マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

メモ: 図示のプロトコルの概略ワークフローを 図 2 に示します。 1. φC31 attB タグプラスミドの設計(図3) 以下の必須成分を含む attB ドナープラスミドの作成 優性蛍光マーカー 蛍光マーカーの発現を駆動するプロモーターを選択します。注:アノフェレスのトランスジェネシスの場合、蛍光マーカーは通常、目および神経索における発現を促進する3xP3プロモーター39の調節下にある。あるいは、PUBcプロモーター5は、複数の組織での発現が望まれる場合に使用することができる。このプロトコルの例として使用されるドナープラスミドおよびドッキングラインは、3xP3プロモーターを使用してマークされる。 受信ドッキングラインの蛍光タンパク質(FP)と互換性のある蛍光タンパク質(FP)を選択して、容易に区別できるようにします。メモ: ドッキングラインに既に存在するマーカーと同じマーカーを使用しないでください。GFP(緑)/YFP(黄色)とGFP(緑)/CFP(シアン)は、確実に区別するのが非常に難しいため、同時に使用しないでください。このプロトコルの例として使用されるドナープラスミドは、CFPでマークされたドッキングラインに組み込まれるため、DsRedまたはYFPのいずれかでマークされています。 attB 組換え部位 トランスジェニックカセットの統合には単一のattBサイトを使用します(シングルattB設計)(図3A)。 RMCE(ダブルattB設計)では、2つの反転attB部位を使用し、部位が互いに逆さまに置かれ、ドナーDNAテンプレートを囲む(図3B)。メモ: attB サイトの向きは、ドッキングラインに存在する attP サイトの向きと互換性がある必要があります。 希望する導入遺伝子貨物 実験の特定の目的に基づいて蚊ゲノムに組み込まれる他の所望の特徴を使用する。ここでは、アン・ ステファンシ のゲノムへの抗マラリアエフェクター分子の統合と、GAL4/UASシステムの構成要素の アン・ガンビア蚊 への統合について説明します。 プラスミド骨格成分 細菌におけるプラスミド複製のための他の必須成分の中でも、インビトロでのプラスミド選択のためのマーカー(すなわち、 抗生物質耐性遺伝子)を含む。注:プラスミド骨格は、組み込みのためのシングルattB設計では蚊ゲノムに組み込まれますが(図3A)、RMCEのダブルattB設計では挿入されません(図3B)。 2. マイクロインジェクションミックス用プラスミドの調製 注:ここに示されているプロトコルは、目的の導入遺伝子を保持するattBタグ付きドナープラスミドと、ショウジョウバエHsp70プロモーター40の調節下でφC31インテグラーゼを発現するヘルパープラスミドの2つのプラスミドの使用を含む。 エンドトキシンフリープラスミド精製キットを使用してドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します。注:注射に使用する最終プラスミド調製物を配列決定し、すべての成分の完全性を検証します。 2つのプラスミドを適量組み合わせて、注入バッファーに再懸濁したときにドナープラスミドの最終濃度350ng/μLおよびヘルパープラスミド150ng/μLの混合物を得る。注:ミックスの必要量を計算するときは、計画された注射の毎日に10〜15μLで十分であり、DNAを事前に調製し、-20°Cで保存できることを考慮してください。 インテグラーゼヘルパープラスミド濃度60~500 ng/μL、ドナープラスミド濃度85~200 ng/μLも報告されています21,22,26,41。 0.1倍量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)と2.5倍量の氷冷100%EtOHおよびボルテックスを加えてDNAを沈殿させる。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。高濃度の初期プラスミド調製物(すなわち、〜1μg/μL)を有すると、沈殿効率が向上する。注:停止点 – 沈殿物は-20°Cで一晩保存することができます。 15,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを1mLの氷冷70%EtOHで洗浄した。 ペレットを氷冷70%EtOH1mLで洗浄し、15,000 x g で室温で5分間遠心分離する。 ペレットを乱さずに上澄み液を捨て、風乾する。 ペレットを1x注射バッファー(0.1 mM Na3PO4、5 mM KCl、pH 7.2、0.22 μmフィルター滅菌)に再懸濁し、総最終濃度500 ng/μLに達する。注:沈殿プロセス中にいくつかのDNAが失われると仮定します。したがって、最初により少ない容量の注入バッファーを追加し、分光光度計(Nanodropなど)で濃度を確認してから、500ng/μLに達するように適切な残りの容量を追加します。 DNAが完全に再懸濁されていることを確認し、それぞれ10〜15μLのアリコートを調製し、-20°Cで保存する。 注射当日、1つのアリコートと遠心分離機を15,000 x g で5分間解凍し、粒子状残留物を除去します。注:微粒子除去の代替方法は、0.22μmフィルターで溶液をろ過することです。胚マイクロインジェクション中に針が閉塞するため、インジェクションミックス中に微粒子残留物が存在することは避けてください。 3. アノフェレスド ッキングラインからの胚のマイクロインジェクション マイクロインジェクションの72時間前に所望のドッキングラインから生後4〜7日の蚊に血液を供給する(すなわち、月曜日および火曜日の注射のために前の金曜日に女性に餌を与え、木曜日および金曜日の注射のために同じ週の月曜日に女性に餌を与える)。 同じ日に野生型(WT)の蚊(すなわち、ドッキングラインの同じゲノム背景を有する蚊)に血液を供給する。これらは交差点に必要になります。注:血液ミールのサイズと質は卵の質に影響するため、常に新鮮な血液(つまり、過去7日以内に採取された血液) を使用することをお勧めします。腕の餌やりやマウスへの給餌は卵の質と量を増やすかもしれませんが、これらの方法は奨励されていません。ヒトおよび動物の使用には、特定の承認されたプロトコルが必要になります。 胚マイクロインジェクションの実施 25mM NaCl42でガンビア胚マイクロインジェクションを行い、胚の後極を45度の角度で標的とする。胚収集、アライメント、およびマイクロインジェクションのための詳細なプロトコルについては、Pondeville et al.43およびLobo et al.44を参照されたい。 An. stephensi胚のマイクロインジェクションをハロカーボンオイル700:27(2:1)に、胚の後極を30度の角度で標的にして行う。胚収集、アライメント、およびマイクロインジェクションのための詳細なプロトコルは、Terenius et al.45およびLobo et al.44に見出すことができる。 注射直後の卵を滅菌蒸留水(pH 7.2)で満たされたペトリ皿に移し、昆虫の状態に戻す。 孵化したら、G0 幼虫を塩漬け蒸留水(0.1%強壮塩)を入れたトレイに移し、蛹に後方に移す。 孵化率を記録する(すなわち、 孵化した幼虫の数/注入された胚の数)。注:胚の動きは孵化を助けるので、穏やかな渦巻きが望ましいです。孵化は注射後〜48時間で開始する必要があります。注射はわずかな発育遅延を引き起こす可能性があるので、孵化後期幼虫を3〜4日間監視し続けることをお勧めします。 4. 形質転換個体の交配とスクリーニング [任意工程]スクリーニングG0 (注入)第 1齢または第 2齢幼虫(L1−L2)を蛍光マーカーの一過性発現のために。 細かい先端ガラスピペットを使用して、G0 L1-L2幼虫をウェル付きの顕微鏡スライドに移します。各井戸に1匹の幼虫を置きます。 適切なフィルターを備えた蛍光ステレオスコープを使用して、蛍光マーカーの一過性発現の存在をスクリーニングします。注:一過性発現のパターンは、使用されるプロモーターによって決定される。3xP3プロモーターを用いた場合、蛍光マーカーの一過性の発現が肛門乳頭において視認される(Pondeville et al.43の図6参照)。 後部G0陽性個体は 別々に。 G0の蛹をステレオスコープの下で性別でソートする52。 男性を3〜5人のグループ(創始者家族)の別々のケージに出現させ、年齢が一致したWT女性の10倍を超えるものを追加します。注:男性は複数回交尾するため、各男性の交配可能性を最大化するために、過剰なWT女性を提供することが重要です。 雌を10〜15人のグループ(創始者家族)の別々のケージに出現させ、年齢が一致したWT男性を同数追加させる。注:昆虫のスペースが限られている場合、女性は1つのケージにすべて一緒に現れる可能性があります。女性対男性の比率は、1人の男性対3人の女性と同じくらい低くすることができます。 大人が4〜5日間交尾し、女性に血液の食事を提供するのを許可します。注:複数の淋栄養サイクルから形質転換体を得る可能性を最大限に高めるために、G0 雌から複数回採血および卵子を採取する。 血液は、交差のために同時にWT個体を供給する。 卵を集めて、次世代のG1を育てましょう。 適切な蛍光についてG1 L3−L4 幼虫をスクリーニングし、形質転換体を同定する。 ろ紙を敷いたペトリ皿、または顕微鏡スライドとスクリーンに幼虫を採取し、 attBタグ付き貨物で導入されたマーカーの存在に適したフィルターを備えた蛍光ステレオスコープを使用します。注: 3xP3 プロモーターによって駆動される蛍光は、胚発生後のすべての段階で見え、スクリーニングは若い幼虫に対して行われ得るが、これらはより脆弱であり、比較的慎重に取り扱わなければならない。蛹もスクリーニングすることができます。 新規および既存のマーカーの存在のための統合画面のための単一attB 設計の場合;新しいカセットが元のカセットの隣に挿入されるため、両方とも存在するはずです(図3A、 図4)。メモ: 単一の attB デザインのスクリーニング例外: マーカーのないドッキングライン 22 を使用する場合は、新しいマーカーの存在のみをスクリーニングします。積分が既存のマーカー21の不活性化をもたらすドッキングラインを使用する場合、新しいマーカーの存在および既存のマーカーの喪失についてスクリーニングする。 RMCEのダブルattB デザインでは、新しいマーカーの存在と既存のマーカーの喪失をスクリーニングし、新しいカセットが元のマーカーを置き換えるため、新しく導入されたマーカーのみが存在する必要があります(図3B、 図5)。注: RMCE 実験では、1 つの attP のみが再結合され、両方のマーカーが存在する RMCE 実験では、時折の統合イベントを回復できます。G1個体のスクリーニングは、同じ手順に従って蛹の段階でも行うことができる52。 形質転換されたG1 個体を幼虫トレイに移し、蛹に後方に移す。非蛍光個体および予期せぬマーカー発現パターンを有する個体を捨てる。 G1の蛹を性別で分類し、性別の年齢が一致したWTの個体と一斉に交差させた。 大人が4〜5日間交尾し、血液食事を提供し、卵を集め、次世代のG2 子孫を育てることを可能にする。 単一の統合実験では、統合部位がすべての個体で同一であるため、 一括 十字から直接卵を収集します。 RMCE実験では、単一の雌から卵子を収集し、2つの代替カセット配向の潜在的な存在のために分子評価が完了するまで、子孫を別々に維持する(図3B)。 G2の子孫(幼虫または蛹の段階のいずれか)に蛍光マーカーの存在(個体の50%が陽性であると予想される)をスクリーニングし、非蛍光の子孫を捨てる。 分子分析のためにG2 陽性個体のサブセットを脇に置いておき、残りを成人期に戻します。注:すべてのG2 個体を生かさなければならない場合、分子分析は、シングルアダルトの脚46 または蛹症例DNA抽出(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)に対して実施することができる。あるいは、すべてのG2 個体が産卵し、卵が孵化した後に分子分析を行うことができる。 成人の男性と女性が同じケージ内で交配して、新しいトランスジェニックラインを確立することを許可します。注:RMCE実験では、分子分析によって挿入の向きが決定されるまで、単一の女性に由来する兄弟間で成体の交配が起こらなければならない。 5. DNA増幅(PCR)による挿入部位の分子検証 形質転換後のドッキングラインのゲノムに予測された挿入部位のマップを作製する。 単一組み込み:予測された挿入部位が、元のドッキング構築物に加えて、2つのハイブリッド部位 attL および attR 間のドナープラスミドの全配列を含むことを確認します(図3A)。 RMCE:予測された挿入部位が、ハイブリッド反転 attL 部位が元の反転atpp部位を置き換え、交換テンプレートがそれらの間に元々存在するカセットを置き換えるドッキングラインの 挿入部位と 同一であることを確認してください(図3B)。 オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、集積遺伝子座の両側における挿入接合部を増幅する。 単一統合: attR および/または attL 部位にまたがるオリゴヌクレオチドプライマー対を設計する。一方のプライマーは、以前に組み込まれたドッキング構築物に結合しなければならず、他方のプライマーは、新たに組み込まれた導入遺伝子に結合しなければならない(図3A)。 RMCE:カセット置換は、染色体(AおよびBと命名)に対して 2つの異なる向き で起こり得る。4つのオリゴヌクレオチドプライマーの代替組み合わせを設計して、一方の対が配向Aについて診断され、他方の対が配向Bについて診断される(図3B、 図6)という、一方の配向のみにおいて離散的な生成物を得る。 G2陽性個体からゲノムDNAを抽出し、診断PCRおよびゲル電気泳動を実行して、予測された集積部位マップから予想される診断アンプリコンの存在を可視化する。注:DNAは、代わりに、シングルアダルトの脚46 または蛹の症例(L. Grigorakiの個人的なコミュニケーション)から抽出することができます。 PCR産物を配列し、予想される配列を確認する。 図2.アノフェレス蚊における部位特異的φC31ゲノム改変のワークフロー図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3.φC31媒介単集積(A)およびRMCE(B)の分子基盤。 A) 単一のattP部位を有し、CFPでマークされた単一のattP遺伝子組み換えライン(上段)、DsRedでマークされたシングルattBデザインドナープラスミド(中央)、および組込みが成功した後に生じる予想される挿入部位(下段)におけるゲノム挿入の概略マップ。B)2つの逆attP部位およびCFPでマークされた2つの逆attP部位(上段)、YFPでマークされたダブルattBデザインドナープラスミド(中央)、およびRMCEが成功した後に生じる予想される挿入部位(下段)を運ぶ、アン・ガンビアエ・ドッキングライン(A11、表1)におけるゲノム挿入の概略マップ。波線:蚊のゲノム;縞模様の矢:ピギーバックトランスポゾンアーム;3xP3:蛍光マーカーのプロモーター;SV40:ウイルスターミネーター;オリ:複製の起源。AmpR:アンピシリン耐性遺伝子。交差線は、attP サイトと attB サイト間の再結合のサイトを表します。番号の付いた黒い矢印は、挿入遺伝子座の分子検証のためのプライマー結合部位を表す(プロトコールのステップ5)。完全に注釈が付けられたシングルおよびダブルattBタグ付きプラスミドは、要求に応じて著者らから入手可能である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。