Summary

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Published: February 10, 2021
doi:

Summary

Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.

Abstract

Compreender as alterações efêmeras que ocorrem durante o desenvolvimento e amadurecimento cerebral requer imagens detalhadas de alta resolução no espaço e no tempo na resolução celular e subcelular. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter numerosas informações detalhadas sobre os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento cerebral no embrião transparente de zebrafish. Recentemente, os processos de refinamento da conectividade neuronal que ocorrem em estágios larvais posteriores várias semanas após a fertilização, que são, por exemplo, o controle do comportamento social, tomada de decisão ou comportamento motivado por motivação, passaram a se concentrar na pesquisa. Nestas fases, a pigmentação da pele do zebrafish interfere com a penetração da luz no tecido cerebral, e soluções para estágios embrionários, por exemplo, inibição farmacológica da pigmentação, não são mais viáveis.

Portanto, é fornecida uma solução cirúrgica minimamente invasiva para o acesso de microscopia ao cérebro de zebrafish acordado que é derivada de abordagens eletrofisiológicas. Em teleosts, a cartilagem da pele e do crânio macio pode ser cuidadosamente removida micro-descascando essas camadas, expondo neurônios subjacentes e tratos axonais sem danos. Isso permite o registro da morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas e seus conteúdos moleculares, e a observação de alterações fisiológicas como transitórios Ca2+ ou eventos de transporte intracelular. Além disso, o interrogatório desses processos por meio de inibição farmacológica ou manipulação optogenética é viável. Esta abordagem de exposição cerebral fornece informações sobre mudanças estruturais e fisiológicas nos neurônios, bem como a correlação e interdependência desses eventos no tecido cerebral vivo na faixa de minutos ou horas. A técnica é adequada para imagens cerebrais in vivo de larvas de zebrafish até 30 dias após a fertilização, o último estágio de desenvolvimento testado até agora. Assim, fornece acesso a questões tão importantes como refinamento sináptico e dimensionamento, transporte axonal e dendrático, direcionamento sináptico de carga citoesquelética ou expressão local dependente de atividades. Portanto, um uso amplo para esta abordagem de montagem e imagem pode ser antecipado.

Introduction

Nas últimas décadas, o zebrafish (Danio rerio) evoluiu como um dos organismos modelo vertebrados mais populares para estudos de desenvolvimento embrionário e larval. A grande fecundidade das fêmeas de zebrafish aliada ao rápido desenvolvimento ex utero do embrião e sua transparência durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário são apenas alguns dos fatores-chave que fazem do zebrafish um poderoso organismo modelo para resolver questões de desenvolvimento1. Avanços nas tecnologias genéticas moleculares combinados com estudos de alta resolução in vivo de imagem permitiram abordar mecanismos biológicos celulares subjacentes aos processos de desenvolvimento2. Em particular, no campo da diferenciação neuronal, fisiologia, conectividade e função, o zebrafish lançou luz sobre a interação da dinâmica molecular, funções cerebrais e comportamento organismo em detalhes sem precedentes.

No entanto, a maioria desses estudos são restritos a estágios embrionários e larvais iniciais durante a primeira semana de desenvolvimento, uma vez que a transparência do tecido do sistema nervoso é progressivamente perdida. Nestas fases, o tecido cerebral é impedido de acessar por abordagens de microscopia de alta resolução que se tornam protegidas pela diferenciação do crânio e pigmentação3.

Portanto, questões-chave de diferenciação neuronal, maturação e plasticidade, como o refinamento da conectividade neuronal ou o dimensionamento sináptico são difíceis de estudar. Esses processos celulares são importantes para definir mecanismos celulares que conduzem, por exemplo, comportamento social, tomada de decisão ou comportamento baseado em motivação, áreas para as quais a pesquisa de zebrafish sobre larvas de várias semanas de idade contribuiu recentemente com os principais achados baseados em estudos comportamentais4.

Abordagens farmacológicas para inibir a pigmentação em larvas de zebrafish por várias semanas são pouco viáveis ou podem até causar efeitos prejudiciais5,6,7,8. Cepas mutantes duplas ou triplas com defeitos de pigmentação específicos, como o casper9 ou o cristal10,tornaram-se ferramentas tremendamente valiosas, mas são trabalhosas na reprodução, fornecem poucos descendentes e representam o perigo de acumular malformações genéticas devido ao excesso de endogamia.

Aqui, é fornecido um procedimento invasivo mínimo como alternativa que seja aplicável a qualquer cepa de zebrafish. Este procedimento foi adaptado de estudos eletrofisiológicos para registrar atividade neuronal em larvas vivas e acordadas de zebrafish. Em teleosts, a cartilagem da pele e do crânio macio pode ser cuidadosamente removida através da micro-descascamento dessas camadas, porque elas não estão firmemente entrelaçadas com a vasculatura cerebral. Isso permite expor o tecido cerebral contendo neurônios e tratos axonais sem danos e para o registro de morfologia neuronal, incluindo estruturas sinápticas e seus conteúdos moleculares, que por sua vez incluem a observação de alterações fisiológicas como transitórios ca2+ ou eventos de transporte intracelular por até várias horas. Além disso, além das caracterizações descritivas, o acesso direto ao tecido cerebral permite o interrogatório de funções neuronais maduras por meio da administração de substâncias neurofarmacológicas e abordagens optogenéticas. Portanto, as relações de função da verdadeira estrutura podem ser reveladas no cérebro juvenil de zebrafish usando essa estratégia de exposição cerebral.

Protocol

Todo o trabalho animal descrito aqui está de acordo com as regulamentações legais (Diretiva UE 2010/63). A manutenção e manuseio de peixes foram aprovadas pelas autoridades locais e pelo representante do bem-estar animal da Technische Universität Braunschweig. 1. Preparação de fluido espinhal cerebro artificial (ACSF), agarose de baixo derretimento e agulhas de vidro afiadas Prepare o ACSF dissolvendo os produtos químicos listados nas seguintes concentrações em água desti…

Representative Results

Figura 3AC mostrar uma larva dpf de 14 dpf da linha transgênica Tg [-7.5Ca8:GFP]bz12[15] com o crânio ainda intacto. As células pigmentadas na pele sobreposta estão distribuídas por toda a cabeça e estão interferindo com o sinal de fluorescência na região de interesse (aqui, cerebelo). Com a larva nesta condição, não é possível obter imagens de alta resolução do cérebro. <strong c…

Discussion

O método apresentado fornece uma abordagem alternativa ao isolamento cerebral ou ao tratamento de larvas de zebrafish com fármacos inibindo pigmentação para registro de imagens de alta resolução de neurônios em seu ambiente in vivo. A qualidade das imagens registradas com este método é comparável às imagens de cérebros explantados, mas em condições naturais.

Além disso, evita-se uma perda de intensidade de fluorescência, pois não há necessidade de tratamento com fixa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos especialmente a Timo Fritsch pelo excelente cuidado animal e Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti e Barbara Winter pelo apoio útil. Também somos gratos a todos os outros membros do laboratório Köster por seu feedback. O projeto foi financiado em parte pelo projeto da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (para a RWK) e pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projeto 01EW1520 para JCM) é reconhecido.

Materials

Calcium chloride Roth A119.1
Confocal Laser scanning microscope Leica TCS SP8
d-Glucose Sigma G8270-1KG
d-Tubocurare Sigma-Aldrich T2379-100MG
Glass Capillary type 1 WPI 1B150F-4
Glass Capillary type 2 Harvard Apparatus GC100F-10
Glass Coverslip deltalab D102424
HEPES Roth 9105.4
Hoechst 33342 Invitrogen (Thermo Fischer) H3570
Imaging chamber Ibidi 81156
Potassium chloride Normapur 26764298
LM-Agarose Condalab 8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate) Roth A537.4
Microscope Camera Leica DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1 NARISHIGE Model PC-10
Needle-Puller type 2 Sutter Instruments Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml A.Hartenstein 20170718
Sodium chloride Roth P029.2
Sodium hydroxide Normapur 28244262
Tricain Sigma-Aldrich E10521-50G
Waterbath Phoenix Instrument WB-12
35 mm petri dish Sarstedt 833900
90 mm petri dish Sarstedt 821473001

References

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Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Köster, R. W. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (168), e62166, doi:10.3791/62166 (2021).

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