Визуализация in vivo полностью активной мозговой ткани у бодрствующих личинок рыбок данио и молоди путем удаления черепа и кожи
Summary
Здесь мы представляем метод изображения эмбрионального мозга рыбок данио in vivo вплоть до личиночной и ювенильной стадий. Эта микроинвазивная процедура, адаптированная из электрофизиологических подходов, обеспечивает доступ к клеточным и субклеточным деталям зрелого нейрона и может сочетаться с оптогенетическими и нейрофармакологическими исследованиями для характеристики функции мозга и лекарственного вмешательства.
Abstract
Понимание эфемерных изменений, которые происходят во время развития и созревания мозга, требует детальной визуализации высокого разрешения в пространстве и времени с клеточным и субклеточным разрешением. Достижения в области молекулярных технологий и технологий визуализации позволили нам получить множество подробных сведений о клеточных и молекулярных механизмах развития мозга у прозрачного эмбриона рыбки данио. В последнее время процессы уточнения нейронной связности, которые происходят на более поздних личиночных стадиях через несколько недель после оплодотворения, которые, например, являются контролем социального поведения, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, переместились в фокус исследований. На этих стадиях пигментация кожи рыбок данио препятствует проникновению света в ткани мозга, и растворы для эмбриональных стадий, например, фармакологическое ингибирование пигментации, больше не осуществимы.
Поэтому предоставляется минимально инвазивное хирургическое решение для микроскопии доступа к мозгу бодрствующих рыбок данио, которое получено из электрофизиологических подходов. В телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микрочистки этих слоев, обнажая нижележащие нейроны и аксональные тракты без повреждений. Это позволяет регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, а также наблюдать физиологические изменения, такие как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события. Кроме того, возможно опрашивание этих процессов с помощью фармакологического торможения или оптогенетических манипуляций. Этот подход к воздействию на мозг предоставляет информацию о структурных и физиологических изменениях в нейронах, а также о корреляции и взаимозависимости этих событий в живой ткани мозга в диапазоне минут или часов. Этот метод подходит для визуализации мозга in vivo личинок рыбок данио в течение 30 дней после оплодотворения, последнего этапа развития, проверенного до сих пор. Он, таким образом, обеспечивает доступ к таким важным вопросам, как синаптическая очистка и масштабирование, аксональный и дендритный транспорт, синаптическое нацеливание цитоскелетного груза или локальная активность-зависимая экспрессия. Таким образом, можно ожидать широкого использования этого подхода к монтажу и визуализации.
Introduction
За последние десятилетия рыбка данио(Danio rerio)эволюционировала как один из самых популярных модельных организмов позвоночных для эмбриональных и личиночных исследований развития. Большая плодовитость самок рыбок данио в сочетании с быстрым ex utero развитием эмбриона и его прозрачностью на ранних эмбриональных стадиях развития являются лишь несколькими ключевыми факторами, которые делают рыбок данио мощным модельным организмом для решения вопросов развития1. Достижения в области молекулярно-генетических технологий в сочетании с исследованиями изображений in vivo с высоким разрешением позволили обратиться к клеточным биологическим механизмам, лежащим в основе процессов развития2. В частности, в области дифференцировки нейронов, физиологии, связности и функции рыбки данио пролили свет на взаимодействие молекулярной динамики, функций мозга и поведения организма в беспрецедентных деталях.
Тем не менее, большинство из этих исследований ограничены эмбриональной и ранней личиночной стадиями в течение первой недели развития, поскольку прозрачность ткани нервной системы постепенно теряется. На этих этапах ткани мозга не доступ к микроскопии высокого разрешения, которые защищаются дифференцировка черепа и пигментацией3.
Поэтому ключевые вопросы дифференцировки нейронов, созревания и пластичности, такие как уточнение нейронной связности или синаптическое масштабирование, трудно изучать. Эти клеточные процессы важны для того, чтобы определить клеточные механизмы, управляющие, например, социальным поведением, принятием решений или поведением, основанным на мотивации, областями, в которые исследования рыбок данио на личинках в возрасте нескольких недель недавно внесли ключевые выводы, основанные на поведенческих исследованиях4.
Фармакологические подходы к ингибированию пигментации у личинок рыбок данио в течение нескольких недель едва осуществимы или могут даже вызвать пагубные последствия5,6,7,8. Двойные или тройные мутантные штаммы со специфическими дефектами пигментации, такие как каспер9 или кристалл10,стали чрезвычайно ценными инструментами, но трудоемки в разведении, дают мало потомства и представляют опасность накопления генетических пороков развития из-за чрезмерного инбридинга.
Здесь предусмотрена минимально инвазивная процедура в качестве альтернативы, которая применима к любому штамму рыбок данио. Эта процедура была адаптирована из электрофизиологических исследований для регистрации активности нейронов у живых и бодрствующий личинок рыбок данио. При телеостах кожа и мягкий хрящ черепа могут быть аккуратно удалены путем микроочистки этих слоев, поскольку они не плотно переплетаются с сосудистой оболочкой головного мозга. Это позволяет подвергать воздействию ткани мозга, содержащей нейроны и аксональные тракты, без повреждений и регистрировать морфологию нейронов, включая синаптические структуры и их молекулярное содержимое, которые, в свою очередь, включают наблюдение физиологических изменений, таких как переходные процессы Ca2 + или внутриклеточные транспортные события в течение нескольких часов. Более того, помимо описательных характеристик, прямой доступ к мозговой ткани позволяет исследовать зрелые нейронные функции с помощью введения нейрофармакологических веществ и оптогенетических подходов. Таким образом, истинные структурные функциональные отношения могут быть выявлены в мозге ювенильных рыбок данио, используя эту стратегию воздействия на мозг.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный способ обеспечивает альтернативный подход к выделению мозга или обработке личинок рыбок данио фармацевтическими препаратами, ингибируя пигментацию для записи изображений нейронов с высоким разрешением в их среде in vivo. Качество изображений, записанных с помощью э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы особенно благодарим Тимо Фрича за отличный уход за животными и Германа Дёринга, Мохамеда Эльсея, Сола Позе-Мендеса, Якоба фон Троту, Комали Валишетти и Барбару Винтер за их полезную поддержку. Мы также благодарны всем остальным сотрудникам лаборатории Köster за их отзывы. Проект частично финансировался Немецким исследовательским фондом (DFG, KO1949/7-2), проектом 241961032 (RWK) и Бундесминистериумом для Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 to JCM) признан.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
