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Genetics

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Published: February 02, 2021
doi:
10.3791/62146
, , ,
1Vector Biology Department,Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics,University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry,University of California

Summary

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l’integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Abstract

L’analisi genomica funzionale e le relative strategie per il controllo genetico della malaria si basano su metodi convalidati e riproducibili per modificare con precisione il genoma delle zanzare Anopheles. Tra questi metodi, il sistema φC31 consente l’integrazione precisa e stabile diretta al sito dei transgeni, o la sostituzione di cassette transgeniche integrate tramite scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE). Questo metodo si basa sull’azione della batteriofago integrasi streptomyces φC31 per catalizzare la ricombinazione tra due specifici siti di attacco designati attP (derivato dal fago) e attB (derivato dal batterio ospite). Il sistema utilizza uno o due siti attP che sono stati precedentemente integrati nel genoma della zanzara e nei siti attB nel DNA del modello donatore. Qui illustriamo come modificare stabilmente il genoma delle linee di atnopheles portanti attP usando due plasmidi: un donatore con tag attB che porta il modello di integrazione o scambio e un plasmide helper che codifica l’integrasi φC31. Riportiamo due risultati rappresentativi della modifica diretta dal sito mediata da φC31: la singola integrazione di una cassetta transgenica in An. stephensi e RMCE nelle zanzare An. gambiae. φ La manipolazione del genoma mediata da C31 offre il vantaggio di un’espressione transgenica riproducibile da siti genomici convalidati e neutri per l’idoneità, consentendo analisi comparative qualitative e quantitative dei fenotipi. La natura site-directed dell’integrazione semplifica inoltre sostanzialmente la validazione del singolo sito di inserimento e lo schema di accoppiamento per ottenere una linea transgenica stabile. Queste e altre caratteristiche rendono il sistema φC31 un componente essenziale del toolkit genetico per la manipolazione transgenica delle zanzare della malaria e di altri insetti vettori.

Introduction

La capacità di modificare il genoma delle zanzare vettori di malattie in modo affidabile e riproducibile ha rafforzato la convalida funzionale in vivo dei geni e ha aperto le porte a strategie di controllo dei vettori genetici realizzabili, come quelle che prendono di mira le zanzare Anopheles che trasmettono la malaria1.

L’editing precoce del genoma delle zanzare si basava esclusivamente sulla trasformazione mediata da elementi trasponibili (TE), con piggyBac che era il trasposone più comunemente usato in Anopheles2,3,4. Tuttavia, la natura casuale dell’integrazione di TE può portare a modifiche indesiderate come knockout genici (mutagenesi inserzionale) e significativi effetti di posizione sull’espressione transgenica5,6,7,8. Gli inserimenti multipli sono anche un evento comune quando si utilizza piggyBac5,9, il che rende laboriosa la convalida e l’isolamento di linee transgeniche con singole inserzioni. Altri inconvenienti includono la loro potenziale rimobilitazione, come osservato nella linea germinale di Anopheles stephensi quando si fornisce una fonte di trasposasi piggyBac10,11,12, e la loro dimensione limitata del carico di DNA (10-15 kb di lunghezza) con l’efficienza di trasformazione che diminuisce con l’aumentare delle dimensioni del plasmide donatore13,14.

Sono stati introdotti approcci di integrazione diretti al sito per aggirare questi problemi. La modificazione del genoma più comune nelle zanzare è quella mediata dal sistema φC31 (Figura 1a). Questo è guidato da un’integrasi virale che catalizza la ricombinazione tra due siti di attaccamento eterospecifico (att) che si verificano naturalmente nel genoma del batteriofago φC31 (attP) e nel batterio streptomyces ospite (attB)15. La ricombinazione dei due siti è unidirezionale e provoca la formazione di siti ibridi (attL e attR). La ricombinazione di tali siti ibridi (che porta all’escissione del DNA) richiederebbe non solo la presenza di un’integrasi virale attiva, ma anche di un altro fattore di ricombinazione codificato con fagi16,17. Viene così generato un sito di integrazione stabile che allevia il problema della potenziale rimobilitazione indesiderata15. Inoltre, il sistema consente l’integrazione di carichi di grandi dimensioni (ad esempio, l’integrazione di >costrutti da 100 kb è stata riportata in D. melanogaster18), aumentando significativamente le capacità di carico. L’integrazione avviene in un unico locus genomico predefinito che semplifica notevolmente la validazione dell’inserzione e lo schema di accoppiamento per ottenere una linea transgenica stabile. Infine, la natura site-directed dell’integrazione consente la normalizzazione dell’espressione in quanto i transgeni alternativi si trovano nello stesso locus e quindi sono regolati all’interno dello stesso contesto genomico vicino. Infatti, una delle principali applicazioni della tecnica è il confronto diretto di fenotipi conferiti da diversi transgeni a seguito dell’inserimento in un locus identico.

Il raggiungimento dell’integrazione mediata da φC31 comporta due fasi: la fase I è la creazione di linee di attracco transgeniche che trasportano siti attP e la fase II è l’integrazione diretta dal sito di un carico affiancato da attB nel genoma della linea di attP19. La creazione di linee di attracco di fase I si è basata sull’integrazione casuale mediata da TE di costrutti con tag attP e quindi ha comportato un processo laborioso iniziale (tra cui analisi southern blot e PCR inversa su progenie monoparentale) per isolare e convalidare linee transgeniche che trasportano un singolo evento di integrazione in posizioni genomiche uniche, trascrizionalmente attive e neutre per il fitness. Tuttavia, diverse linee di attracco per l’integrazione singola mediata da φC31 sono state sviluppate e convalidate in An. gambiae19,20,21,22 e in An. stephensi23,24,25 (Tabella 1). Ognuna di queste linee varia in termini di posizione genomica del sito di attracco e del background genetico specifico del ceppo e da esse può essere creata una grande varietà di nuove linee transgeniche. La complessa convalida delle integrazioni mediate da TE per la produzione di linee di attracco può ora essere aggirata dalla tecnologia CRISPR/Cas926; tuttavia questo si basa sulla conoscenza a priori dei loci neutri da prendere di mira e delle loro sequenze circostanti.

L’integrazione mediata da φC31 è stata ampiamente applicata all’editing del genoma degli insetti dall’organismo modello D. melanogaster27, alle zanzare Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 e An. stephensi24, così come ad altri insetti tra cui Ceratitis capitata30 e Bombyx mori31.

Una limitazione dell’integrazione mediata da φC31, soprattutto in vista di potenziali rilasci di campo per il controllo dei vettori, è l’integrazione nel genoma della zanzara dell’intero plasmide donatore portatore di attB, comprese sequenze indesiderate come marcatori genici di resistenza agli antibiotici e componenti della spina dorsale plasmidica di origine batterica. Per risolvere questo problema, è stata implementata una modifica del sistema standard, lo scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE), che consente la sostituzione precisa di una cassetta transgenica precedentemente integrata con un nuovo DNA donatore (Figura 1b). Ciò si ottiene utilizzando due siti att invertiti che fiancheggiano le cassette del donatore e del ricevente a ciascuna estremità, che guidano due eventi di ricombinazione indipendenti che avvengono simultaneamente con conseguente scambio di cassette senza integrazione della spina dorsale del plasmide. Questo design migliorato aggira l’integrazione di sequenze indesiderate ed espande l’applicazione dei sistemi φC31 per includere, ad esempio, l’integrazione di carichi di DNA non marcati mediante screening per la perdita di un marcatore fluorescente precedentemente integrato32.

RMCE è stato raggiunto prima con D. melanogaster32 e successivamente applicato con successo a insetti non modello tra cui An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 e B. mori35. Diverse linee di attracco per RMCE sono state sviluppate e convalidate in An. gambiae5,9,26 (Tabella 1). Per quanto ne sappiamo, RMCE deve ancora essere esplorato in altre specie di vettori di Anopheles.

Ad oggi, il sistema φC31 è stato ampiamente utilizzato nelle zanzare Anopheles per introdurre e studiare una varietà di molecole tra cui effettori antimalaria19,24,36, componenti del sistema GAL4/UAS per sovraesprimere e abbattere geni per studi di resistenza agli insetticidi9,33, elementi regolatori, geni reporter5,21,37 ed elementi gene-drive26 ,38.

Questo protocollo descrive come eseguire 1) l’integrazione diretta dal sito di un carico affiancato da attB e 2) RMCE di un costrutto affiancato da siti attB invertiti nel genoma delle linee di attracco di Anopheles . Ciò si ottiene utilizzando due plasmidi: un plasmide donatore con tag attB che trasporta il transgene di interesse e un plasmide helper che esprime l’integrasi φC31 . I principali vettori della malaria An. gambiae e An. stephensi sono usati come esempi specifici, tuttavia questi protocolli sono applicabili ad altre specie di Anopheles .

Figure 1
Figura 1. Modificazioni del genoma site-directed, integrazione singola e scambio di cassette mediato dalla ricombinasi (RMCE), utilizzando il sistema φC31. L’integrasi φC31 (INT, freccia doppia grigia) catalizza la ricombinazione tra i siti attB (a strisce viola) presenti in un plasmide donatore e i siti attP (a strisce blu) presenti in una linea di aggancio ricevente, il che si traduce nella formazione di siti ibridi attL e attR. A) L’integrazione si ottiene quando singoli siti attB e attP si ricombinano e si traduce nella presenza di due marcatori integrati (blu e rosso). B) RMCE si verifica quando due siti attB/P si ricombinano simultaneamente e comporta la sostituzione della cassetta tra i siti att della linea di att (marcatore blu) con quello trasportato dal plasmide donatore (marcatore rosso). C) Sequenze nucleotidiche parziali di attP (blu) e attB (viola) e dei siti ibridi attL/R. La ricombinazione avviene tra le sequenze core ‘TT’ evidenziate in grassetto nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

NOTA: un flusso di lavoro schematico del protocollo illustrato è illustrato nella Figura 2. 1. Progettazione di plasmidi φC31 attB -tagged (Figura 3) Creare plasmidi donatori attB che trasportano i seguenti componenti essenziali Marcatore fluorescente dominante Scegli un promotore per guidare l’espressione del marcatore fluorescente.NOTA: Per la transgenesi di Anopheles, i marcatori fluorescenti sono solitamente sotto la regolazione del promotore 3xP339, che guida l’espressione negli occhi e nel cordone nervoso. In alternativa, il promotore PUBc5 può essere utilizzato quando si desidera l’espressione in più tessuti. I plasmidi donatori e le linee di attracco utilizzate come esempi in questo protocollo sono contrassegnati utilizzando il promotore 3xP3. Scegliere una proteina fluorescente (FP) compatibile con quella della linea di aggancio ricevente in modo che siano facilmente distinguibili.NOTA: non utilizzare lo stesso marcatore già presente nella linea di attracco ed evitare l’uso simultaneo di GFP (verde)/YFP (giallo) e GFP (verde)/CFP (ciano) in quanto sono molto difficili da differenziare in modo affidabile. I plasmidi donatori utilizzati come esempi in questo protocollo sono contrassegnati con DsRed o YFP in quanto devono essere integrati in una linea di attracco contrassegnata con CFP. sito(i) di ricombinazione attB Utilizzare un singolo sito attB per l’integrazione di una cassetta transgenica (single-attB design) (Figura 3A). Utilizzare due siti attB invertiti per RMCE (double-attB design) in cui i siti giacciono invertiti l’uno rispetto all’altro e racchiudere il modello di DNA del donatore (Figura 3B).NOTA: L’orientamento dei siti attB deve essere compatibile con quello dei siti attP presenti nella linea di attracco. Carico transgenico desiderato Utilizzare qualsiasi altra caratteristica desiderata da integrare nel genoma della zanzara in base allo scopo specifico dell’esperimento. Qui, descriviamo l’integrazione di una molecola effettore antimalarica nel genoma di An. stephensi e l’integrazione dei componenti del sistema GAL4 / UAS nelle zanzare An. gambiae . Componenti della dorsale plasmidica Includere, tra gli altri componenti essenziali per la replicazione del plasmide nei batteri, un marcatore per la selezione del plasmide in vitro (cioè un gene di resistenza agli antibiotici).NOTA: La spina dorsale plasmidica sarà integrata nel genoma della zanzara nel progetto single-attB per l’integrazione (Figura 3A), mentre non sarà inserita nel design double-attB per RMCE (Figura 3B). 2. Preparazione di plasmidi per la miscela di microiniezione NOTA: Il protocollo qui illustrato prevede l’uso di due plasmidi: un plasmide donatore con tag attB che trasporta il transgene di interesse e un plasmide helper che esprime l’integrasi φC31 sotto la regolazione del promotore Drosophila Hsp7040. Purificare i plasmidi donatori e aiutanti utilizzando un kit di purificazione del plasmide privo di endotossine.NOTA: Sequenziare la preparazione finale del plasmide utilizzato per l’iniezione per verificare l’integrità di tutti i componenti. Combinare quantità appropriate dei due plasmidi per ottenere una miscela con una concentrazione finale di 350 ng/μL del plasmide donatore e 150 ng/μL del plasmide helper quando risospeso nel tampone di iniezione.NOTA: Quando si calcola il volume necessario di miscela, considerare che 10-15 μL sono sufficienti per ogni giorno di iniezioni pianificate e il DNA può essere preparato in anticipo e conservato a -20 °C. Sono state riportate anche concentrazioni di plasmidi helper integrasi di 60-500 ng/μL e concentrazioni di plasmidi donatori di 85-200 ng/μL21,22,26,41. Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumi di EtOH e vortice 100% ghiacciati. Un precipitato bianco dovrebbe essere immediatamente visibile. Avere preparati plasmidici iniziali altamente concentrati (cioè ~ 1 μg / μL) migliora l’efficienza delle precipitazioni.NOTA: Punto di arresto – Il precipitato può essere conservato a -20 °C durante la notte. Centrifugare a 15.000 x g per 20 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di EtOH al 70% ghiacciato. Lavare il pellet con 1 mL di EtOH 70% ghiacciato e centrifugare a 15.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet e asciugare all’aria. Risospese il pellet in 1x tampone di iniezione (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, filtro 0,22 μm sterilizzato) per raggiungere una concentrazione finale totale di 500 ng/μL.NOTA: Supponiamo che parte del DNA andrà perso durante il processo di precipitazione; pertanto, aggiungere prima un volume minore di tampone di iniezione, controllare la concentrazione su uno spettrofotometro (ad esempio, Nanodrop) e quindi aggiungere un volume rimanente appropriato per raggiungere 500 ng / μL. Assicurarsi che il DNA sia completamente risospeso, preparare aliquote di 10-15 μL ciascuna e conservarle a -20 °C. Il giorno dell’iniezione, scongelare un’aliquota e centrifugare a 15.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali residui di particolato.NOTA: un metodo alternativo per la rimozione del particolato consiste nel filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Evitare la presenza di residui di particolato nella miscela di iniezione in quanto portano al blocco dell’ago durante la microiniezione embrionale. 3. Microiniezione di embrioni da una linea di attracco Anopheles Le zanzare di 4-7 giorni alimentano il sangue dalla linea di attracco desiderata 72 ore prima della microiniezione (cioè, per iniezione il lunedì e il martedì nutrono le femmine il venerdì precedente; per l’iniezione il giovedì e il venerdì nutrono le femmine il lunedì della stessa settimana). Il sangue alimenta le zanzare wild-type (WT) (cioè le zanzare con lo stesso background genomico della linea di attracco) nello stesso giorno; questi saranno necessari per l’outcrossing.NOTA: Le dimensioni e la qualità della farina di sangue influenzano la qualità delle uova, quindi si consiglia di utilizzare sempre sangue fresco (cioè sangue prelevato nei 7 giorni precedenti). L’alimentazione delle braccia o l’alimentazione dei topi può aumentare la qualità e la quantità delle uova, tuttavia questi metodi non sono incoraggiati. Saranno necessari protocolli specifici approvati per l’uso umano e animale. Eseguire microiniezioni embrionali Eseguire microiniezioni embrionali di An. gambiae in 25 mM NaCl42 prendendo di mira il polo posteriore dell’embrione con un angolo di 45 gradi. Per un protocollo dettagliato per la raccolta, l’allineamento e la microiniezione di embrioni fare riferimento a Pondeville et al.43 e Lobo et al.44. Eseguire microiniezioni embrionali An. stephensi in olio di alocarbonio 700:27 (2:1) prendendo di mira il polo posteriore dell’embrione con un angolo di 30 gradi. Un protocollo dettagliato per la raccolta, l’allineamento e la microiniezione degli embrioni può essere trovato in Terenius et al.45 e Lobo et al.44. Trasferire le uova immediatamente dopo l’iniezione in una capsula di Petri riempita con acqua distillata sterile (pH 7,2) e riportarle in condizioni insetticide. Alla schiusa, trasferire le larve G0 in un vassoio con acqua distillata salata (0,1% di sale tonico) ogni giorno e allevare alle pupe. Record del tasso di schiusa (cioè numero di larve nate/numero di embrioni iniettati).NOTA: il movimento dell’embrione aiuta la schiusa, quindi è auspicabile un vortice delicato. La schiusa dovrebbe iniziare ~ 48 ore dopo l’iniezione. Poiché l’iniezione può causare un leggero ritardo dello sviluppo, è consigliabile continuare il monitoraggio delle larve che si schiudono tardi per 3-4 giorni. 4. Incrocio e screening di individui trasformati [PASSAGGIO FACOLTATIVO] Schermo G0 (iniettato) 1a o 2a larva instar (L1-L2) per l’espressione transitoria del marcatore fluorescente. Utilizzare una pipetta di vetro a punta fine per trasferire le larve G0 L1-L2 in un microscopio vetrini con pozzetti. Metti una larva in ogni pozzetto. Utilizzare uno stereoscopio a fluorescenza con l’apposito filtro per schermare la presenza di espressione transitoria del marcatore fluorescente.NOTA: il modello di espressione transitoria è dettato dal promotore utilizzato. Quando si utilizza il promotore 3xP3 , l’espressione transitoria del marcatore fluorescente è visibile nelle papille anali (vedere Figura 6 in Pondeville et al.43) Individui positivi G0 posteriori separatamente. Ordina le pupe G0 per sesso sotto uno stereoscopio52. Lascia che i maschi emergano in gabbie separate in gruppi di 3-5 (famiglie fondatrici) e aggiungi un eccesso di 10 volte delle femmine WT di pari età.NOTA: Poiché i maschi si accoppiano più volte, è importante fornire un eccesso di femmine WT per massimizzare le possibilità di accoppiamento di ciascun maschio. Lascia che le femmine emergano in gabbie separate in gruppi di 10-15 (famiglie fondatrici) e aggiungi un numero uguale di maschi WT di pari età.NOTA: Se c’è uno spazio limitato nell’insetto, le femmine possono emergere tutte insieme in un’unica gabbia. Il rapporto femmina-maschio può essere basso come 1 maschio a 3 femmine. Consentire agli adulti di accoppiarsi per 4-5 giorni e fornire alle femmine un pasto di sangue.NOTA: Nutrire il sangue e raccogliere le uova dalle femmine G0 più volte per massimizzare le possibilità di ottenere trasformanti da più cicli gonotrofici. Gli individui WT alimentati dal sangue allo stesso tempo per l’outcrossing. Raccogli le uova e alleva i G1 emergenti di prossima generazione. Schermare le larve G1 L3-L4 per una fluorescenza appropriata per identificare i trasformanti. Raccogliere le larve in una capsula di Petri rivestita di carta da filtro o su un vetrino e schermo del microscopio utilizzando uno stereoscopio fluorescente con filtri appropriati per la presenza del marcatore introdotto con il carico con tag attB.NOTA: La fluorescenza guidata dal promotore 3xP3 è visibile in tutti gli stadi postembrionali e lo screening può essere eseguito su larve più giovani, tuttavia queste sono più fragili e devono essere maneggiate con relativa attenzione. Le pupe possono anche essere schermate. Per progetti single-attB per schermo di integrazione per la presenza del marcatore nuovo e preesistente; dovrebbero essere entrambi presenti poiché la nuova cassetta è inserita accanto a quella originale (Figura 3A, Figura 4). NOTA: eccezione di screening per i singoli progetti attB : quando si utilizzano linee di docking senza marcatore22, schermare solo la presenza del nuovo marcatore. Quando si utilizzano linee di aggancio in cui l’integrazione comporta l’inattivazione del marcatore preesistente21, schermare la presenza del nuovo marcatore e la perdita di quello preesistente. Per i progetti a doppio attB per RMCE, lo schermo per la presenza del nuovo marcatore e la perdita di quello preesistente, dovrebbe essere presente solo il marcatore appena introdotto poiché la nuova cassetta sostituisce quella originale (Figura 3B, Figura 5).NOTA: gli eventi di integrazione occasionali possono essere recuperati negli esperimenti RMCE in cui solo un singolo attP è stato ricombinato e quindi saranno presenti entrambi i marcatori. Lo screening dei soggetti G1 può essere effettuato anche nella fase della pupa seguendo la stessa procedura52. Trasferire gli individui G1 trasformati in un vassoio larvale e posteriore alle pupe. Scartare individui non fluorescenti e individui con un modello di espressione marcatore inaspettato. Ordina le pupe G1 in base al sesso e incrociale in massa con individui WT di sesso opposto abbinati all’età. Consentire agli adulti di accoppiarsi per 4-5 giorni, fornire un pasto di sangue, raccogliere le uova e allevare la progenie G2 di prossima generazione. Per gli esperimenti di integrazione singola, raccogliere le uova direttamente dalla croce in massa poiché il sito di integrazione è identico in tutti gli individui. Per gli esperimenti RMCE, raccogliere le uova da singole femmine e mantenere la progenie separata fino al completamento della valutazione molecolare a causa della potenziale presenza di due orientamenti alternativi della cassetta (Figura 3B). Esaminare la progenie G2 (allo stadio di larva o pupa) per la presenza del marcatore fluorescente (il 50% degli individui dovrebbe essere positivo), scartare la progenie non fluorescente. Mettere da parte un sottogruppo di individui G2 positivi per l’analisi molecolare, allevare il resto all’età adulta.NOTA: Se tutti gli individui G2 devono essere mantenuti in vita, l’analisi molecolare può essere condotta su zampe di un singolo adulto46 o estrazioni di DNA di casi pupali (comunicazione personale di L. Grigoraki). In alternativa, l’analisi molecolare può essere eseguita dopo che tutti gli individui G2 si sono oviposti e le uova si sono schiuse. Consenti ai maschi e alle femmine adulti di incrociarsi nella stessa gabbia per stabilire la nuova linea transgenica.NOTA: Per gli esperimenti RMCE, l’intercross adulto deve verificarsi tra fratelli derivanti da una singola femmina fino a quando l’orientamento dell’inserimento non viene determinato tramite analisi molecolare. 5. Validazione molecolare del sito di inserimento mediante amplificazione del DNA (PCR) Preparare una mappa del sito di inserimento previsto nel genoma della linea di attracco dopo la trasformazione. Integrazione singola: assicurarsi che il sito di inserimento previsto porti il costrutto di attracco originale più l’intera sequenza del plasmide donatore tra i due siti ibridi attL e attR (Figura 3A). RMCE: assicurarsi che il sito di inserimento previsto sia identico a quello della linea di attL ibrida invertita sostituisce i siti attP invertiti originali e il modello di scambio sostituisca la cassetta originariamente presente tra di loro (Figura 3B). Progettare primer oligonucleotidici per amplificare la giunzione inserzionale su entrambi i lati del locus di integrazione. Integrazione singola: progettare coppie di primer oligonucleotidici che si estendono attraverso i siti attR e / o attL . Un primer deve legarsi al costrutto di attracco precedentemente integrato e l’altro al transgene appena integrato (Figura 3A). RMCE: La sostituzione della cassetta può avvenire in due diversi orientamenti rispetto al cromosoma (designato A e B). Progettare combinazioni alternative di 4 primer oligonucleotidici per dare un prodotto discreto in uno solo degli orientamenti, con una coppia diagnostica per l’orientamento A e l’altra per l’orientamento B (Figura 3B, Figura 6). Estrarre il DNA genomico da individui G2 positivi ed eseguire la PCR diagnostica e l’elettroforesi su gel per visualizzare la presenza di ampliconi diagnostici attesi dalle mappe del sito di integrazione previste.NOTA: il DNA può essere estratto in alternativa dalle zampe di un singolo adulto46 o da casi di pupa (comunicazione personale di L. Grigoraki). Prodotti di sequence PCR per confermare le sequenze previste. Figura 2. Diagramma del flusso di lavoro per la modifica del genoma φC31 diretta al sito nelle zanzare Anopheles . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Basi molecolari di φC31-mediated single integration (A) e RMCE (B). A) Mappe schematiche dell’inserimento genomico in una linea di attracco An. stephensi (80.9, Tabella 1) portante un singolo sito attP e contrassegnato con CFP (in alto), un plasmide donatore a singolo attB marcato con DsRed (al centro) e il sito di inserimento atteso risultante dopo un’integrazione riuscita (in basso). B) Mappe schematiche dell’inserimento genomico in una linea di attracco An. gambiae (A11, Tabella 1) che trasporta due siti attP invertiti e contrassegnati con CFP (in alto), un plasmide donatore a doppio attB marcato con YFP (al centro) e il sito di inserimento atteso risultante dopo il successo RMCE (in basso). Linea ondulata: genoma della zanzara; Frecce a strisce: piggyBac braccia di trasposone; 3xP3: promotore del marcatore fluorescente; SV40: terminatore virale; Ori: origine della replicazione; AmpR: gene di resistenza all’ampicillina. Le linee di attraversamento rappresentano il sito o i siti di ricombinazione tra siti attP e attB. Le frecce nere numerate rappresentano i siti di legame del primer per la convalida molecolare del locus di inserzione (fase 5 del protocollo). I plasmidi con tag attB singoli e doppi completamente annotati sono disponibili presso gli autori su richiesta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Il protocollo qui illustrato consente di generare una linea transgenica stabile di Anopheles in ~ 10 settimane (assumendo un ciclo di vita della zanzara di 21 giorni). I tassi di schiusa larvale post-iniezione in An. gambiae dovrebbero essere generalmente inferiori a quelli di An. stephensi, tuttavia sono stati riportati tassi di schiusa tra il 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Data un’appropriata tecnica di iniezione, i tassi di schiusa di ≥20% sono generalmente sufficienti per produrre trasformanti. L’assorbimento del DNA da parte degli embrioni può essere valutato mediante lo screening delle giovani larve per l’espressione transitoria del marcatore fluorescente. In esperimenti RMCE di successo in An. gambiae utilizzando il promotore 3xP3 fino al 50% delle larve G0 sopravvissute ha mostrato espressione episomiale del marcatore nelle papille anali48. Le stime generalizzate dell’efficienza della trasformazione sono difficili da valutare tra i laboratori e anche tra gli esperimenti, poiché la trasformazione dipende da una complessa interazione di variabili tra cui purezza, concentrazione, dimensioni e potenziale tossicità del DNA iniettato, qualità delle uova, manipolazione pre e post-iniezione delle uova, allevamento di zanzare e, soprattutto, l’esperienza dell’operatore. Tassi di trasformazione fino al 7% sono stati ottenuti per RMCE in An. gambiae (calcolato come il numero di eventi di trasformazione indipendenti nel totale degli individui G0)9,26,33 e fino al 2,2% tasso di trasformazione per l’integrazione in An. stephensi. Suggeriamo di iniettare almeno 500 embrioni, che dovrebbero portare alla schiusa di almeno 100 larve G0 e a 2-7 G0 fondatori adulti da cui si può ottenere una progenie stabilmente trasformata. Se lo screening per l’espressione transitoria nelle larve G0, ci si può aspettare fino a 40 larve positive. Esempi di validazione fenotipica della trasformazione tramite lo screening di marcatori fluorescenti regolati dal promotore 3xP3 sono riportati in Figura 4 e  Nella Figura 5. La Figura 4 mostra una nuova linea An. stephensi ottenuta mediante l’inserimento di una cassetta marcata DsRed in una linea di attracco contrassegnata con CFP (80.9, Tabella 1), con conseguente progenie G1 che esprime entrambi i marcatori come indicato dalla fluorescenza rossa e blu rilevata negli occhi. I progetti RMCE dovrebbero invece comportare la sostituzione del marcatore originariamente inserito nella linea di attracco con quello del plasmide donatore. La Figura 5A e  la Figura B illustrano questo scambio di marcatori in una linea di aggancio An. gambiae contrassegnata con CFP (A11, Tabella 1) dove dopo il successo RMCE il marcatore CFP viene perso e il marcatore YFP viene acquisito con conseguente fluorescenza gialla (ma non blu) dell’occhio e del cordone nervoso33. Occasionalmente, RMCE può provocare un singolo evento di integrazione invece dello scambio della cassetta transgenica desiderata come illustrato nella Figura 5C, dove viene mostrata una larva contrassegnata sia con la CFP originale che con i nuovi marcatori YFP. È stato riferito che fino al 50% del numero totale di eventi di trasformazione sono singole integrazioni9,33. Quando si esegue lo screening per la presenza di un marcatore fluorescente è fondamentale distinguere il suo segnale da una possibile autofluorescenza di fondo. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza la CFP poiché le larve di Anopheles mostrano un’autofluorescenza blu naturale (Figura 6A). Aumentare l’ingrandimento e concentrarsi sui tessuti e gli organi in cui si prevede che la fluorescenza sia guidata dal promotore è necessario per identificare veri individui CFP-positivi come illustrato nella Figura 6B utilizzando il marcatore 3xP3-CFP. I singoli trasformanti vengono infine valutati molecolarmente tramite PCR per confermare il sito di inserimento atteso. La Figura 7 riporta la validazione pcr in individui da una linea di scambio An. gambiae che mostra i due potenziali orientamenti di inserimento nel genoma della zanzara33. Figura 4. Validazione della singola integrazione di φC31 in larve di An. stephensi (vista dorsale). A) La linea di attracco (80.9, Tabella 1) esprime CFP agli occhi sotto la regolazione del promotore 3xP3 . B) L’integrazione di successo si traduce nell’espressione del DsRed appena acquisito e del marcatore CFP originale negli occhi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5. Validazione di φC31 RMCE in larve di An. gambiae (vista ventrale). A) La linea di attracco (A10, Tabella 1) esprime la CFP sotto la regolazione del promotore 3xP3 negli occhi (e) e nel cordone nervoso (nc)5. B) Il successo di RMCE comporta lo scambio di marcatori fluorescenti da CFP a YFP33. C) Un singolo evento di integrazione si è verificato durante l’esperimento RMCE in cui la larva trasformante esprime sia i marcatori CFP che YFP. Questa larva trasporta componenti GAL4 / UAS che causano un ampio modello di espressione di YFP, particolarmente forte nei muscoli addominali (am). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6. Autofluorescenza CFP nelle larve di An. gambiae (vista dorsale). A) Immagine affiancata di una larva L4 positiva (CFP+) e negativa (CFP-) utilizzando il filtro CFP. B) Immagine ravvicinata degli occhi larvali che rivela un individuo CFP+ vs CFP-. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7. Validazione molecolare dell’orientamento dell’inserzione della cassetta in An. gambiae transgenico rappresentativo creato da φC31 RMCE. La cassetta transgenica può essere inserita in uno dei due orientamenti alternativi (A o B) rispetto al sito di inserimento. Ogni reazione PCR (I – IV) utilizza una combinazione di primer (5-8)33 progettati per fornire un frammento di amplificazione diagnostica per ciascun orientamento come indicato nelle mappe plasmidiche schematiche. T1: individuo transgenico rappresentativo che porta l’orientamento dell’inserzione A; T2: individuo transgenico rappresentativo che porta l’orientamento dell’inserzione B; WT: tipo selvatico; DL: linea di attracco; -: controllo negativo della reazione in cui l’acqua è stata utilizzata come modello. Questa cifra è stata modificata da Adolfi et al. (2019)33. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Specie Sforzo Nome attP(i) Cromo-alcuni Promotore-marcatore Istituzione di origine Riferimento An. stephensi Indiana · 26,10b Singolo 2R 3xP3-eCFP Università della California Irvine 25 An. stephensi Indiana · 44Cb Singolo X 3xP3-eCFP Università della California Irvine 23, 24 An. stephensi Indiana · 80,9b Singolo 2L 3xP3-eCFP Università della California Irvine Questo studio Gambiae G3 · 113 Singolo 2R 3xP3-eCFP Università della California Irvine Questo studio Gambiae KIL Ec Singolo 3R 3xP3-eCFP Keele Univ. 19, 43 Gambiae G3 · X1 · Singolo 2L Nessun marcatore Università di Strasburgo 22 Gambiae G3 · YAttP Singolo Y 3xP3-RFP Imperial College di Londra 21 Gambiae G3 · A10b Doppio 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 5 Gambiae G3 · A11b Doppio 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 9 un. Ceppo della Johns Hopkins University (dono di M. Jacobs-Lorena) e nella cultura presso l’Università della California Irvine per >20 anni. b. Queste righe sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta. c. Questa linea è disponibile presso il repertorio BEI www.beiresources.org come MRA-1163. Tabella 1. Linee di attracco Anopheles attP .

Discussion

La progettazione accurata di plasmidi marcati con attB che sono compatibili con la linea di attracco scelta è fondamentale per il successo dell’esperimento. Un’attenta considerazione deve essere data alla scelta del marcatore utilizzato per lo screening dei trasformanti, compreso il colore di fluorescenza e il suo modello di espressione, che sarà soggetto al modello già presente nella linea di attracco. È necessario utilizzare marcatori fluorescenti facilmente distinguibili: le buone combinazioni di marcatori includono RFP (rosso) / CFP (ciano), RFP (rosso) / GFP (verde), RFP (rosso) / YFP (giallo) e YFP (giallo) / CFP (ciano), mentre le combinazioni da evitare sono YFP (giallo) / GFP (verde) e CFP (ciano) / GFP (verde). Il promoter 3xP339, specifico per gli occhi e il cordone nervoso, è il più frequentemente utilizzato per guidare l’espressione di marcatori fluorescenti per la transgenesi delle zanzare. In effetti, tutte le linee di attracco Anopheles attualmente disponibili utilizzano questo promotore. Regioni regolatorie alternative sono quella del gene An. gambiae polyubiquitin (PUBc)5 o del promotore virale IE120, che guidano l’espressione in più tessuti. Se usati insieme a 3xP3, questi promotori espanderebbero le possibili combinazioni di colori e persino l’uso dello stesso fluoroforo. I promotori indicati sono attivi durante tutto il ciclo di vita della zanzara consentendo lo screening e il monitoraggio della fluorescenza in tutte le fasi della vita. Un’ulteriore considerazione durante la progettazione del plasmide è la dimensione del carico da integrare o scambiare. Mentre il sistema φC31 ha notevoli capacità di carico18, va considerato che la dimensione del plasmide donatore è generalmente correlata negativamente con l’efficienza di trasformazione22.

Nel protocollo descritto la fonte di integrasi è un plasmide helper che esprime l’enzima ubiquitariamente40. La presenza ubiquitaria dell’integrasi può portare alla trasformazione delle cellule somatiche se le microiniezioni non sono dirette con precisione verso l’area in cui si forma la linea germinale. Mentre tali eventi di trasformazione andranno persi in quanto non sono ereditabili, gli effetti somatici possono ridurre la forma fisica degli individui iniettati. Per evitare questo e aumentare l’efficienza di trasformazione, l’espressione dell’integrasi può essere limitata alla linea germinale, ad esempio utilizzando il promotore vasa22,26. Altri protocolli descrivono l’uso dell’RNA messaggero trascritto in vitro (mRNA) come fonte di φC31 integrasi19,24,43. Tuttavia, ciò comporta la laboriosa preparazione dell’mRNA e richiede un’attenta gestione della miscela di iniezione e l’uso di reagenti privi di RNasi per evitare la degradazione. Le fonti di integrasi plasmidica hanno dimostrato sia in An. gambiae9,21,22,26,33,37 che in An. stephensi (A.A. personal communication) di essere affidabili e portare a una trasformazione efficiente, e sono quindi la nostra opzione preferita. Un’ulteriore opzione per la consegna integrasi è la sua produzione in vivo in linee di supporto auto-docking. Tali linee sono state create in An. gambiae che esprimono l’integrasi φC31 sotto la regolazione del promotore nanos specifico della linea germinale e sono state trovate per portare a una migliore efficienza di sopravvivenza e trasformazione20. Tuttavia, devono essere considerati i potenziali carichi di fitness imposti dalla produzione in vivo dell’enzima integrasi sulla linea helper.

Come per altre tecniche transgeniche, particolare attenzione deve essere riservata all’allevamento e all’incrocio di individui derivanti da embrioni iniettati per massimizzare le possibilità di recupero dei trasformanti. Gli individui che hanno ereditato stabilmente il transgene possono essere prima recuperati alla progenie G1. Tuttavia, i primi segni di potenziale trasformazione possono essere valutati dalla presenza di espressione episomiale transitoria del marcatore fluorescente nelle papille anali e/o nel cordone nervoso delle larve G0 prima e seconda instar quando si utilizza il promotore 3xP343. Mentre la presenza di fluorescenza transitoria suggerisce una consegna positiva del plasmide, non garantisce la trasformazione ereditaria della linea germinale. Allo stesso modo, la mancanza di espressione transitoria non esclude una trasformazione di successo. Tuttavia, è stato osservato che gli individui transitoriamente positivi hanno maggiori probabilità di produrre progenie transgenica rispetto a quelli transitoriamente negativi43,48. In mani esperte, l’allevamento e l’incrocio di individui solo positivi può essere un’opzione per ridurre il numero di zanzare. Tuttavia, data l’importanza e la fragilità delle piccole larve G0, la minima quantità di manipolazione è ancora consigliabile e l’allevamento di tutti gli individui G0 è sempre raccomandato.

Lo schema di accoppiamento riportato in questo protocollo è progettato per massimizzare la possibilità di accoppiamento e per isolare eventi di trasformazione indipendenti. Tuttavia, se lo spazio insetticida o la disponibilità di personale è un problema, gli adulti G0 possono essere raggruppati per sesso in gabbie singole se vengono forniti abbastanza individui di sesso opposto. Tale configurazione non consentirà la discriminazione tra più eventi di trasformazione che si verificano in individui della stessa gabbia. A seconda della configurazione sperimentale, durante il processo di screening è prevista la presenza di un marcatore doppio (integrazione singola) o singolo (RMCE). Nei singoli esperimenti di integrazione è importante verificare la presenza del marcatore originale dalla linea di attracco, mentre in RMCE è importante verificare la perdita del marcatore precedentemente integrato. In effetti, non è raro nei progetti RMCE recuperare trasformanti in cui si è verificata una singola integrazione anziché uno scambio a causa della ricombinazione di un singolo sito attP9,33. In tali individui sono presenti sia marcatori fluorescenti che l’intera spina dorsale plasmidica del donatore evidenziando l’importanza di condurre uno screening approfondito per entrambi i marcatori fluorescenti.

Mentre la presenza di modelli di fluorescenza attesi indica una trasformazione di successo, deve essere intrapresa la caratterizzazione molecolare del sito di inserimento. Per fare ciò, la preparazione di mappe accurate del locus di inserzione previsto, comprese le regioni genomiche fiancheggianti della linea di attracco, è fondamentale per la progettazione di adeguati primer diagnostici di oligonucleotidi per le analisi di amplificazione genica. Singoli eventi di integrazione provocano la formazione di siti ibridi attR e attL alla giunzione tra il DNA appena integrato e la cassetta precedentemente inserita. Questi siti possono essere destinati alla convalida del sito di inserimento. Nei progetti RMCE, l’inserimento della cassetta del donatore può avvenire in due orientamenti alternativi rispetto al locus genomico, quindi quattro primer possono essere utilizzati in combinazioni PCR alternative per rilevare quale orientamento porta la linea. Poiché l’orientamento dell’inserimento della cassetta può influenzare l’espressione transgenica, nell’analisi comparativa dell’espressione genica è importante utilizzare linee che portano lo stesso orientamento di inserimento.

Quando si lavora con un basso numero di trasformanti potrebbe non essere desiderabile sacrificare interi individui per l’analisi molecolare. Un’opzione per questo è condurre analisi molecolari sul DNA estratto dalle gambe di un singolo adulto46 poiché la perdita delle gambe non influisce sulla capacità di una femmina adulta di accoppiarsi e oviposit49. Tuttavia, esiste il rischio di danneggiare l’individuo nel processo di rimozione delle gambe. Il successo è stato ottenuto utilizzando casi di pupa scartati (comunicazione personale di L. Grigoraki), tuttavia l’approccio più sicuro è quello di eseguire analisi molecolari su genitori G2 dopo aver ottenuto una progenie G3 vitale.

Negli ultimi anni, CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato il modo di eseguire l’editing del genoma site-specific26,41,50,51. A differenza dell’RMCE diretto al sito, le integrazioni geniche mediate da CRISPR/Cas9 (knock-in) sono indipendenti dalla presenza di siti di ricombinazione pre-inseriti con un solo evento di trasformazione in un solo passaggio. Tuttavia, il sistema CRISPR/Cas9 si basa sulla presenza di grandi sequenze genomiche note che fiancheggiano il sito di inserimento desiderato per una riparazione diretta all’omologia di successo, nonché sull’efficiente riconoscimento del sito mediato da RNA guida. Queste condizioni non possono sempre essere soddisfatte o possono essere laboriose da risolvere e, data la disponibilità di più linee di attracco in An. gambiae e An. stephensi e linee da esse derivate, il sistema φC31 rimane uno strumento molto prezioso per eseguire confronti fenotipici diretti tra transgeni nelle stesse posizioni genomiche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Kiona Parker (UCI) per aver fornito immagini di larve transgeniche di An. stephensi e a Fraser Colman (LSTM) e Beth Poulton (LSTM) per aver fornito larve transgeniche di An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) ha anche fornito una preziosa assistenza durante l’imaging delle larve di An. gambiae . Questo lavoro è stato finanziato dal Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) e dal Director Catalyst Fund di LSTM assegnato ad A.A. (DCF2014AA). A.A.J. è un Donald Bren Professor presso l’Università della California, Irvine.

Materials

1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0
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Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-Directed φC31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria. J. Vis. Exp. (168), e62146, doi:10.3791/62146 (2021).
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