Summary

تنقية وتوسيع الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت الماوس في المختبر وفي دراسات في الجسم الحي

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

نحن نصف بروتوكول سريع وقوي لإثراء الخلايا القاتل الطبيعي الثابت T (iNKT) من طحال الماوس وتوسيعها في المختبر إلى أرقام مناسبة للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.

Abstract

الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت (iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) محفوظة محددة لمستضدات الدهون الذاتية أو الميكروبية التي يقدمها جزيء MHC غير متعدد الأشكال من الفئة I-RELATED CD1d. تدعم الدراسات قبل السريرية والسريرية دورا لخلايا iNKT في السرطان والمناعة الذاتية والأمراض المعدية. يتم الحفاظ على خلايا iNKT جدا في جميع أنحاء الأنواع وقد تم تسهيل تحقيقها من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو iNKT – deficient ، وإمكانية اكتشافها بشكل لا لبس فيه في الفئران والرجال الذين يعانون من رباعيات CD1d أو mAbs محددة لTCR شبه ثابتة. ومع ذلك، فإن خلايا iNKT نادرة وتحتاج إلى توسيعها للوصول إلى أرقام يمكن التحكم فيها لأي دراسة. لأن جيل خط الخلية iNKT الماوس الأساسي في المختبر قد ثبت صعوبة, وضعنا بروتوكول قوي لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg), التي خلايا iNKT هي 30 مرات أكثر تواترا. نظهر هنا أن خلايا iVα14Tg iNKTg الأولية يمكن تخصيبها من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ، مما ينتج عنه حوالي 95-98٪ من خلايا iNKT النقية. يتم تحفيز خلايا iNKT المنقى بواسطة حبات مضادة للCD3/CD28 بالإضافة إلى IL-2 و IL-7 ، مما يؤدي إلى توسع 30 ضعفا بحلول اليوم +14 للثقافة مع نقاء 85-99٪. يمكن التلاعب بسهولة خلايا iNKT الموسعة وراثيا ، مما يوفر أداة لا تقدر بثمن لتشريح آليات التنشيط والوظيفة في المختبر ، والأهم من ذلك ، أيضا عند النقل بالتبني في الجسم الحي.

Introduction

الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة (خلايا iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) ، تشكلت في الفئران بواسطة سلسلة Vα14-Jα18 ثابتة مقترنة بمجموعة محدودة من سلاسل Vβ المتنوعة1، وهي محددة للمستضدات الدهنية التي يقدمها جزيء MHC I-RELATED CD1d2. تخضع خلايا iNKT لبرنامج اختيار ناهض مما يؤدي إلى اكتساب النمط الظاهري المنشط / الفطري الموجود بالفعل في الغدة الصعترية ، والذي يحدث من خلال عدة مراحلنضوج 3و4، وإنتاج CD4+ و CD4فرعية. من خلال هذا البرنامج، تكتسب خلايا iNKT مساعد T متميز (TH)الأنماط الظاهرية المؤثرة، وهي TH1 (iNKT1) و TH2 (iNKT2) و TH17 (iNKT17)، التي يمكن التعرف عليها من خلال التعبير عن عوامل النسخ T-bet و GATA3 و PLZF و RORаt، على التوالي5. تتعرف خلايا iNKT على مجموعة من الدهون الميكروبية ولكنها أيضا ذاتية التفاعل ضد الدهون الذاتية التي يتم تنظيمها في سياق الحالات المرضية لإجهاد الخلايا وتلف الأنسجة ، مثل السرطان والمناعة الذاتية2. عند التنشيط، تعدل خلايا iNKT وظائف الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الأخرى عن طريق الاتصال المباشر وإنتاج السيتوكين2.

وقد تم تسهيل التحقيقات في خلايا iNKT من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو Jα18 ، وإنتاج رباعيات CD1d المحملة بالمستضد بالإضافة إلى توليد أجسام مضادة أحادية النسيلة (mAbs) محددة ل TCR البشري شبه المتغير. ومع ذلك، فقد ثبت أن إنشاء خط الخلية iNKT الماوس الأساسي صعبة. لتوصيف أفضل لوظائف antitumor من خلايا iNKT والاستفادة منها للعلاج بالخلايا بالتبني، وضعنا بروتوكول لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg)والتي خلايا iNKT هي 30 مرة أكثر تواترا مما كانت عليه في الفئران نوع البرية.

يمكن استغلال خلايا iNKT الموسعة لإجراء فحوصات في المختبر ، وفي الجسم الحي عند نقلها مرة أخرى إلى الفئران. في هذا الإعداد، على سبيل المثال، لقد أظهرنا آثارها المضادة للورم قوية7. وعلاوة على ذلك، في المختبر توسيع خلايا iNKT قابلة للتعديل الوظيفي عن طريق نقل الجينات أو التحرير قبل حقنها في الجسم الحيمما يسمح التحليل الوظيفي الثاقبة للمسارات الجزيئية، فضلا عن تمهيد الطريق لعلاجات الخلايا المتقدمة.

Protocol

تم استعراض الإجراءات الموصوفة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) (رقم 1048) في معهد سان رافائيل العلمي. ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في جدول المواد. 1. معالج…

Representative Results

البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة يمكن من إثراء خلايا iNKT من طحال الفئران المعدلة وراثيا iVa14-Ja18 من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ملخصة في الشكل 1A. يتم اختيار إجمالي خلايا الطحال T أولا بشكل سلبي عن طريق استنفاد الخلايا B والخلايا الأحادية ، تليها الفرز المناعي الإيجابي لل…

Discussion

هنا نعرض بروتوكول قابل للاستنساخ وقابلة للتنفيذ للحصول على الملايين من خلايا iNKT الجاهزة للاستخدام. بسبب ندرة هذه الخلايا في الجسم الحي، كانت هناك حاجة ماسة إلى طريقة لتوسيعها. البروتوكول الذي نقترحه لا يتطلب أجهزة معينة ولا عدد كبير من الفئران. لقد استغلينا فئران iVα14-Jα18 المعدلة وراثيا عن…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر باولو ديلابونا وجوليا كاسوراتي على الدعم العلمي والقراءة النقدية للمخطوطة. نشكر أيضا مرفق NIH Tetramer Core على رباعي الأقراص المضغوطة CD1d. تم تمويل الدراسة من قبل فوندازيون كاريبلو غرانت 2018-0366 (إلى M.F.) وزمالة الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC) 2019-22604 (إلى G.D.).

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

  1. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
  2. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  3. Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
  4. Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
  5. Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
  6. Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
  7. Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
  8. Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
  9. Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
  11. Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
  12. de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
  13. Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
  14. Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
  15. Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
  16. Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
  17. Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
  18. Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
  19. Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
  20. Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
  21. Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
  22. Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
  23. Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
  24. Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).

Play Video

Cite This Article
Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

View Video