في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد
Summary
هنا نقدم طريقة لتصوير الدماغ الجنيني حمار وحشي في الجسم الحي حتى اليرقات ومراحل الأحداث. هذا الإجراء المجهري، مقتبس من النهج الكهربية، ويوفر الوصول إلى التفاصيل الخلوية ودون الخلوية من الخلايا العصبية الناضجة ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة البصرية والدراسات الدوائية العصبية لتوصيف وظائف الدماغ والتدخل المخدرات.
Abstract
يتطلب فهم التغيرات الزائلة التي تحدث أثناء نمو الدماغ ونضوجه تصويرا مفصلا عالي الدقة في المكان والزمان بدقة خلوية ودون خلايا. وقد سمح لنا التقدم في التقنيات الجزيئية والتصويرية بالحصول على العديد من الأفكار التفصيلية حول الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الدماغ في جنين سمك الحمار الوحشي الشفاف. في الآونة الأخيرة ، انتقلت عمليات صقل الاتصال العصبي التي تحدث في مراحل اليرقات اللاحقة بعد عدة أسابيع من الإخصاب ، والتي هي على سبيل المثال التحكم في السلوك الاجتماعي أو صنع القرار أو السلوك القائم على التحفيز ، إلى تركيز البحث. في هذه المراحل ، يتداخل تصبغ جلد حمار وحشي مع اختراق الضوء في أنسجة الدماغ ، ولم تعد حلول المراحل الجنينية ، على سبيل المثال ، التثبيط الدوائي للتصبغ ، مجدية بعد الآن.
لذلك ، يتم توفير حل جراحي طفيف التوغل للوصول إلى المجهر إلى دماغ حمار وحشي مستيقظ مشتق من النهج الكهربية. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات، وفضح الخلايا العصبية الكامنة ومسالك أكسنال دون ضرر. وهذا يسمح لتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، ومراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في هذه العمليات عن طريق التثبيط الدوائي أو التلاعب البصري الوراثي أمر ممكن. يوفر نهج التعرض للدماغ هذا معلومات حول التغيرات الهيكلية والفسيولوجية في الخلايا العصبية وكذلك ارتباط وترابط هذه الأحداث في أنسجة الدماغ الحية في نطاق دقائق أو ساعات. هذه التقنية مناسبة لتصوير الدماغ في الجسم الحي ليرقات حمار وحشي لمدة تصل إلى 30 يوما بعد الإخصاب ، وهي أحدث مرحلة تنموية تم اختبارها حتى الآن. وبالتالي، فإنه يوفر الوصول إلى أسئلة هامة مثل صقل متشابك والتحجيم، والنقل المحوري والتشجر، واستهداف متشابك من البضائع الهيكل الخلوي أو التعبير المحلي تعتمد على النشاط. لذلك ، يمكن توقع استخدام واسع لهذا النهج المتصاعد والتصوير.
Introduction
على مدى العقود الأخيرة ، تطورت سمكة الحمار الوحشي(Danio rerio)كواحدة من الكائنات الحية النموذجية الفقارية الأكثر شعبية للدراسات التنموية الجنينية واليرقات. البراز الكبير للإناث حمار وحشي إلى جانب التطور السريع السابق الرحمي للجنين وشفافيته خلال مراحل النمو الجنينية المبكرة ليست سوى عدد قليل من العوامل الرئيسية التي تجعل حمار وحشي كائن حي نموذج قوي لأسئلة النموadress 1. التقدم في التقنيات الوراثية الجزيئية جنبا إلى جنب مع ارتفاع القرار في دراسات التصوير في الجسم الحي يسمح لمعالجة الآليات البيولوجية الخلية الكامنة وراء عمليات التنمية2. على وجه الخصوص ، في مجال التمايز العصبي ، وعلم وظائف الأعضاء ، والاتصال ، والوظيفة ، ألقت سمكة الحمار الوحشي الضوء على التفاعل بين الديناميات الجزيئية ووظائف الدماغ والسلوك الحي بتفاصيل غير مسبوقة.
ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تقتصر على المراحل الجنينية واليرقات المبكرة خلال الأسبوع الأول من التطور حيث تضيع شفافية أنسجة الجهاز العصبي تدريجيا. في هذه المراحل، يتم منع أنسجة الدماغ من الوصول عن طريق نهج المجهر عالية الدقة تصبح محمية من قبل تمايز الجمجمة وتصبغ3.
لذلك ، من الصعب دراسة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتمايز العصبي والنضج واللدونة مثل صقل الاتصال العصبي أو التحجيم المتشابك. هذه العمليات الخلوية مهمة من أجل تحديد الآليات الخلوية التي تقود ، على سبيل المثال ، السلوك الاجتماعي ، صنع القرار ، أو السلوك القائم على التحفيز ، وهي المجالات التي ساهمت فيها أبحاث حمار وحشي على يرقات عمرها عدة أسابيع مؤخرا في النتائج الرئيسية استنادا إلى الدراسات السلوكية4.
النهج الدوائية لمنع تصبغ في يرقات حمار وحشي لعدة أسابيع هي بالكاد ممكنة أو قد تسبب حتى آثار ضارة5،6،7،8. سلالات متحولة مزدوجة أو ثلاثية مع عيوب تصبغ محددة، مثل كاسبر9 أو الكريستال10،أصبحت أدوات قيمة للغاية، ولكن شاقة في تربية، وتوفير عدد قليل من النسل، وتشكل خطر تراكم التشوهات الوراثية بسبب التكاثر المفرط.
هنا، يتم توفير إجراء الحد الأدنى الغازية كبديل التي تنطبق على أي سلالة حمار وحشي. تم تكييف هذا الإجراء من الدراسات الكهربية لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في يرقات حمار وحشي حية ومستيقظة. في teleosts، يمكن إزالة الجلد وغضاريف الجمجمة الناعمة بعناية عن طريق تقشير هذه الطبقات الصغيرة، لأنها ليست متشابكة بإحكام مع الأوعية الدموية في الدماغ. وهذا يسمح لكشف أنسجة الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية والمسالك المحورية دون ضرر وتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الهياكل متشابك ومحتوياتها الجزيئية، والتي بدورها تشمل مراقبة التغيرات الفسيولوجية مثل Ca2 + العابرين أو أحداث النقل داخل الخلايا لمدة تصل إلى عدة ساعات. وعلاوة على ذلك، وإلى جانب الأوصاف الوصفية، يتيح الوصول المباشر إلى أنسجة الدماغ استجواب وظائف الخلايا العصبية الناضجة عن طريق إدارة المواد العصبية الدوائية والنهج البصرية. لذلك ، يمكن الكشف عن علاقات وظيفة الهيكل الحقيقي في دماغ حمار وحشي صغير باستخدام استراتيجية التعرض للدماغ هذه.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر الطريقة المقدمة نهجا بديلا لعزل الدماغ أو علاج يرقات حمار وحشي مع الأدوية التي تمنع التصبغ لتسجيل صور عالية الدقة للخلايا العصبية في بيئتها في الجسم الحي. نوعية الصور المسجلة مع هذه الطريقة مماثلة للصور من العقول المخططة، ولكن في ظل الظروف الطبيعية.
وعلاوة على ذل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تيمو فريتش بشكل خاص على الرعاية الممتازة للحيوانات وهيرمان دورينغ ومحمد إلساي وسول بوز منديز وجاكوب فون تروتا وكومالي فاليشيتي وباربرا وينتر على دعمهم المفيد. كما أننا ممتنون لجميع الأعضاء الآخرين في مختبر كوستر على ملاحظاتهم. وتم تمويل المشروع جزئيا من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (إلى RWK) و Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; ومن المسلم به عصر صافي NEURON الثاني CIPRESS المشروع 01EW1520 إلى JCM).
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
