In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele
Summary
Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.
Abstract
Compreender as alterações efêmeras que ocorrem durante o desenvolvimento e amadurecimento cerebral requer imagens detalhadas de alta resolução no espaço e no tempo na resolução celular e subcelular. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter numerosas informações detalhadas sobre os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento cerebral no embrião transparente de zebrafish. Recentemente, os processos de refinamento da conectividade neuronal que ocorrem em estágios larvais posteriores várias semanas após a fertilização, que são, por exemplo, o controle do comportamento social, tomada de decisão ou comportamento motivado por motivação, passaram a se concentrar na pesquisa. Nestas fases, a pigmentação da pele do zebrafish interfere com a penetração da luz no tecido cerebral, e soluções para estágios embrionários, por exemplo, inibição farmacológica da pigmentação, não são mais viáveis.
Portanto, é fornecida uma solução cirúrgica minimamente invasiva para o acesso de microscopia ao cérebro de zebrafish acordado que é derivada de abordagens eletrofisiológicas. Em teleosts, a cartilagem da pele e do crânio macio pode ser cuidadosamente removida micro-descascando essas camadas, expondo neurônios subjacentes e tratos axonais sem danos. Isso permite o registro da morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas e seus conteúdos moleculares, e a observação de alterações fisiológicas como transitórios Ca2+ ou eventos de transporte intracelular. Além disso, o interrogatório desses processos por meio de inibição farmacológica ou manipulação optogenética é viável. Esta abordagem de exposição cerebral fornece informações sobre mudanças estruturais e fisiológicas nos neurônios, bem como a correlação e interdependência desses eventos no tecido cerebral vivo na faixa de minutos ou horas. A técnica é adequada para imagens cerebrais in vivo de larvas de zebrafish até 30 dias após a fertilização, o último estágio de desenvolvimento testado até agora. Assim, fornece acesso a questões tão importantes como refinamento sináptico e dimensionamento, transporte axonal e dendrático, direcionamento sináptico de carga citoesquelética ou expressão local dependente de atividades. Portanto, um uso amplo para esta abordagem de montagem e imagem pode ser antecipado.
Introduction
Nas últimas décadas, o zebrafish (Danio rerio) evoluiu como um dos organismos modelo vertebrados mais populares para estudos de desenvolvimento embrionário e larval. A grande fecundidade das fêmeas de zebrafish aliada ao rápido desenvolvimento ex utero do embrião e sua transparência durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário são apenas alguns dos fatores-chave que fazem do zebrafish um poderoso organismo modelo para resolver questões de desenvolvimento1. Avanços nas tecnologias genéticas moleculares combinados com estudos de alta resolução in vivo de imagem permitiram abordar mecanismos biológicos celulares subjacentes aos processos de desenvolvimento2. Em particular, no campo da diferenciação neuronal, fisiologia, conectividade e função, o zebrafish lançou luz sobre a interação da dinâmica molecular, funções cerebrais e comportamento organismo em detalhes sem precedentes.
No entanto, a maioria desses estudos são restritos a estágios embrionários e larvais iniciais durante a primeira semana de desenvolvimento, uma vez que a transparência do tecido do sistema nervoso é progressivamente perdida. Nestas fases, o tecido cerebral é impedido de acessar por abordagens de microscopia de alta resolução que se tornam protegidas pela diferenciação do crânio e pigmentação3.
Portanto, questões-chave de diferenciação neuronal, maturação e plasticidade, como o refinamento da conectividade neuronal ou o dimensionamento sináptico são difíceis de estudar. Esses processos celulares são importantes para definir mecanismos celulares que conduzem, por exemplo, comportamento social, tomada de decisão ou comportamento baseado em motivação, áreas para as quais a pesquisa de zebrafish sobre larvas de várias semanas de idade contribuiu recentemente com os principais achados baseados em estudos comportamentais4.
Abordagens farmacológicas para inibir a pigmentação em larvas de zebrafish por várias semanas são pouco viáveis ou podem até causar efeitos prejudiciais5,6,7,8. Cepas mutantes duplas ou triplas com defeitos de pigmentação específicos, como o casper9 ou o cristal10,tornaram-se ferramentas tremendamente valiosas, mas são trabalhosas na reprodução, fornecem poucos descendentes e representam o perigo de acumular malformações genéticas devido ao excesso de endogamia.
Aqui, é fornecido um procedimento invasivo mínimo como alternativa que seja aplicável a qualquer cepa de zebrafish. Este procedimento foi adaptado de estudos eletrofisiológicos para registrar atividade neuronal em larvas vivas e acordadas de zebrafish. Em teleosts, a cartilagem da pele e do crânio macio pode ser cuidadosamente removida através da micro-descascamento dessas camadas, porque elas não estão firmemente entrelaçadas com a vasculatura cerebral. Isso permite expor o tecido cerebral contendo neurônios e tratos axonais sem danos e para o registro de morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas e seus conteúdos moleculares, que por sua vez incluem a observação de alterações fisiológicas como transitórios ca2+ ou eventos de transporte intracelular por até várias horas. Além disso, além das caracterizações descritivas, o acesso direto ao tecido cerebral permite o interrogatório de funções neuronais maduras por meio da administração de substâncias neurofarmacológicas e abordagens optogenéticas. Portanto, as relações de função da verdadeira estrutura podem ser reveladas no cérebro juvenil de zebrafish usando essa estratégia de exposição cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado fornece uma abordagem alternativa ao isolamento cerebral ou ao tratamento de larvas de zebrafish com fármacos inibindo pigmentação para registro de imagens de alta resolução de neurônios em seu ambiente in vivo. A qualidade das imagens registradas com este método é comparável às imagens de cérebros explantados, mas em condições naturais.
Além disso, evita-se uma perda de intensidade de fluorescência, pois não há necessidade de tratamento com fixa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos especialmente a Timo Fritsch pelo excelente cuidado animal e Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti e Barbara Winter pelo apoio útil. Também somos gratos a todos os outros membros do laboratório Köster por seu feedback. O projeto foi financiado em parte pelo projeto da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (para a RWK) e pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projeto 01EW1520 para JCM) é reconhecido.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
