نحن نصف بروتوكول سريع وقوي لإثراء الخلايا القاتل الطبيعي الثابت T (iNKT) من طحال الماوس وتوسيعها في المختبر إلى أرقام مناسبة للدراسات المختبرية وفي الجسم الحي.
الخلايا T القاتل الطبيعي الثابت (iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) محفوظة محددة لمستضدات الدهون الذاتية أو الميكروبية التي يقدمها جزيء MHC غير متعدد الأشكال من الفئة I-RELATED CD1d. تدعم الدراسات قبل السريرية والسريرية دورا لخلايا iNKT في السرطان والمناعة الذاتية والأمراض المعدية. يتم الحفاظ على خلايا iNKT جدا في جميع أنحاء الأنواع وقد تم تسهيل تحقيقها من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو iNKT – deficient ، وإمكانية اكتشافها بشكل لا لبس فيه في الفئران والرجال الذين يعانون من رباعيات CD1d أو mAbs محددة لTCR شبه ثابتة. ومع ذلك، فإن خلايا iNKT نادرة وتحتاج إلى توسيعها للوصول إلى أرقام يمكن التحكم فيها لأي دراسة. لأن جيل خط الخلية iNKT الماوس الأساسي في المختبر قد ثبت صعوبة, وضعنا بروتوكول قوي لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg), التي خلايا iNKT هي 30 مرات أكثر تواترا. نظهر هنا أن خلايا iVα14Tg iNKTg الأولية يمكن تخصيبها من خلال عملية فصل مغناطيسية مناعية ، مما ينتج عنه حوالي 95-98٪ من خلايا iNKT النقية. يتم تحفيز خلايا iNKT المنقى بواسطة حبات مضادة للCD3/CD28 بالإضافة إلى IL-2 و IL-7 ، مما يؤدي إلى توسع 30 ضعفا بحلول اليوم +14 للثقافة مع نقاء 85-99٪. يمكن التلاعب بسهولة خلايا iNKT الموسعة وراثيا ، مما يوفر أداة لا تقدر بثمن لتشريح آليات التنشيط والوظيفة في المختبر ، والأهم من ذلك ، أيضا عند النقل بالتبني في الجسم الحي.
الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة (خلايا iNKT) هي خلايا ليمفاوية T تشبه الفطرية تعبر عن مستقبلات خلايا T شبه ثابتة (TCR) ، تشكلت في الفئران بواسطة سلسلة Vα14-Jα18 ثابتة مقترنة بمجموعة محدودة من سلاسل Vβ المتنوعة1، وهي محددة للمستضدات الدهنية التي يقدمها جزيء MHC I-RELATED CD1d2. تخضع خلايا iNKT لبرنامج اختيار ناهض مما يؤدي إلى اكتساب النمط الظاهري المنشط / الفطري الموجود بالفعل في الغدة الصعترية ، والذي يحدث من خلال عدة مراحلنضوج 3و4، وإنتاج CD4+ و CD4– فرعية. من خلال هذا البرنامج، تكتسب خلايا iNKT مساعد T متميز (TH)الأنماط الظاهرية المؤثرة، وهي TH1 (iNKT1) و TH2 (iNKT2) و TH17 (iNKT17)، التي يمكن التعرف عليها من خلال التعبير عن عوامل النسخ T-bet و GATA3 و PLZF و RORаt، على التوالي5. تتعرف خلايا iNKT على مجموعة من الدهون الميكروبية ولكنها أيضا ذاتية التفاعل ضد الدهون الذاتية التي يتم تنظيمها في سياق الحالات المرضية لإجهاد الخلايا وتلف الأنسجة ، مثل السرطان والمناعة الذاتية2. عند التنشيط، تعدل خلايا iNKT وظائف الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية الأخرى عن طريق الاتصال المباشر وإنتاج السيتوكين2.
وقد تم تسهيل التحقيقات في خلايا iNKT من خلال نماذج الماوس ، بما في ذلك الفئران التي تعاني من نقص CD1d أو Jα18 ، وإنتاج رباعيات CD1d المحملة بالمستضد بالإضافة إلى توليد أجسام مضادة أحادية النسيلة (mAbs) محددة ل TCR البشري شبه المتغير. ومع ذلك، فقد ثبت أن إنشاء خط الخلية iNKT الماوس الأساسي صعبة. لتوصيف أفضل لوظائف antitumor من خلايا iNKT والاستفادة منها للعلاج بالخلايا بالتبني، وضعنا بروتوكول لتنقية وتوسيع خلايا iNKT splenic من الفئران المعدلة وراثيا iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6،والتي خلايا iNKT هي 30 مرة أكثر تواترا مما كانت عليه في الفئران نوع البرية.
يمكن استغلال خلايا iNKT الموسعة لإجراء فحوصات في المختبر ، وفي الجسم الحي عند نقلها مرة أخرى إلى الفئران. في هذا الإعداد، على سبيل المثال، لقد أظهرنا آثارها المضادة للورم قوية7. وعلاوة على ذلك، في المختبر توسيع خلايا iNKT قابلة للتعديل الوظيفي عن طريق نقل الجينات أو التحرير قبل حقنها في الجسم الحي8،مما يسمح التحليل الوظيفي الثاقبة للمسارات الجزيئية، فضلا عن تمهيد الطريق لعلاجات الخلايا المتقدمة.
هنا نعرض بروتوكول قابل للاستنساخ وقابلة للتنفيذ للحصول على الملايين من خلايا iNKT الجاهزة للاستخدام. بسبب ندرة هذه الخلايا في الجسم الحي، كانت هناك حاجة ماسة إلى طريقة لتوسيعها. البروتوكول الذي نقترحه لا يتطلب أجهزة معينة ولا عدد كبير من الفئران. لقد استغلينا فئران iVα14-Jα18 المعدلة وراثيا عن…
The authors have nothing to disclose.
نشكر باولو ديلابونا وجوليا كاسوراتي على الدعم العلمي والقراءة النقدية للمخطوطة. نشكر أيضا مرفق NIH Tetramer Core على رباعي الأقراص المضغوطة CD1d. تم تمويل الدراسة من قبل فوندازيون كاريبلو غرانت 2018-0366 (إلى M.F.) وزمالة الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC) 2019-22604 (إلى G.D.).
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
hrIL-2 | Chiron Corp | ||
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
PFA | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |