Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo
Summary
Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.
Abstract
Le cellule Invariant Natural Killer T (iNKT) sono linfociti T innata che esprimono un recettore delle cellule T semi-invariante (TCR) conservato specifico per antigeni lipidici auto o microbici presentati dalla molecola non polimorfica MHC di classe I CD1d. Studi preclinici e clinici supportano un ruolo delle cellule iNKT nel cancro, nell’autoimmunità e nelle malattie infettive. Le cellule iNKT sono molto conservate in tutte le specie e la loro indagine è stata facilitata da modelli murini, tra cui topi cd1d-carenti o iNKT-carenti, e la possibilità di rilevarle inequivocabilmente in topi e uomini con tetrameri CD1d o mAbs specifici per il TCR semi-invariante. Tuttavia, le cellule iNKT sono rare e devono essere espanse per raggiungere numeri gestibili per qualsiasi studio. Poiché la generazione della linea cellulare iNKT di topo primario in vitro si è dimostrata difficile, abbiamo istituito un protocollo robusto per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche dai topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg), in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti. Mostriamo qui che le cellule iNKT iVα14Tg miliniche primarie possono essere arricchite attraverso un processo di separazione immunomagnetica, producendo circa il 95-98% di cellule iNKT pure. Le cellule iNKT purificate sono stimolate da perline anti-CD3 / CD28 più IL-2 e IL-7, con conseguente espansione di 30 volte al giorno +14 della coltura con purezza dell’85-99%. Le cellule iNKT espanse possono essere facilmente manipolate geneticamente, fornendo uno strumento inestimabile per sezionare i meccanismi di attivazione e funzione in vitro e, soprattutto, anche dopo il trasferimento adottivo in vivo.
Introduction
Le cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) sono linfociti T innati che esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T αβ (TCR), formato nei topi da una catena Vα14-Jα18 invariante accoppiata con un insieme limitato di diverse catene Vβ1, che è specifico per gli antigeni lipidici presentati dalla molecola correlata alla classe I MHC CD1d2. Le cellule iNKT subiscono un programma di selezione agonista con conseguente acquisizione di un fenotipo effettore attivato/innato già presente nel timo, che avviene attraverso diversi stadi di maturazione3,4,producendo un sottoinsieme CD4+ ecd4- sottoinsieme. Attraverso questo programma, le cellule iNKT acquisiscono fenotipi effettrici T helper (TH) distinti, vale a dire TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificabili dall’espressione dei fattori di trascrizione T-bet, GATA3, PLZF e RORγt, rispettivamente5. Le cellule iNKT riconoscono una serie di lipidi microbici ma sono anche autoreattive nei confronti dei lipidi endogeni che sono sovraregolati nel contesto di situazioni patologiche di stress cellulare e danno tissutale, come il cancro e l’autoimmunità2. Al momento dell’attivazione, le cellule iNKT modulano le funzioni di altre cellule effettrici immunitarie innate e adattative attraverso il contatto diretto e la produzione di citochine2.
Le indagini sulle cellule iNKT sono state facilitate da modelli murini, tra cui topi cd1d-deficienti o Jα18-carenti, e dalla produzione di tetrameri CD1d caricati con antigene più la generazione di anticorpi monoclonali (mAbs) specifici per il TCR semi-invariante umano. Tuttavia, la generazione della linea cellulare iNKT del topo primario si è dimostrata difficile. Per caratterizzare meglio le funzioni antitumorali delle cellule iNKT e utilizzarle per la terapia cellulare adottiva, abbiamo istituito un protocollo per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche di topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti rispetto ai topi wild type.
Le cellule iNKT espanse possono essere sfruttate per saggi in vitro e in vivo al momento del trasferimento nei topi. In questo contesto, ad esempio, abbiamo mostrato i loro potenti effettiantitumorali 7. Inoltre, le cellule iNKT espanse in vitro sono suscettibili di modificazione funzionale tramite trasferimento genico o modifica prima della loro iniezione in vivo8, consentendo un’analisi funzionale approfondita dei percorsi molecolari, oltre a spianare la strada a terapie cellulari avanzate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui mostriamo un protocollo riproducibile e fattibile per ottenere milioni di celle iNKT pronte all’uso. A causa della scarsità di queste cellule in vivo, era altamente necessario un metodo per espanderle. Il protocollo che proponiamo non richiede né una particolare strumentazione né un elevato numero di topi. Abbiamo sfruttato i topi transgenici iVα14-Jα18 di proposito per ridurre il numero di topi necessari per la procedura.
Un altro protocollo di successo per l’espansione cellulare iNK…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Paolo Dellabona e Giulia Casorati per il supporto scientifico e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il NIH Tetramer Core Facility per il tetramero CD1d del topo. Lo studio è stato finanziato dalla Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) e dalla borsa di studio 2019-22604 dell’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (a G.D.).
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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