In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung
Summary
Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.
Abstract
Das Verständnis der ephemeren Veränderungen, die während der Entwicklung und Reifung des Gehirns auftreten, erfordert eine detaillierte hochauflösende Bildgebung in Raum und Zeit mit zellulärer und subzellulärer Auflösung. Fortschritte in molekularen und bildgebenden Technologien haben es uns ermöglicht, zahlreiche detaillierte Einblicke in zelluläre und molekulare Mechanismen der Gehirnentwicklung im transparenten Zebrafischembryo zu gewinnen. In jüngster Zeit sind Prozesse der Verfeinerung neuronaler Konnektivität, die in späteren Larvenstadien mehrere Wochen nach der Befruchtung auftreten, die beispielsweise die Kontrolle des Sozialverhaltens, die Entscheidungsfindung oder motivationsgetriebenes Verhalten sind, in den Fokus der Forschung gerückt. In diesen Stadien stört die Pigmentierung der Zebrafischhaut das Eindringen von Licht in das Hirngewebe, und Lösungen für Embryonalstadien, z. B. pharmakologische Hemmung der Pigmentierung, sind nicht mehr realisierbar.
Daher wird eine minimalinvasive chirurgische Lösung für den mikroskopischen Zugang zum Gehirn von wachen Zebrafischen bereitgestellt, die aus elektrophysiologischen Ansätzen abgeleitet ist. Bei Teleosten können Haut- und weichschädeliger Knorpel vorsichtig entfernt werden, indem diese Schichten mikroschält werden, wodurch darunter liegende Neuronen und axonale Bahnen ohne Schäden freigelegt werden. Dies ermöglicht die Erfassung der neuronalen Morphologie, einschließlich synaptischer Strukturen und ihrer molekularen Inhalte, sowie die Beobachtung physiologischer Veränderungen wie Ca2+ Transienten oder intrazelluläre Transportereignisse. Darüber hinaus ist eine Abfrage dieser Prozesse mittels pharmakologischer Hemmung oder optogenetischer Manipulation möglich. Dieser Gehirnexpositionsansatz liefert Informationen über strukturelle und physiologische Veränderungen in Neuronen sowie die Korrelation und Interdependenz dieser Ereignisse im lebenden Hirngewebe im Bereich von Minuten oder Stunden. Die Technik eignet sich für die In-vivo-Bildgebung von Zebrafischlarven bis zu 30 Tage nach der Befruchtung, dem neuesten bisher getesteten Entwicklungsstadium. Es bietet somit Zugang zu so wichtigen Fragen wie synaptischer Verfeinerung und Skalierung, axonaler und dendritischer Transport, synaptisches Targeting von Zytoskelettladung oder lokale aktivitätsabhängige Expression. Daher ist mit einem breiten Einsatz für diesen Montage- und Imaging-Ansatz zu rechnen.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einem der beliebtesten Wirbeltiermodellorganismen für Embryonal- und Larvenentwicklungsstudien entwickelt. Die große Fruchtbarkeit der Zebrafischweibchen gepaart mit der schnellen Ex-utero-Entwicklung des Embryos und seiner Transparenz in frühen embryonalen Entwicklungsstadien sind nur einige Schlüsselfaktoren, die Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellorganismus für adressierte Entwicklungsfragen machen1. Fortschritte in molekulargenetischen Technologien in Kombination mit hochauflösenden In-vivo-Bildgebungsstudien ermöglichten es, zellbiologische Mechanismen anzugehen, die Entwicklungsprozessen zugrundeliegen 2. Insbesondere auf dem Gebiet der neuronalen Differenzierung, Physiologie, Konnektivität und Funktion hat Zebrafisch das Zusammenspiel von molekularer Dynamik, Gehirnfunktionen und organismischem Verhalten in bisher unerreichter Detailgenauigkeit beleuchtet.
Die meisten dieser Studien beschränken sich jedoch auf embryonale und frühe Larvenstadien in der ersten Entwicklungswoche, da die Transparenz des Gewebes des Nervensystems allmählich verloren geht. In diesen Stadien wird hirngewebe durch hochauflösende Mikroskopieansätze am Zugang gehindert, die durch Schädeldifferenzierung und Pigmentierung abgeschirmt werden3.
Daher sind Schlüsselfragen der neuronalen Differenzierung, Reifung und Plastizität wie die Verfeinerung der neuronalen Konnektivität oder die synaptische Skalierung schwer zu untersuchen. Diese zellulären Prozesse sind wichtig, um zelluläre Mechanismen zu definieren, die beispielsweise sozialverhalten, Entscheidungsfindung oder motivationsbasiertes Verhalten antreiben, Bereiche, zu denen die Zebrafischforschung an mehreren Wochen alten Larven kürzlich wichtige Erkenntnisse auf der Grundlage von Verhaltensstudien beigetragen hat4.
Pharmakologische Ansätze zur Hemmung der Pigmentierung bei Zebrafischlarven über mehrere Wochen sind kaum realisierbar oder können sogar schädliche Auswirkungen haben5,6,7,8. Doppel- oder dreifach mutierte Stämme mit spezifischen Pigmentdefekten, wie Casper9 oder Crystal10, sind zu enorm wertvollen Werkzeugen geworden, sind aber mühsam in der Zucht, liefern wenig Nachkommen und stellen die Gefahr dar, genetische Fehlbildungen aufgrund übermäßiger Inzucht anzuhäufen.
Hier ist alternativ ein minimalinvasives Verfahren vorgesehen, das auf jeden Zebrafischstamm anwendbar ist. Dieses Verfahren wurde aus elektrophysiologischen Studien adaptiert, um die neuronale Aktivität bei lebenden und wachen Zebrafischlarven aufzuzeichnen. Bei Teleosten können Haut und weicher Schädelknorpel durch Mikropeeling dieser Schichten vorsichtig entfernt werden, da sie nicht eng mit dem Gehirngefäß verwoben sind. Dies ermöglicht es, Hirngewebe, das Neuronen und axonale Bahnen enthält, ohne Schädigung freizulegen und die neuronale Morphologie einschließlich synaptischer Strukturen und deren molekularem Inhalt zu erfassen, was wiederum die Beobachtung physiologischer Veränderungen wie Ca2+ Transienten oder intrazellulärer Transportereignisse für bis zu mehreren Stunden umfasst. Darüber hinaus ermöglicht der direkte Zugang zum Hirngewebe über deskriptive Charakterisierungen hinaus die Abfrage reifer neuronaler Funktionen mittels neuropharmakologischer Substanzgabe und optogenetischer Ansätze. Daher können mit dieser Gehirnexpositionsstrategie wahre Strukturfunktionsbeziehungen im jugendlichen Zebrafischgehirn aufgedeckt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode bietet einen alternativen Ansatz zur Gehirnisolierung oder zur Behandlung von Zebrafischlarven mit pigmenthemmenden Arzneimitteln zur Aufnahme hochauflösender Bilder von Neuronen in ihrer In-vivo-Umgebung. Die Qualität der mit dieser Methode aufgenommenen Bilder ist vergleichbar mit Bildern aus explantierten Gehirnen, jedoch unter natürlichen Bedingungen.
Weiterhin wird ein Intensitätsverlust der Fluoreszenz vermieden, da keine Behandlung mit Fixiermitteln…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken insbesondere Timo Fritsch für die hervorragende Tierpflege und Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti und Barbara Winter für die hilfreiche Unterstützung. Wir danken auch allen anderen Mitgliedern des Köster-Labors für ihr Feedback. Das Projekt wurde zum Teil von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, KO1949/7-2) gefördert, 241961032 (zu RWK) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS Projekt 01EW1520 zu JCM) wird anerkannt.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
