Summary

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Değişmez Doğal Öldürücü T (iNKT) hücreleri, polimorfik olmayan MHC sınıfı I ile ilişkili molekül CD1d. Preklinik ve klinik çalışmalar kanser, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarda iNKT hücreleri için bir rolü desteklemektedir. iNKT hücreleri türler boyunca çok korunmuş ve cd1d eksikliği veya iNKT eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri tarafından araştırılmıştır ve yarı sabit TCR’ye özgü CD1d tetramerleri veya mAb’leri olan farelerde ve erkeklerde bunları kesin olarak tespit etme imkanı. Bununla birlikte, iNKT hücreleri nadirdir ve herhangi bir çalışma için yönetilebilir sayılara ulaşmak için genişletilmeleri gerekir. Birincil fare iNKT hücre hattı in vitro’nun üretimi zor olduğu kanıtlandığı için, iNKT hücrelerinin 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerden (iVα14Tg) dalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için sağlam bir protokol kurduk. Burada birincil dalak iVα14Tg iNKT hücrelerinin immünomanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirilerek yaklaşık% 95-98 saf iNKT hücresi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Saflaştırılmış iNKT hücreleri anti-CD3/CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 ile uyarılır ve bu da kültürün %85-99 saflığı ile +14 gün boyunca 30 kat genişlemeye neden olur. Genişletilmiş iNKT hücreleri kolayca genetik olarak manipüle edilebilir, aktivasyon ve fonksiyon in vitro mekanizmalarını parçalamak için paha biçilmez bir araç sağlar ve daha da önemlisi, in vivo olarak benimsenen transfer üzerine.

Introduction

Değişmez Doğal öldürücü T hücreleri (iNKT hücreleri), MHC sınıfı I ile ilgili molekül CD1d2tarafından sunulan lipid antijenleri için özel olan sınırlı bir dizi farklı Vβ zinciri1ile eşleştirilmiş, farelerde yarı sabit bir αβ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden doğuştan gelen T lenfositlerdir. iNKT hücreleri, bir CD4+ ve bir CD4alt kümesi üreten birkaç olgunlaşma aşaması3,4, ile meydana gelen timusta zaten aktif / doğuştan gelen bir efektör fenotipinin alınmasıyla sonuçlanan bir agonist seçim programına tabidir. Bu program sayesinde, iNKT hücreleri sırasıyla T-bet, GATA3, PLZF ve RORφt transkripsiyon faktörlerinin ifadesiyle tanımlanabilen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ve TH17 (iNKT17)olmaküzere farklı T yardımcı (TH)efektör fenotipleri edinir. iNKT hücreleri bir dizi mikrobiyal lipit tanır, ancak aynı zamanda kanser ve otoimmünite gibi hücre stresi ve doku hasarının patolojik durumları bağlamında güncellenmiş endojen lipitlere karşı kendi kendine reaktiftir2. Aktivasyon üzerine, iNKT hücreleri doğrudan temas ve sitokin üretimi ile diğer doğuştan gelen ve adaptif immün efektör hücrelerin işlevlerini modüleederek 2.

iNKT hücrelerinin araştırılması, CD1d eksikliği veya Jα18 eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri ve antijen yüklü CD1d tetramerlerin üretimi ve insan yarı sabit TCR’ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimi ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, birincil fare iNKT hücre hattının üretimi zor olmuştur. iNKT hücrelerinin antitümör işlevlerini daha iyi karakterize etmek ve bunları benimseyen hücre tedavisi için kullanmak için, iNKT hücrelerinin vahşi tip farelerden 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerin (iVα14Tg)6’nındalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için bir protokol belirledik.

Genişletilmiş iNKT hücreleri in vitro tahliller için kullanılabilir ve farelere geri transfer edildikten sonra in vivo olarak kullanılabilir. Bu ortamda, örneğin, güçlü anti-tümör etkilerini gösterdik7. Ayrıca, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri, enjeksiyonlarından önce gen transferi veya düzenleme yoluyla fonksiyonel modifikasyonaelverişlidir invivo 8 Moleküler yolların içgörülü fonksiyonel analizine izin vermenin yanı sıra gelişmiş hücre tedavilerinin önünü açmak.

Protocol

Burada açıklanan prosedürler San Raffaele Bilim Enstitüsü’nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (no. 1048) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. NOT: Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosundalistelenmiştir. 1. Dalak işleme Kurumsal politikaya göre CO2’yi soluma yoluyla iVα14-Jα18 farelerini ötenazi edin.NOT: iVα14-Jα18 far…

Representative Results

Bu yazıda açıklanan protokol, iVa14-Ja18 transgenik farelerin dalağının iNKT hücrelerini Şekil 1A’daözetlenen bir immünmanyetik ayırma işlemi ile zenginleştirmeyi sağlar. Toplam dalak T hücreleri önce B hücreleri ve monositler tükenerek negatif olarak seçilir, ardından PBS-57 lipid antijen yüklü CD1d tetramerler ile iNKT hücre pozitif immünomanyetik sıralama, özellikle sadece iNKT hücrelerini lekelemeyi sağlar. Bu protokol, tek bir iVa14-Ja18 Tg farenin dalağın?…

Discussion

Burada milyonlarca kullanıma hazır iNKT hücresi elde etmek için tekrarlanabilir ve uygulanabilir bir protokol gösteriyoruz. Bu hücrelerin vivo’nun azlığı nedeniyle, onları genişletmek için bir yönteme çok ihtiyaç vardı. Önerdiğimiz protokol ne belirli bir enstrümantasyon ne de yüksek sayıda fare gerektiriyor. İşlem için gerekli fare sayısını azaltmak için iVα14-Jα18 transgenik farelerden bilerek yararlandık.

iVα14-Jα18 transgenik farelerden iNKT hücre genişle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Paolo Dellabona ve Giulia Casorati’ye makalenin bilimsel desteği ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Nih Tetramer Çekirdek Tesisi’ne fare CD1d tetramer için de teşekkür ederiz. Çalışma Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (M.F.’ye) ve İtalyan Kanser Araştırmaları Derneği (AIRC) bursu 2019-22604 (G.D.’ye) tarafından finanse edildi.

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

  1. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
  2. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  3. Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
  4. Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
  5. Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
  6. Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
  7. Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
  8. Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
  9. Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
  11. Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
  12. de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
  13. Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
  14. Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
  15. Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
  16. Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
  17. Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
  18. Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
  19. Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
  20. Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
  21. Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
  22. Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
  23. Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
  24. Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).

Play Video

Cite This Article
Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

View Video