Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies
Summary
We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.
Abstract
Invariante Natural Killer T (iNKT) cellen zijn aangeboren T-lymfocyten die een geconserveerde semi-invariante T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen die specifiek is voor zelf- of microbiële lipide-antigenen gepresenteerd door het niet-polymorfe MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d. Preklinische en klinische studies ondersteunen een rol voor iNKT-cellen bij kanker, auto-immuniteit en infectieziekten. iNKT-cellen zijn zeer geconserveerd in alle soorten en hun onderzoek is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of iNKT-deficiënte muizen, en de mogelijkheid om ze ondubbelzinnig te detecteren bij muizen en mannen met CD1d-tetrameren of mAbs specifiek voor de semi-invariante TCR. iNKT-cellen zijn echter zeldzaam en ze moeten worden uitgebreid om beheersbare aantallen te bereiken voor elke studie. Omdat het genereren van primaire muis iNKT-cellijn in vitro moeilijk is gebleken, hebben we een robuust protocol opgezet om milt iNKT-cellen van de iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg) te zuiveren en uit te breiden, waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen. We laten hier zien dat primaire milt iVα14Tg iNKT-cellen kunnen worden verrijkt door middel van een immunomagnetisch scheidingsproces, wat ongeveer 95-98% pure iNKT-cellen oplevert. De gezuiverde iNKT-cellen worden gestimuleerd door anti-CD3/CD28 kralen plus IL-2 en IL-7, wat resulteert in een 30-voudige expansie op dag +14 van de cultuur met een zuiverheid van 85-99%. De uitgebreide iNKT-cellen kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanismen van activering te ontleden en in vitro te functioneren en, nog belangrijker, ook bij adoptieve overdracht in vivo.
Introduction
Invariante Natural killer T-cellen (iNKT-cellen) zijn aangeboren T-lymfocyten die een semi-invariante αβ T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen, gevormd in muizen door een invariante Vα14-Jα18-keten in combinatie met een beperkte set van diverse Vβ-ketens1, die specifiek is voor lipide-antigenen gepresenteerd door het MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d2. iNKT-cellen ondergaan een agonistselectieprogramma dat resulteert in de verwerving van een geactiveerd / aangeboren effectorfenotype al in de thymus, dat optreedt door verschillende rijpingsstadia3,4, waardoor een CD4+ en een CD4– subset ontstaat. Via dit programma verwerven iNKT-cellen verschillende T-helper (TH)effectorfenotypen, namelijk TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) en TH17 (iNKT17), identificeerbaar door de expressie van de transcriptiefactoren T-bet, GATA3, PLZF en RORγt, respectievelijk5. iNKT-cellen herkennen een reeks microbiële lipiden, maar zijn ook zelfreactief tegen endogene lipiden die worden opgereguleerd in de context van pathologische situaties van celstress en weefselschade, zoals kanker en auto-immuniteit2. Na activering moduleren iNKT-cellen de functies van andere aangeboren en adaptieve immuuneffectorcellen via direct contact en cytokineproductie2.
Het onderzoek van iNKT-cellen is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of Jα18-deficiënte muizen, en door de productie van antigeen-geladen CD1d-tetrameren plus de generatie van monoklonale antilichamen (mAbs) specifiek voor de menselijke semi-invariante TCR. Het genereren van primaire muis iNKT-cellijn is echter moeilijk gebleken. Om de antitumorfuncties van iNKT-cellen beter te karakteriseren en te gebruiken voor adoptieve celtherapie, hebben we een protocol opgezet om milt iNKT-cellen van iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg)6te zuiveren en uit te breiden , waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen dan bij muizen van het wilde type.
Geëxpandeerde iNKT-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen en in vivo bij overdracht terug naar muizen. In deze setting hebben we bijvoorbeeld hun krachtige anti-tumor effecten aangetoond7. Bovendien zijn in vitro geëxpandeerde iNKT-cellen vatbaar voor functionele modificatie via genoverdracht of bewerking voorafgaand aan hun injectie in vivo8, waardoor inzichtelijke functionele analyse van moleculaire routes mogelijk is en de weg wordt vrijgemaakt voor geavanceerde celtherapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we een reproduceerbaar en haalbaar protocol om miljoenen kant-en-klare iNKT-cellen te verkrijgen. Vanwege het gebrek aan deze cellen in vivo, was een methode om ze uit te breiden hard nodig. Het protocol dat wij voorstellen vereist noch een bepaalde instrumentatie, noch een groot aantal muizen. We hebben iVα14-Jα18 transgene muizen met opzet gebruikt om het aantal muizen dat nodig is voor de procedure te verminderen.
Een ander succesvol protocol voor iNKT-celuitbreiding van iVα14…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Paolo Dellabona en Giulia Casorati voor de wetenschappelijke ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. We bedanken ook de NIH Tetramer Core Facility voor muis CD1d tetrameer. De studie werd gefinancierd door Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (aan M.F.) en de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC) fellowship 2019-22604 (aan G.D.).
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
