاستقرار غير عادية من زرع التصوير التقليل من القطع الأثرية الحركة حتى في الحيوانات تتحرك بنشاط على حلقة مفرغة. لوحة الرأس صغيرة وخفيفة ، مما يسبب الحد الأدنى من عدم الراحة للحيوانات ، ويظل مستقرا لعدة أشهر بعد التثبيت. كما تتوافق عملية زرع التصوير مع التصوير المتعدد الفوتون15و16و21 ويمكن دمجها مع المناظير الدقيقة22و23. كما تم استخدام زرع تصوير مماثل للتصوير متعدد الفوتون لهياكل قرن آمون الأعمق ، بما في ذلك stratum radiatum ، لاكونوز ستراتوم ، وgyrus dentate16،24،25،26،27. ومع ذلك، قد استهداف هياكل قرن آمون أعمق مع AAVs عن طريق قنية التسريب تتطلب المزيد من التحسين من النمط المصلي AAV وحجم19.
ونحن نعتقد أن البروتوكول الموصوف سيسهل الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في نشاط الخلايا العصبية مع ارتفاع دقة الصدغية في قرن آمون من الفئران behaving باستخدام بسيطة وبأسعار معقولة واحد فوتون التصوير الاجهزة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جميع أعضاء مجموعة الهندسة الحيوية الجزيئية في جامعة ويستليك على كل المساعدة والمناقشة المفيدة. كما نشكر جينزي لي وجي مين جيا من جامعة ويستليك على المساعدة في تصوير العملية الجراحية.
وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة جامعة ويستليك، ومنحة المحقق الشاب لعام 2020 من BBRF، ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 32050410298 كل ذلك إلى K.D.P.
Materials
| Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
| denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
| Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
| Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
| Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
| Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
| Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
| Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
| Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
| UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
References
- Leutgeb, S., et al. Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity – towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).
- Henneman, W. J. P., et al. Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease. Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).
- Camicioli, R., et al. Parkinson’s disease is associated with hippocampal atrophy. Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).
- Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience. Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).
- Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
- Fan, L. Z., et al. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1. Cell. 180 (3), 521-535 (2020).
- Shemesh, O. A., et al. Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
- Villa, K. L., et al. Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo. Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Subach, O. M., et al. Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Roche, M., et al. In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation. eLife. 8, 47324 (2019).
- Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. . Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse’s inferior colliculus. Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).
- Attardo, A., et al. Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Castello-Waldow, T. P., et al. Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations. PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).
