JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Published: July 24, 2021
doi:
10.3791/62266
, , ,
1School of Life Sciences,Westlake University, 2Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, 3Institute of Basic Medical Sciences,Westlake Institute for Advanced Study, 4School of Basic Medical Sciences,Xi’an JiaoTong University, 5Office of Public Affairs,Westlake University, 6School of Pharmaceutical Sciences,Jilin University

Summary

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Abstract

Beeldvorming neuronale activiteiten bij eencellige resolutie bij wakkere zich gedragende dieren is een zeer krachtige benadering voor het onderzoek van neurale circuitfuncties in de neurowetenschappen van systemen. Echter, hoge absorptie en verstrooiing van licht in zoogdierweefsel beperken intravitale beeldvorming meestal tot oppervlakkige hersengebieden, waardoor diepe hersengebieden, zoals de hippocampus, buiten bereik blijven voor optische microscopie. In deze video laten we de voorbereiding en implantatie van het op maat gemaakte beeldvormingsvenster zien om chronische in vivo beeldvorming van het dorsale hippocampale CA1-gebied in head-fixed behaving muizen mogelijk te maken. Het op maat gemaakte venster wordt aangevuld met een infuuskanule die gerichte levering van virale vectoren en geneesmiddelen aan het beeldvormingsgebied mogelijk maakt. Door dit preparaat te combineren met wide-field imaging, voerden we een langetermijnregistratie uit van neuronale activiteit met behulp van een fluorescerende calciumindicator van grote subsets van neuronen bij zich gedragende muizen gedurende meerdere weken. We hebben ook de toepasbaarheid van dit preparaat voor spanningsbeeldvorming met single-spike resolutie aangetoond. Hoogwaardige genetisch gecodeerde indicatoren van neuronale activiteit en wetenschappelijke CMOS-camera’s maakten de terugkerende visualisatie van subcellulaire morfologische details van afzonderlijke neuronen met een hoge temporele resolutie mogelijk. We bespreken ook de voordelen en mogelijke beperkingen van de beschreven methode en de compatibiliteit ervan met andere beeldvormingstechnieken.

Introduction

De hippocampus is een belangrijk hersengebied dat verantwoordelijk is voor leren en geheugen1 en voor ruimtelijke navigatie2. Hippocampale atrofie wordt geassocieerd met neurologische en psychiatrische aandoeningen met geheugenverlies en cognitieve achteruitgang3,4,5. Bij muizen is de hippocampus een zeer bekend model om ruimtelijk, contextueel en associatief leren en geheugenvorming te bestuderen op cellulaire en netwerkniveaus4,5. De mechanistische studies van leren en geheugen vereisen longitudinale ondervraging van neuronale structuur en functie bij zich gedragende muizen. Fluorescentiebeeldvorming in combinatie met genetisch gecodeerde sondes6 biedt ongekende mogelijkheden om membraanspanningsdynamiek7,8, calciumtransiënten9en structurele veranderingen10 over grote subsets van neuronen intravitaal vast te leggen. Optische toegang tot de hippocampus bij muizen wordt echter belemmerd door de cortex, die meer dan 1 mm dik kan worden. Hier beschreven we een procedure voor het assembleren van een op maat gemaakt beeldvormingsapparaat en de chronische implantatie ervan in de muiskop voor langdurige optische toegang tot de CA1-subregio van de dorsale hippocampus bij zich gedragende muizen. Infusie canule geïntegreerd in het beeldimplantaat maakt toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks op de neuronen in het gezichtsveld mogelijk. Het beschreven preparaat in combinatie met wide-field microscopie maakt terugkerende beeldvorming van de grote subsets van neuronen in zich gedragende muizen over lange perioden mogelijk. We gebruikten dit preparaat om calcium- en spannings genetisch gecodeerde indicatoren in hippocampaal CA1-gebied uit te drukken via gerichte injectie van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) voor neuronale activiteitsopnamen bij eencellige resolutie. We voerden ook longitudinale calciumbeeldvorming uit van de overeenkomstige neuronale subsets bij een hoge spatiotemporale resolutie bij zich gedragende dieren. Bovendien is dit preparaat compatibel met multifotonenmicroscopie en micro-endoscopie, waardoor de toolbox van beeldvormingstechnieken verder wordt uitgebreid om neuronale netwerken op cellulaire en subcellulaire niveaus bij zich gedragende muizen te bestuderen. We beschreven kritieke stappen en probleemoplossing van het protocol. We bespraken ook de mogelijke valkuilen en beperkingen van de methode.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Westlake University. 1. Implantatie OPMERKING: De montage van het beeldimplantaat is technisch eenvoudig en vereist alleen in de handel verkrijg beschikbare artikelen (figuur 1, zie ook tabel met materialen). De kopplaten kunnen in de plaatselijke machinewerkplaats worden vervaardigd met behulp van roestvrijstalen of titanium platen. We raden u aan een voorraad volledig geassembleerde implantaten voor te bereiden voordat u met de operaties begint. Nadat in vivo experimenten zijn gedaan, kunnen de implantaten meerdere keren worden hersteld en hergebruikt. In sommige gevallen hoeft de infuuskanule alleen opnieuw te worden bevestigd door het afdekglas te solderen of te vervangen. Bereid alle zes de belangrijkste hardwarecomponenten voor voor het assembleren en installeren van beeldvormingsimplantaten (figuur 1). Figuur 1: Zes belangrijke hardwarecomponenten voor de montage en installatie van het beeldimplantaat. (A) Dummy canule. (B) Gids canule. (C) Beeldvorming canule. (D) Glasafdekkingsglas. (E) Kopplaat. (F) Interne canule. Schaalbalk: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Schakel het lasapparaat in en verwarm het tot de gewenste temperatuur.OPMERKING: De temperatuur is afhankelijk van het gebruikte lasblik. Polijst het zijoppervlak van de beeldvormende canule met fijn schuurpapier om de oxidatielaag te verwijderen en zo sterker solderen te vergemakkelijken. Pas de positie van de beeldvormende canule en injectiekanule (geleidekanule met ingebrachte dummy canule) aan met behulp van helpende handen(figuur 2A,B). Breng met behulp van een spuit met een naald gedurende 5 seconden een kleine hoeveelheid geschikte flux aan op de verbindingsplek tussen beeldvorming en het injecteren van canules en verwijder vervolgens de druppel.OPMERKING: Voor dit preparaat hebben we een in de handel verkrijgbare flux gebruikt die door de fabrikant is gespecificeerd voor het solderen van roestvrijstalen onderdelen, omdat beeldvormings- en infusieblikken van roestvrij staal zijn gemaakt. In het geval van andere materialen die worden gebruikt voor de vervaardiging van canules, moet de eindgebruiker flux selecteren die het geselecteerde materiaal kan lassen. Smelt soldeerblik en breng het aan op de met flux behandelde verbindingsvlek (figuur 2).OPMERKING: Vermijd overtollig soldeerblik, omdat het tijdens de operatie onnodige grotere craniotomie vereist. Figuur 2: Schematische montage van injectiekanule, bestaande uit geleidekanule met ingebrachte dummy canule, met de beeldvormende canule. (A) De hoek tussen de injectiekanule en de beeldvormende canule moet proximately 45 graden zijn. (B) De punt van de injectiekanule moet zich direct aan de rand van de beeldvormende canule zitten. (C) Een geschikte grootte van het lasblik dat wordt gebruikt om beeldvorming en injectie canules te solderen (rode lijn geeft de omtrek van de tindruppel aan). (D) Onjuiste grootte van het lasblik dat moet worden vermeden tijdens de voorbereiding van het implantaat (rode lijn geeft de omtrek van de tindruppel aan). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Wacht tot het soldeerblik is afgekoeld. Meestal duurt het enkele seconden. Controleer of de injectiekanule niet wordt geblokkeerd door de dummy canule uit beide richtingen in te brengen. Breng UV-uithardende optische lijm aan de onderkant van de beeldvormende canule aan met behulp van een tandenstoker of 26 G spuitnaald. Gebruik een fijn pincet om voorzichtig een afdekglas van de overeenkomstige grootte aan de beeldvormende canule te plaatsen.OPMERKING: De plaatsing van het glas moet precies op de beeldvormingskannula worden uitgevoerd zonder het glas te veel te bewegen nadat het de optische lijm heeft aangeraakt. Anders wordt het glas vuil, waardoor de kwaliteit van de beeldvorming wordt verminderd. Hard de lijm minstens een uur uit met 350-400 nm UV-verlichting van een standaard handheld UV-lamp.OPMERKING: De gebruikte lijm moet optisch transparant zijn. Anders vermindert het de kwaliteit van het beeldvenster.LET OP: Vermijd blootstelling aan huid en ogen door uv-beschermende brillen, handschoenen en een laboratoriumjas te dragen. Was de canule in 70% ethanol, droog aan de lucht en bewaar in een steriele container tot de operatie.OPMERKING: Het is erg belangrijk om het afdekglas zo schoon en intact mogelijk te houden. De gebruikte optische lijm is chemisch stabiel in 70% ethanol. 2. Raamimplantatie Voorbereidingsstappen voor de operatie Steriliseer alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf. Bereid 1x PBS en 70% ethanol in twee aparte Petrischaaltjes. Optioneel: Desinfecteer het operatiegebied met UV-licht gedurende ten minste 20 minuten voordat u met de chirurgische ingreep begint.OPMERKING: Werken onder de meest steriele omstandigheden zal resulteren in succesvolle en langdurige (tot 6 maanden) met glas bedekte schedelramen. Besmetting kan in de meeste gevallen leiden tot verminderde transparantie van het venster of ernstige ontsteking. Chirurgische ingreep Steriliseer het operatiegebied vlak voor de operatie met 70% ethanol. Weeg het dier en dien een prechirurgische dosis analgeticum subcutaan toe volgens het door de IACUC goedgekeurde dierprotocol. Verdoof een muis met isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% voor onderhoud, 0,3-0,5 L/min debiet van lucht). Gebruik een staartknijp- en teenknijptechniek om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoofd is. Observeer vitale functies van het dier, zoals ademhaling, SpO2en hartslag gedurende de duur van de procedure. Gebruik een trimmer of ontharingscrème om de vacht van de achterkant van de nek tot aan de ogen te verwijderen. Plaats de muis in een stereotaxisch frame boven een operatiekussen (met behoud van 37 °C). Zet het hoofd vast met oorstangen. Duw het hoofd lichtjes in alle richtingen om ervoor te zorgen dat het hoofd stevig is vastgezet. Breng oogzalf aan om te voorkomen dat de ogen van het dier uitdrogen tijdens de operatie. Steriliseer de chirurgische plaats met betadine gevolgd door 70% ethanol driemaal voordat u een incisie maakt. Verwijder de huid over de bovenkant van de schedel, te beginnen met een horizontale snede langs de basis van het hoofd, gevolgd door twee sneden in de rostrale richting, bijna de oogleden bereikend, vervolgens twee schuine sneden die samenkomen in de middellijn. Trek met twee steriele wattenstaafjes het verbindingsweefsel, evenals het spierstelsel van de achterkant van de nek, terug naar de randen van de schedel.OPMERKING: Probeer beschadiging van bloedvaten (vooral die verborgen in de spier) tijdens manipulatie te voorkomen. Breng gedurende 2 minuten een druppel lidocaïneoplossing (~0,1 ml) aan op het oppervlak van het periosteum om overmatige pijn te voorkomen. Optioneel om de hersenen te verminderen van zwelling na het verwijderen van de schedel, kan 0,1 ml 1% dexamethason subcutaan worden geïnjecteerd. Schraap voorzichtig het hele blootgestelde deel van de schedel met een scalpel om een droog en ruw oppervlak te creëren waardoor lijm en het tandcement beter kunnen hechten en dus resulteren in chronische implantatie. Plaats de punt van de naald gemonteerd op het stereotaxic station op de bregma, stel alle drie de coördinaten in (AP: Anterior-Posterior; ML: Mediaal-Lateraal; DV: Dorsaal-Ventral) als 0. Plaats de punt van de naald op de lambda en kijk of de AP-coördinaat 0 is om te bevestigen dat de hoofdpositie verticaal is, en of de ML-coördinaat 0 is om te bevestigen dat de kop horizontaal is geplaatst. Zo niet, stel dan de overeenkomstige knoppen op het stereotaxic-station in, totdat de AP- en ML-coördinaten beide binnen 0,1 mm liggen. Beweeg de punt van de naald om de overeenkomstige punten voor craniotomie te vinden en markeer hun posities op de schedel met behulp van een fijne marker. In het geval van implantatie voor hippocampus zijn er 4 punten met de volgende coördinaten (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) en (AP: -2,18, ML: -3,5) 11 , evenals (AP: -2,18, ML: -0,5) en (AP: -2,18, ML: -3,5) 11 , evenals (AP: -3,5)11, evenals (AP: -3,5)OPMERKING: De marker die in deze stap wordt gebruikt, moet ten minste een uur voor de operatie met UV-verlichting worden gesteriliseerd. De hier getoonde coördinaten zijn voor 6-8 weken oude C57BL/6J muizen. De coördinaten kunnen verschillen als gevolg van verschillende leeftijden of stammen van muizen. Teken een cirkel op basis van vier gemarkeerde punten, evenals de omtrek van het injectiekanulegebied aan de staartzijde van de cirkel (figuur 3). Gebruik een pneumatische boor met een snelheid van 10.000 tpm om voorzichtig langs de omtrek op de schedel te “tekenen”. Boor de schedel totdat er een zeer dunne laag bot overblijft, die meestal begint te wiebelen onder zachte aanraking in het midden. Breng een druppel steriele 1x PBS aan op het midden van de craniotomie, til de botflap van de schedel met een zeer dunne tip forceps of twee 26 G naalden die van tegenovergestelde kanten naderen.OPMERKING: De PBS helpt het stukje schedel te verwijderen en mogelijke bloedingen van de dura12te voorkomen. Breng PBS aan, gevolgd door een zachte aspiratie door een stompe naald van 26 G meerdere keren om het oppervlak van de dura te reinigen. Verwijder de dura voorzichtig, hetzij door aspiratie of door een oogheelkundige schaar. Breng zachte zuigkracht (~-60kPa) aan om de cortex en het corpus callosum boven de hippocampus te ablaten.OPMERKING: De cortex is vaak meer geel dan het corpus callosum en het corpus callosum is meestal witter dan de hippocampus. Het corpus callosum is meestal gemakkelijk te onderscheiden door neuronale vezels die in verticale en horizontale richtingen gaan wanneer ze van bovenaf worden waargenomen (Figuur 3). Figuur 3: Stereotaxische coördinaten van hippocampuslocatie en hersenablatieproces. (A) Vier coördinaten voor de randen van het craniotomiegebied. (B) Volledig craniotomiegebied. (C-E) Representatieve beelden verkregen tijdens de operatie (links) en hun schematische diagram (rechts) die de verschillende kleuren en richtingen van neurale vezels van (A) Cortex (B) Corpus Callosum en (C) Hippocampus zichtbaar tijdens cortex ablatie aangeven. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Bloedingen op dit punt zullen de zichtbaarheid van het hersenweefsel in de craniotomie beïnvloeden. Breng 1x PBS aan, gevolgd door een zachte zuiging, terwijl u de cortex aanzuigt om van het bloed af te komen.OPMERKING: Continue bloeding is onvermijdelijk tijdens deze stap en tot op zekere hoogte is continue bloeding een teken van een normale bloeddruk. In tegenstelling tot cortex imaging window implantatie, is de aanwezigheid van bloed onder het optische venster acceptabel, omdat het enkele dagen na de operatie zal worden gewist. Het zo snel mogelijk inbrengen van de beeldvormende canule in de gecreëerde holte na het ablating van de cortex is optimaal. Als de craniotomie met <0,5 mm groter is dan de beeldvormende canule, red dan de installatie van de canule tot op zekere hoogte door extra Kwik Sil-afdichting te gebruiken voordat u het implantaat met SuperBond bevestigt. Als de craniotomie met <0,5 mm kleiner is dan beeldvormende canule, redt u de chirurgische procedure tot op zekere hoogte door de rand van de craniotomie bij te snijden met een fijn pincet of een oogheelkundige schaar, omdat het resterende bot aan de rand van de craniotomie dunner is dan de schedel zelf als gevolg van boren.OPMERKING: Craniotomieën die het bereik van meer dan 0,5 mm overschrijden, kunnen niet worden gered. De overeenkomstige acties in die gevallen moeten de beëindigingsprocedure volgen volgens het dierprotocol. Plaats het implantaat voorzichtig in de craniotomie. Druk stevig op het implantaat met de L-vormige naald om het optische venster van het implantaat zo dicht mogelijk bij het blootgestelde oppervlak van de hippocampus te plaatsen. Breng pbs herhaaldelijk aan op de schedel rond het implantaat, gevolgd door afzuiging om bloed zoveel mogelijk te verwijderen tijdens het inbrengen van het implantaat. Breng vervolgens een dun laagje Kwik Sil aan tussen het implantaat en de schedel om te voorkomen dat tandcement onder de schedel doordringt (figuur 4). Zorg ervoor dat de plaatsing van het optische venster van het implantaat recht tegen hippocampus is om bloed of andere vloeibare accumulatie eronder te voorkomen.OPMERKING: Het kritieke punt is om ervoor te zorgen dat het afdekglas van de beeldvormingskannula recht tegen de hippocampus wordt geplaatst, wat tijdens het installatie- en afdichtingsproces een zachte druk op de canule kan vereisen. Of de bovenkant van de beeldvormende canule evenwijdig is aan de schedel is niet van cruciaal belang voor de uiteindelijke optische toegang zolang het optische venster tegen de hippocampus wordt geplaatst. Volgens de gemiddelde dikte van de cortex boven het CA1-gebied, houdt u het bovenste oppervlak van de beeldvormende canule ~0,5 mm boven het schedeloppervlak om de bevestiging van de canule aan de schedel te vergemakkelijken (Figuur 4). Zodra de Kwik Sil is uitgehard, wat meestal niet meer dan ~ 1 minuut duurt, brengt u Super-Bond C&B gelijkmatig aan op het oppervlak van de schedel, het oppervlak van Kwik-Sil en het bovenste oppervlak van het implantaat. Zodra de Super-Bond C&B is genezen, breng je kunstgebitbasishars aan boven de Super-Bond C&B, evenals de huid rond de incisie die aan het begin van de operatie is gemaakt.OPMERKING: Alternatieve cementsoorten zijn verkrijgbaar bij meerdere leveranciers. Volg de instructies van de fabrikant. Nadat de basishars van het kunstgebit is uitgehard, plaatst u de hoofdplaat op de hars rond het implantaat en maakt u deze concentrisch met de beeldvormende canule. Breng meer kunstgebitbasishars rond en boven de hoofdplaat aan om de positie te bevestigen. Laat het enkele minuten uitharden. Vermijd het opbouwen van een dikke laag cement rond de canule om een betere toegang tot het beeldvenster met de objectieve lens te garanderen (Figuur 4). Figuur 4: Schematisch schema van raamimplantatie in (A) coronale en (B) sagittale weergave. a) kopplaat; b) gebitsbasishars; c) Superbond; d)Kwik-Sil; e) Beeldvormende canule; f) Injectie canule; (g) Soldeerblik. (C): Muis met het geïnstalleerde implantaat na de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Verdun de basishars van het kunstgebit om de viscositeit te verminderen, waardoor het de kanttekeningen kan vullen die moeilijk te bereiken zijn met een applicator. Plaats voorzichtig een geïsoleerde rubberen tape boven het raam om het raam te beschermen tegen mogelijke verontreiniging door dierenbedden. Wanneer de operatie is voltooid, injecteer anti-inflammatoire drug subcutaan om een ontstekingsreactie te voorkomen. Plaats het dier in een warme kooi totdat het herstelt van anesthesie. Controleer de gezondheidsstatus van de muis gedurende 72 uur na de operatie door algemeen gedrag te observeren. Ontstekingsremmend medicijn en pijnstiller worden gedurende twee tot drie dagen na de operatie subcutaan geïnjecteerd om elke 24 uur pijn vrij te geven en de ontstekingsreactie te verminderen.OPMERKING: Alternatieve controleprocedures, geneesmiddelen en doseringen zijn mogelijk voor postoperatieve zorg, raadpleeg het door de IUCAC goedgekeurde dierprotocol voor de exacte procedure. Controleer het venster 5-7 dagen na de operatie om vasculatuur onder het raam te observeren. In het geval van een duidelijk venster is het dier klaar voor virusinjectie. 3. Virusinjectie OPMERKING: Virusinjectie wordt meestal gedaan in 5-7 dagen na de operatie. Vóór virusinjectie moet worden bevestigd dat het beeldvormingsvenster duidelijk is en dat het mogelijk is om vasculatuur van de hersenen te observeren (figuur 5). In sommige gevallen kan het tot 14-16 dagen duren om het venster te wissen, wat ook acceptabel is als er geen hersenontsteking wordt gedetecteerd. Figuur 5: Representatief beeld van optisch venster (A) voor en (B) na virusinjectie aangevuld met FastGreen kleurstof. Pijl geeft dezelfde vasculatuurstructuur aan. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Voeg snelgroene kleurstofbouillonoplossing toe aan virusoplossing, verdund tot de gewenste titer, in de verhouding van 1:9 in een PCR-buis.OPMERKING: Snelle groene kleurstof wordt toegevoegd om visualisatie van virusoplossing tijdens de injectie te vergemakkelijken. Sluit de polyethyleenslang aan op de spuit en vul de slang vervolgens op met minerale olie met behulp van een spuitpomp. Sluit de interne canule aan op het andere uiteinde van de slang, infuseer en trek de minerale olie een paar keer terug om ervoor te zorgen dat de interne canule niet verstopt is. Verdoof het dier met isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% voor onderhoud, 0,3-0,5 L/min debiet van lucht), bevestig het hoofd in een stereotaxic frame over een verwarmingskussen (handhavend 37 °C), breng oogzalf aan. Trek 600 nL van de virusoplossing terug, verwijder de dummy canule en steek de interne canule die op de injectiespuit is aangesloten in de geleidekanule, infuseer het virus met een snelheid van 50 nL/min gedurende in totaal 10 minuten.OPMERKING: Controleer of de kleurstof zichtbaar is door het venster met behulp van een stereomicroscoop om een succesvolle virusinjectie te bevestigen (Figuur 5). Houd na injectie de interne canule 10 minuten verbonden om het virus onder het raam te laten verspreiden. Verwijder voorzichtig de interne canule uit de geleidekanule en vat deze samen met een dummy canule. Plaats het dier in een warme kooi totdat het herstelt van de anesthesie.OPMERKING: Meestal zijn muizen klaar voor beeldvorming binnen 10-20 dagen na virale injectie. Expressieniveau en -tijd zijn afhankelijk van het virusserotype en de promotor die worden gebruikt om genexpressie te stimuleren. 4. Beeldvorming van wakkere muizen onder breedveldmicroscoop. OPMERKING: De voorbereide hoofdplaat biedt buitengewone stabiliteit van beeldvormingsimplantaten en maakt dus longitudinale beeldvorming mogelijk bij wakkere en zich gedragende muizen met minimale bewegingsartefacten. Induceer de muis met 4% isofluraan gedurende een paar minuten, bevestig de kopplaat aan de kopvork en bevestig vervolgens de kopvork aan de loopband.OPMERKING: De kopvork en de loopband zijn aangepast voor de hoofdplaat die in dit onderzoek wordt gebruikt, zie Ondersteunende materialen voor de bijbehorende cad-bestanden. Inductie van de muis vóór hoofdfixatie is optioneel omdat het mogelijk is om dieren te gewennen voor deze procedure. Beweeg de loopband onder het microscoopstadium en plaats het optische venster onder de objectieve lens. Gebruik een lens met een lage vergrotingsdoelstelling om het beste gezichtsveld (FOV) voor functionele beeldvorming te vinden en schakel vervolgens over naar een hogere NA-objectieve lens om de neuronale activiteiten bij eencellige resolutie vast te leggen.OPMERKING: Als de injectiekanule nog steeds een obstakel is voor de objectieve lens om zijn werkafstand te bereiken, gebruik dan een tondeuse om de injectiekanule van de kopplaat af te snijden.

Representative Results

In vivo beeldvorming van neuronale activiteit met behulp van een genetisch gecodeerde calciumindicator. Gemiddeld begint in vivo beeldvorming 3-4 weken na implantatie als een voldoende niveau van transgene expressie wordt bereikt. Tegen die tijd zijn hersenoedeem en bloeding meestal volledig verdwenen en kan vasculatuur van de hersenen gemakkelijk worden waargenomen door het optische venster. Hier gebruikten we de beschreven voorbereiding om de herhaalde opnames van neuronale activiteit in het dorsale hippocampale CA1-gebied uit te voeren bij het gedragen van muizen onder fluorescentie-breedveldmicroscoop. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een heldere genetisch gecodeerde calciumindicator, genaamd NCaMP713, die vergelijkbare calciumgevoeligheid en temporele resolutie vertoont als die van GCaMP6s14. Om de NCaMP7-indicator in de hippocampus uit te drukken, injecteerden we het rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-virus met behulp van een infuuskanule en startten we de beeldvorming van de lengtegraad na 14 dagen na de injectie. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een 10x NA 0.3 lucht objectieflens en Hamamatsu OrcaFusion sCMOS camera die beeldvorming mogelijk maakte bij ~1,5×1,5 mm FOV bij een frequentie tot 100 Hz. Groene fluorescentie werd opgewekt door een in de handel verkrijgde 470 nm LED met behulp van een standaard GFP-filterset. De gemiddelde diepte van beeldvorming bereikt in groen kanaal is ongeveer 50-120 μm, waardoor opname van neuronale activiteit voornamelijk in stratum oriens en stratum pyramidale mogelijk is. Beelddiepte in bijna-infraroodkanalen kan tot 200 μm zijn en de diepere lagen hippocampusbereiken 8. De gemiddelde opnametijd per FOV was 6-12 min, hoewel veel langere beeldvormingssessies mogelijk zijn omdat NCaMP7 wordt gekenmerkt door extreem hoge fotostabiliteit en er geen detecteerbare fototoxiciteit werd waargenomen (Figuur 6). Figuur 6: Registratie van de neuronale activiteit in de hippocampale neuronen met behulp van een groene fluorescentie genetisch gecodeerde calciumindicator. (A) Een geselecteerde FOV afgebeeld onder een breedveldfluorescentiemicroscoop in groen kanaal. (B) De 15 URI’s die overeenkomen met de afzonderlijke neuronen die in A worden weergegeven en geselecteerd met behulp van de standaarddeviatieprojectie van de gehele opname. (C) Representatieve fluorescentie single-trial sporen van de 15 geselecteerde neuronen in B. (D) Een representatieve inzoomweergave van 2 calciumsporen weergegeven in overeenkomstige kleurvakken weergegeven in C. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Om fluorescentiesporen te verkrijgen, werden de regio’s van belang (ROIs) die overeenkomen met neuronale soma’s handmatig gesegmenteerd en geanalyseerd door ImageJ-software. Voorafgaand aan de bewegingscorrectie van de beeldanalyse waren veel voorkomende procedures na opname bij wakkere dieren niet vereist, omdat de verworven datasets geen bewegingsartefacten vertoonden vanwege de hoge stabiliteit van beeldimplantaten. Een representatieve optische opname in één proef van neuronale activiteiten van de hippocampus in een wakkere scheermuis wordt gepresenteerd in figuur 6. 15 ROIs die overeenkomen met neuronale soma ‘s werden handmatig geselecteerd uit dezelfde FOV in figuur 6B, en de fluorescentiesporen in één studie binnen elke ROI zijn weergegeven in figuur 6C. Figuur 6D toont twee representatieve delen van fluorescentiesporen van twee verschillende ROV’s. We voerden 4 opeenvolgende beeldvormingssessies uit voor dezelfde FOV met intervallen van 3 dagen. Het was mogelijk om dezelfde neuronen in bepaalde FOV’s gedurende ten minste twee weken te identificeren en in beeld te brengen (de langere beeldvormingssessies werden niet uitgevoerd voor deze studie, maar hetzelfde preparaat is gebruikt voor maximaal 6 maanden durende beeldvormingsstudie bij muizen voorheen7; Figuur 7). In deze studie gebruikten we AAV/ DJ-CAG-vector, die zelfs 21 dagen na de levering van het virus een sterke expressie van het interesse gen aandreef (Aanvullende figuur 1). De continue expressie gecompliceerde langetermijnidentificatie van dezelfde neuronen als gevolg van verhoogde fluorescentieachtergrond en uiterlijk van nieuwe neuronen die de calciumindicator uitdrukken. Daarom moet de selectie van het AAV-serotype en de promotor om de expressie van doelgen te stimuleren een van de belangrijke overwegingen zijn bij het experimentele ontwerp, met name als longitudinale beeldvorming van dezelfde subset van neuronen vereist is. De beeldvormingskwaliteit maakte het mogelijk om proximale dendrieten op te lossen en bloedvaten te visualiseren. Figuur 7: Beeldsequentie van vier verschillende FOV’s uit het hippocampale gebied die gedurende 12 dagen worden gevolgd. Het dier werd op dag 0 met het raam geïmplanteerd en op dag 7 geïnjecteerd met het rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-virus. Pijlpunten geven het neuron aan dat binnen de FOV wordt gevolgd. Schaalbalken: 80 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. In vivo beeldvorming van neuronale activiteit met behulp van een genetisch gecodeerde spanningssensor.In deze studie gebruikten we ook een nieuwe genetisch gecodeerde spanningssensor, genaamd SomArchon7, die spanningsbeeldvorming met eencellige single-spike resolutie mogelijk maakt bij het gedragen van dieren7,8. Om SomArchon uit te drukken, injecteerden we het rAAV/DJ-CAG-SomArchon-virus met behulp van een infuuskanule en voerden we enkele dagen na de injectie spanningsbeeldvorming uit in een hoofd-vaste scheermuis. Om neuronale activiteit vast te leggen, gebruikten we een 40x NA 0.8 objectieve lens en Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-camera waarmee we 150×40 μm FOV konden afbeelden met een acquisitiesnelheid tot 830 Hz. Het GFP-eiwit, dat een deel van SomArchon construeert om visualisatie van expressie in het zichtbare bereik van het spectrum te vergemakkelijken, kan gemakkelijk worden afgebeeld in het groene kanaal (LED-excitatie bij 470/20 nm, emissie 525/50 nm) om cellen te lokaliseren die van belang zijn voor spanningsbeeldvorming. Optische spanningsopnamen werden uitgevoerd in het bijna-infraroodkanaal (laser excitatie 637 nm bij 3,4 W/mm2, emissie 665 nm lange pas) met 4 x 4 binning bij 830 Hz acquisitiesnelheid. We registreerden de spontane activiteit van een hippocampaal neuron in een wakkere muis met een gemiddelde SNR van 7 per actiepotentiaal (Figuur 8). Figuur 8: Registratie van de neuronale activiteit in de hippocampale neuronen met behulp van een bijna-infrarood fluorescentie genetisch gecodeerde spanningsindicator SomArchon. (A) Een geselecteerde FOV afgebeeld onder breedveldfluorescentiemicroscoop in het bijna-infraroodkanaal. (B) Single-trial fluorescentiespoor van het neuron in A. (C) Een representatief inzoombeeld van het spanningsspoor in het overeenkomstige vak weergegeven in B. Schaalbalk: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. histologieNadat functionele beeldvormingsstudie is uitgevoerd, wordt postmortale analyse gebruikt om de juiste plaatsing van het implantaat, het gebied van virusexpressie en lokalisatie van een eiwit dat van belang is in afgebeelde neuronen te bevestigen. Voor histologische verificatie van virusexpressie en plaatsing van het implantaat werden coronale delen van de PFA-vaste hersenen onderzocht onder een fluorescentie-grootveldmicroscoop (figuur 9A, C). Een confocale microscoop werd gebruikt om beelden in hoge resolutie te verkrijgen van individuele neuronen die de calciumindicator uitdrukken, evenals de spanningsindicator (figuur 9B, D). DAPI-kleuring werd gebruikt om de algehele morfologie van de hersenschijf te visualiseren. Bovendien kunnen de hersensegmenten worden beoordeeld met behulp van immunohistochmie om astrogliose of gliose veroorzaakt door raamimplantatie en virale expressie te verifiëren. Onze eerdere studies toonden aan dat de procedure geen merkbare gliosisinduceerde 7. Figuur 9: Histologische verificatie van de optische vensterpositie en virusexpressie. (A) Een representatief fluorescerend beeld van de hersenschijf van de coronale sectie met de plaatsing van het optische venster van een NCaMP-uitdrukkende muis. Schaalbalk: 1 mm. (B) Een representatief confocaal beeld van neuronen die de NCaMP7-indicatoren uitdrukken. Schaalbalk: 25 μm. (C) Een representatief fluorescentiebeeld van de hersenschijf van de coronale sectie met de plaatsing van het optische venster van een SomArchon-uitdrukkende muis. Schaalbalk: 1 mm. (D) Een representatief confocaal beeld van neuronen die de SomArchon-indicatoren uitdrukken. Schaalbalk: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Aanvullend figuur 1: Kwantitatieve analyse van de relatieve fluorescentie-intensiteit samen met de expressietijd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Hier beschrijven we een methode voor langetermijnbeeldvorming van de hippocampus CA1-regio bij zich gedragende muizen. De methode is gebaseerd op de chronische implantatie van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster, dat ook de gerichte toediening van virussen of geneesmiddelen rechtstreeks aan de betrokken neuronen mogelijk maakt. Het huidige protocol bestaat uit vier belangrijke onderdelen: i) het assembleren van beeldvormend implantaat; ii) installatie van beeldvormend implantaat; iii) virusinjectie via beeldvormend implantaat; iv) functionele beeldvorming bij zich gedragende muizen. Hieronder beschrijven en bespreken we kritieke stappen in het protocol, probleemoplossing, wijzigingen en beperkingen van de methode. We bespreken ook het belang van de methode en de mogelijke alternatieve toepassingen ervan.

Er zijn verschillende kritieke stappen in het beschreven protocol die vrij belangrijk zijn voor een succesvolle operatie: (i) voorbereiding van een hoogwaardig beeldvormend implantaat; ii) steriele chirurgische aandoeningen; iii) aspiratie van de cortex; iv) nauwkeurige plaatsing van het beeldimplantaat; v) virale injectie. Zoals stap 1.6 aangeeft, zou overtollig soldeerblik een grotere craniotomie vereisen en dus het risico op ontsteking verhogen. Het is ook erg belangrijk om een geschikte hoeveelheid van de zelfklevende optische lijm te gebruiken bij het bevestigen van het afdekglas aan de beeldvormende canule, zoals aangegeven in stap 1.11, omdat een onvoldoende hoeveelheid kan leiden tot lekkage van cerebrospinale vloeistof in de beeldvormende canule en deze ondoorzichtig kan maken. Aan de andere kant kan overtollige optische lijm resulteren in de verminderde transparantie van het glasraam. Mogelijke besmetting van het beeldvormingsimplantaat kan een actieve proliferatie van bindweefsel onder het optische venster en/of ernstige ontsteking veroorzaken, wat zal leiden tot vroegtijdige beëindiging van het experiment. Daarom is het assembleren en voorbereiden van beeldvormende implantaten vóór de operatie bijna net zo belangrijk als de chirurgische procedure zelf.

Tijdens de operatie wordt het deel van de cortex onder craniotomie verzwepen door zachte aspiratie, wat resulteert in onvermijdelijke bloedingen. Bloed op de chirurgische plaats vermindert de zichtbaarheid van het hersenweefsel dat moet worden verwijderd aanzienlijk. Dit bemoeilijkt de nauwkeurige beoordeling van de vereiste diepte van weefselablatie. Zorgvuldig spoelen van de chirurgische site met PBS elke keer voordat u zuiging toepast om het volgende deel van het weefsel te verwijderen, zorgt voor een betere controle van de diepte. Het hersenweefsel moet altijd stap voor stap in kleine porties worden verwijderd om de diepte van het gebldeerde weefsel te bevestigen voordat u verder gaat met meer zuigkracht. Fijnere zuigkracht kan ook worden bereikt met een dunnere stompe naald. We raden aan om een naald van 26 G te gebruiken, maar kleiner dan 26 G diameter is gevoeliger voor verstopping. Bovendien is er meestal veel oefening nodig om de precieze diepte van de aspiratie te bepalen die nodig is voor elk dier, omdat de kleur van de cortex, corpus callosum en hippocampus van muis tot muis kan verschillen (Figuur 3).

Het inbrengen en vastzetten van het beeldvormingsimplantaat moet zeer nauwkeurig worden gedaan om een zo dicht mogelijke positie van het beeldvormingsvenster bij het dorsale oppervlak van de hippocampus te garanderen. De grootte van de voorbereide craniotomie moet nauw overeenkomen met het implantaat en het inbrengen ervan mogelijk maken zonder significante weerstand. Tegelijkertijd mag er geen zichtbare opening zijn tussen de schedel en het implantaat om een goede afdichting te garanderen en blootstelling aan hersenweefsel te voorkomen. Zachte en stabiele druk moet worden uitgeoefend op de bovenkant van het implantaat tijdens de afdichting op de schedel. Het is bijna onvermijdelijk om bloed onder het beeldvormingsvenster te hebben tijdens de installatie van het implantaat. Als de chirurgische procedure goed wordt uitgevoerd, moet het venster binnen 3-7 dagen worden gewist en wordt de vasculatuur van de hersenen duidelijk zichtbaar. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het virus correct onder het raam wordt geïnjecteerd. In het geval van mislukte expressie kan het virus meerdere keren opnieuw worden geïnjecteerd.

De grootste complicatie die we in sommige gevallen tegenkwamen, is een verminderd zicht op het beeldvenster. Er zijn verschillende mogelijke redenen voor een slechte beeldvormingskwaliteit: i) aanhoudende ontsteking; ii) uitgroei van bindweefsel op het glas; iii) grote opening tussen het raam en hippocampus. Ontsteking wordt meestal veroorzaakt door besmetting tijdens de operatie of door niet goed gesteriliseerd beeldvormingsimplantaat. We raden aan om de chirurgische instrumenten voor en na elke operatie te autoclaafen, het operatiegebied vlak voor de ingreep te desinfecteren en schone persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen tijdens de operatie. Beeldvormende implantaten moeten na montage worden gereinigd, gesteriliseerd en in steriele omstandigheden worden bewaard. De uitgroei van bindweefsel op het glas van beeldvormingsimplantaat kan te wijten zijn aan mechanische verontreiniging op het oppervlak van het glas of overmatig trauma van het hersenweefsel tijdens cortexablatie. Na het monteren van het implantaat is het belangrijk om te bevestigen dat het glasoppervlak schoon en glad is. Ook moeten alle stukjes beschadigd hersenweefsel zorgvuldig worden verwijderd voordat een beeldvormend implantaat in de craniotomie wordt geplaatst. In bepaalde gevallen resulteert de opening tussen het glazen raam en hippocampus in de ophoping van cerebrospinale vloeistof, waardoor de kwaliteit van de beeldvorming wordt verminderd. Daarom is het tijdens de installatie van implantaten cruciaal om het helemaal in te voegen om een goed contact tussen hippocampus en glasraam te garanderen. Soms is het moeilijk om de exacte reden voor ondoorzichtig beeldvenster te identificeren. We stellen voor om postmortale analyse uit te voeren om de omstandigheden onder het optische venster te onthullen en de daaropvolgende operaties dienovereenkomstig aan te passen.

De methode heeft verschillende fundamentele en technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden voor en tijdens in vivo beeldvorming. Een van de belangrijkste beperkingen is cortex ablatie. Een deel van de visuele en sensorische cortex wordt tijdens de operatie verwijderd. Hoewel het moeilijk is om de impact van cortexablatie nauwkeurig te evalueren, omdat verwijderd hersenweefsel niet direct op hippocampus projecteert, toonden verschillende studies geen merkbare stoornis van hippocampaal-afhankelijk leren of andere relevante hippocampusfuncties15,16aan . Er moet ook rekening worden gehouden met de optische beperkingen, vooral wanneer objectieve lenzen met een hoge NA-doelstelling worden gebruikt. In deze studie gebruikten we bijvoorbeeld een 1,75 mm lange canule met een binnendiameter van 1,9 mm. De geometrie van deze canule zal niet de volledige NA van luchtdoelstelling met NA meer dan ~0.5 of waterdoelstelling met NA meer dan ~0.6 bewaren aangezien het wat van licht zal knippen. Een andere beperking, gebruikelijk voor alle hersenbeeldsimplantaten, is dat een deel van de hersenen wordt blootgesteld, waardoor warmteverlies17,18wordtbevorderd . Fysiologische hersentemperatuur kan echter gemakkelijk worden hersteld tijdens beeldvorming door perfusie van een warme buffer.

De beschreven methode kan eenvoudig worden aangepast of aangepast voor andere toepassingen. Het preparaat kan bijvoorbeeld worden aangepast voor beeldvorming van striatum7. Omdat het striatum iets dieper ligt dan hippocampus, moet de langere beeldvormingsconule worden gebruikt voor het assembleren van beeldvormend implantaat. We raden aan om 2,0 mm beeldvormende canule te gebruiken. De coördinaten van de craniotomie moeten dienovereenkomstig worden aangepast (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Bovendien maakt virusinjectie via infusie canule het mogelijk om de expressie van een transgeen in een dunne laag neuronen te bereiken bij gebruik van AAV-serotype met beperkte verspreiding19,20. Het is vooral gunstig voor beeldvorming met één foton als gevolg van verminderde fluorescentie buiten de focus van diepere lagen en, als gevolg daarvan, verbeterde beeldvorming met een enkele celresolutie. Bovendien kan injectie canule ook worden gebruikt tijdens functionele beeldvorming voor de toediening van geneesmiddelen of andere chemicaliën rechtstreeks op de neuronen in FOV (Figuur 5B). Algehele infusie canule voegt nuttige functionaliteiten toe aan het beeldvormingsimplantaat, verbetert de beeldkwaliteit vanwege de gerichte virale expressie en maakt farmacologische stimulatie van neuronen in FOV mogelijk. De gebruikte hoofdplaat biedt buitengewone stabiliteit van beeldvormingsimplantaten die bewegingsartefacten minimaliseren, zelfs bij actief bewegende dieren op een loopband. De kopplaat is klein en licht, veroorzaakt minimaal ongemak voor dieren en blijft enkele maanden na installatie stabiel. Het beeldvormende implantaat is ook compatibel met multifotonen beeldvorming15,16,21 en kan worden gecombineerd met micro-endoscopen22,23. Een soortgelijk beeldvormingsimplantaat werd ook gebruikt voor multifotonen beeldvorming van de diepere hippocampusstructuren, waaronder stratum radiatum, stratum lacunose en dentate gyrus16,24,25,26,27. Het richten van de diepere hippocampusstructuren met AAV’s via infusie canule kan echter verdere optimalisatie van het AAV-serotype en volume19vereisen.

We geloven dat het beschreven protocol studies zal vergemakkelijken die gericht zijn op het onderzoeken van neuronale activiteit met een hoge spatiotemporale resolutie in de hippocampus van zich gedragende muizen met behulp van eenvoudige en betaalbare beeldvormingsopstellingen met één foton.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen alle leden van de Molecular BioEngineering Group van westlake university bedanken voor alle hulp en nuttige discussie. We danken ook Jinze Li en Jie-Min Jia van de Westlake University voor de hulp bij het filmen van de chirurgische ingreep.

Dit werk werd ondersteund door startfinanciering van de Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant en National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 allemaal aan K.D.P.

Materials

Cover glass Deckgläser 72296-03
denture base resin ShangHai New Centery Dentel Material N/A Type I, self-solidifying
Dummy Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62102 OD 0.30mm
Guide Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62003 26G
Head Fork N/A N/A Custom made
Head Plate N/A N/A Custom made
Imaging Cannula N/A N/A Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel
Internal Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62203  0.30*0.14 (OD*ID, mm)
Kwik Sil World Precision Instruments KWIK-SIL
SuperBond C&B SUN MEDICAL N/A SuperBond C&B kit
Treadmill Kit N/A N/A Custom made
UV-cured Adhesive NORLAND PRODUCTS NOA 60
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leutgeb, S., et al. Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
  2. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  3. Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity – towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).
  4. Henneman, W. J. P., et al. Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease. Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).
  5. Camicioli, R., et al. Parkinson’s disease is associated with hippocampal atrophy. Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).
  6. Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience. Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).
  7. Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
  8. Fan, L. Z., et al. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1. Cell. 180 (3), 521-535 (2020).
  9. Shemesh, O. A., et al. Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  10. Villa, K. L., et al. Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo. Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).
  11. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
  12. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  13. Subach, O. M., et al. Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).
  14. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
  16. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  17. Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).
  18. Roche, M., et al. In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation. eLife. 8, 47324 (2019).
  19. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).
  20. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. . Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).
  21. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  22. Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse’s inferior colliculus. Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).
  23. Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
  24. Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).
  25. Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).
  26. Attardo, A., et al. Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
  27. Castello-Waldow, T. P., et al. Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations. PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).

Tags

CraniotomyHippocampusNeuronal ActivitiesIn Vivo ImagingMouseSolderingAdhesiveStereotaxic FrameSurgeryAnesthesiaFur RemovalSkin Incision

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, Y., Zhu, D., Liu, B., Piatkevich, K. D. Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice. J. Vis. Exp. (173), e62266, doi:10.3791/62266 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image