JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

Published: February 02, 2021
doi:
10.3791/62146
, , ,
1Vector Biology Department,Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics,University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry,University of California

Summary

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

Abstract

ניתוח גנומי פונקציונלי ואסטרטגיות נלוות לשליטה גנטית במלריה מסתמכים על שיטות מאומתות וניתנות לשחזור כדי לשנות במדויק את הגנום של יתושי אנופלס. בין שיטות אלה, מערכת φC31 מאפשרת שילוב מדויק ויציב של טרנסג’נים, או החלפת קלטות מהונדסות משולבות באמצעות חילופי קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE). שיטה זו מסתמכת על הפעולה של Streptomyces φC31 בקטריופג integrase כדי לזרז recombination בין שני אתרי התקשרות ספציפיים המיועדים attP (נגזר phage) ו– attB (נגזר החיידק המארח). המערכת משתמשת באתר attP אחד או שניים ששולבו בעבר בגנום היתושים ואתרי attB בדנ”א של תבנית התורם. כאן אנו ממחישים כיצד לשנות ביציבות את הגנום של קווי עגינה אנופלס נושאי attP באמצעות שני פלסמידים: תורם מתויג attB הנושא את תבנית האינטגרציה או ההחלפה ופלטסמיד עוזר המקודד את ה- φC31 integrase. אנו מדווחים על שתי תוצאות מייצגות של שינוי φC31 בתיווך האתר: שילוב יחיד של קלטת מהונדסת ב An. stephensi ו RMCE יתושים An. gambiae. מניפולציית הגנום בתיווך φC31 מציעה את היתרון של ביטוי טרנסג’ן לשחזור מאתרים גנומיים ניטרליים מאומתים, ומאפשרת ניתוחים איכותיים וכמותיים השוואתיים של פנוטיפים. האופי המכוון לאתר של האינטגרציה גם מפשט באופן משמעותי את האימות של אתר הכניסה היחיד ואת ערכת ההזדווגות כדי לקבל קו מהונדס יציב. מאפיינים אלה ואחרים הופכים את מערכת φC31 למרכיב חיוני בערכת הכלים הגנטית למניפולציה מהונדסת של יתושי מלריה וקטורים אחרים של חרקים.

Introduction

היכולת לשנות את הגנום של וקטורים יתושים של מחלות באופן אמין ורבייה חיזקה את האימות התפקודי של vivo של גנים ופתחה את הדלתות לאסטרטגיות בקרה וקטוריות גנטיות הניתנות למימוש, כגון אלה המתמקדות יתושי אנופלס המעבירים מלריה1.

עריכת גנום יתושים מוקדמת הסתמכה אך ורק על טרנספורמציה בתיווך אלמנטים הניתנים להחלפה (TE), כאשר piggyBac היה הטרנספוזון הנפוץ ביותר באנופלס2,3,4. עם זאת, האופי האקראי של שילוב TE יכול להוביל לשינויים בלתי רצויים כגון נוקאאוטים גנטיים (מוטגנזה של הכנסה) והשפעות מיקום משמעותיות על ביטוי טרנסג’ן5,6,7,8. כניסות מרובות הן גם תופעה שכיחה בעת שימוש piggyBac5,9, מה שהופך את האימות ואת הבידוד של קווים מהונדסים עם הוספות בודדות מייגע. חסרונות אחרים כוללים את הגיוס הפוטנציאלי שלהם, כפי שנצפה בנבט של אנופלס סטיבנסי בעת מתן מקור של piggyBac transposase10,11,12, ואת הגודל המוגבל שלהם של מטען DNA (10-15 kb אורך) עם יעילות טרנספורמציה יורדת עם הגדלת גודלו של פלסמיד התורם13,14.

גישות אינטגרציה מכוונות אתר הוצגו כדי לעקוף בעיות אלה. שינוי הגנום הנפוץ ביותר בהכוונת האתר יתושים הוא זה בתיווך מערכת φC31 (איור 1a). זה מונע על ידי אינטגרז ויראלי שמזרז את הרקומבינציה בין שני אתרי התקשרות הטרוספיפית (att) המתרחשים באופן טבעי בגנום של הבקטריופאג ‘ φC31 (attP) ובפונדקאי החיידק סטרפטומיצ’ס (attB)15. שילוב מחדש של שני האתרים הוא חד כיווני וכתוצאה מכך היווצרות של אתרים היברידיים (attL ו– attR). שילוב מחדש של אתרים היברידיים כאלה (המוביל לכריתת DNA) ידרוש לא רק נוכחות של אינטגראס ויראלי פעיל, אלא גם גורם רקומבינציה מקודד פאג ‘אחר 16,17. כך נוצר אתר אינטגרציה יציב שמקל על נושא הגיוס מחדש הפוטנציאלי לא רצוי15. יתר על כן, המערכת מאפשרת שילוב של מטענים גדולים (למשל, שילוב של מבנים >100 kb דווח ב D. melanogaster18), להגדיל באופן משמעותי את יכולות הנשיאה. האינטגרציה מתרחשת בלוקוס גנומי מוגדר מראש יחיד אשר מפשט מאוד את אימות הכניסה ואת ערכת ההזדווגות כדי להשיג קו מהונדס יציב. לבסוף, האופי המכוון לאתר של השילוב מאפשר נורמליזציה של הביטוי כמו טרנסג’נים חלופיים ממוקמים באותו לוקוס ולכן מוסדר בתוך אותו הקשר גנומי שכן. ואכן, אחד היישומים העיקריים של הטכניקה הוא השוואה ישירה של פנוטיפים המוענקים על ידי טרנסגנים שונים לאחר החדרה לתוך לוקוס זהה.

השגת אינטגרציה בתיווך φC31 כרוכה בשני שלבים: שלב I הוא יצירת קווי עגינה מהונדסים הנושאים אתרי attP( ים), ושלב II הוא שילוב מכוון אתר של מטען אגף attB בגנום של קו העגינה19. יצירת קווי עגינה שלב I הסתמכה על השילוב האקראי בתיווך TE של מבנים מתויגים על-ידי ATTP ולכן כללה תהליך מייגע ראשוני (כולל כתמים דרומיים וניתוחי PCR הפוכים בצאצאים חד-נשיים) כדי לבודד ולאמת קווים מהונדסים הנושאים אירוע אינטגרציה יחיד במיקומים גנומיים ייחודיים, פעילים בתמלול וכושר נייטרלי. עם זאת, מספר קווי עגינה לאינטגרציה יחידה בתיווך φC31 פותחו ואומתו ב– An. gambiae19,20,21,22 וב– An. stephensi23,24,25 (טבלה 1). כל אחד מהקווים האלה משתנה מבחינת המיקום הגנומי של אתר העגינה והרקע הגנטי הספציפי לזן וממנו ניתן ליצור מגוון גדול של קווים מהונדסים חדשים. כעת ניתן לעקוף את האימות המורכב של אינטגרציות בתיווך TE להפקת קווי עגינה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas926; עם זאת, זה מסתמך על ידע מראש של loci נייטרלי להיות ממוקד ורצפים הסובבים אותם.

φC31-בתיווך אינטגרציה הוחלה בהרחבה על עריכת גנום חרקים מן האורגניזם המודל D. melanogaster27, כדי יתושים Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19, ו An. stephensi24, כמו גם חרקים אחרים כולל Ceratitis capitata30 ו Bombyx mori31.

מגבלה של אינטגרציה בתיווך φC31, במיוחד לאור שחרורי שדה פוטנציאליים לבקרה וקטורית, היא שילוב בגנום היתושים של כל הפלסמיד התורם נושא ה- ATTB, כולל רצפים לא רצויים כגון סמני גנים עמידים לאנטיביוטיקה ורכיבי עמוד שדרה פלסמיד ממקור חיידקי. כדי לטפל בכך, יושם שינוי של המערכת הסטנדרטית, חילופי קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE), המאפשר החלפה מדויקת של קלטת מהונדסת ששולבה בעבר בדנ”א תורם חדש (איור 1b). זה מושג על ידי שימוש בשני אתרי att הפוכים מאגפים את קלטות התורם והנמען בכל קצה, מה שמניע שני אירועי רקומבינציה עצמאיים להתקיים בו זמנית וכתוצאה מכך חילופי קלטות ללא שילוב של עמוד השדרה הפלסמיד. עיצוב משופר זה עוקף את השילוב של רצפים לא רצויים ומרחיב את היישום של מערכות φC31 לכלול למשל שילוב של מטעני DNA לא מסומנים על ידי הקרנה לאובדן סמן פלואורסצנטי משולב בעבר32.

RMCE הושגה תחילה עם D. melanogaster32 ומאוחר יותר הוחלה בהצלחה על חרקים שאינם מודל כולל An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34, ו– B. mori35. מספר קווי עגינה עבור RMCE פותחו ואומתו ב– An. gambiae5,9,26 (טבלה 1). למיטב ידיעתנו, RMCE עדיין לא נחקרה במינים אחרים של וקטורים של אנופלס.

עד כה, מערכת φC31 שימשה באופן נרחב יתושים אנופלס כדי להציג וללמוד מגוון רחב של מולקולות כולל מפעילי antimalaria19,24,36, רכיבים של מערכת GAL4 / UAS כדי overexpress ו להפיל גנים למחקרי עמידות לחומרי הדברה9,33, אלמנטים רגולטוריים, גנים עיתונאיים 5,21,37, ואלמנטים כונן גנים26 38.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע 1) שילוב מכוון אתר של מטען אגף attB ו 2) RMCE של מבנה מוקף על ידי אתרי attB הפוכים לתוך הגנום של קווי עגינה אנופלס . זה מושג באמצעות שני plasmids: פלסמיד מתויג attB תורם הנושא את הטרנסג’ן של עניין, ו plasmid עוזר המבטא את φC31 integrase. וקטורים המלריה העיקריים An. gambiae ו An. stephensi משמשים כדוגמאות ספציפיות, אולם פרוטוקולים אלה חלים על מינים אחרים של אנופלס .

Figure 1
איור 1. שינויי גנום מכווני אתר, אינטגרציה יחידה והחלפת קלטות בתיווך רקומבינאז (RMCE) , באמצעות מערכת φC31. ה- φC31 integrase (INT, חץ כפול אפור) מזרז את השילוב בין אתרי attB (פסים סגולים) הנמצאים בפלסמיד תורם לבין אתרי ה- ATTP (פסים כחולים) הנמצאים בקו עגינה מקבל, מה שמביא להיווצרות אתרים היברידיים attL ו– attR. A) אינטגרציה מושגת כאשר אתרי attB ו– attP בודדים מתאחדים מחדש ומביאים לנוכחות של שני סמנים משולבים (כחול ואדום). ב) RMCE מתרחשת כאשר שני אתרי attB / P מתאחדים בו זמנית וכתוצאה מכך החלפת הקלטת בין אתרי ה– att של קו העגינה (סמן כחול) עם זה שנושא פלסמיד התורם (סמן אדום). ג) רצפי נוקלאוטידים חלקיים של attP (כחול) ו– attB (סגול) ואתרים היברידיים attL / R. רקומבינציה מתרחשת בין רצפי הליבה ‘TT’ המסומנים בשחור מודגש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הערה: באיור 2 מוצגת זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול המאויר. 1. עיצוב פלסמידים מתויגים ב-φC31 attB (איור 3) צור פלסמידים תורמי ATTB הנושאים את הרכיבים החיוניים הבאים סמן פלואורסצנטי דומיננטי בחר מקדם כדי להניע את הביטוי של סמן הפלואורסצנטי.הערה: עבור אנופלס טרנסגנזה, סמנים פלואורסצנטיים נמצאים בדרך כלל תחת הרגולציה של מקדם 3xP33, אשר מניע את הביטוי בעיניים ובחבל העצבים. לחלופין, מקדם PUBc5 ניתן להשתמש כאשר הביטוי ברקמות מרובות רצוי. פלסמידים של תורמים וקווי עגינה המשמשים כדוגמאות בפרוטוקול זה מסומנים באמצעות מקדם 3xP3. בחר חלבון פלואורסצנטי (FP) התואם לזה של קו העגינה המקבל כך שניתן להבחין בו בקלות.הערה: אל תשתמש באותו סמן שכבר קיים בקו העגינה והימנע משימוש סימולטני ב- GFP (ירוק)/YFP (צהוב) ו- GFP (ירוק)/CFP (ציאן) מכיוון שקשה מאוד להבדיל ביניהם באופן אמין. פלסמידים תורמים המשמשים כדוגמאות בפרוטוקול זה מסומנים ב- DsRed או ב- YFP מכיוון שהם אמורים להיות משולבים בקו עגינה המסומן ב- CFP. אתרי רקומבינציה של attB השתמשו באתר attB יחיד לשילוב של קלטת מהונדסת (עיצוב attB יחיד) (איור 3A). השתמש בשני אתרי ATTB הפוכים עבור RMCE (עיצוב attB כפול) שבהם האתרים שוכבים הפוכים זה לזה ומקיפים את תבנית ה- DNA של התורם (איור 3B).הערה: הכיוון של אתרי attB חייב להיות תואם לזה של אתרי attP הקיימים בשורת העגינה. המטען הטרנסג’נדרי הרצוי השתמש בכל התכונות הרצויות האחרות שישולבו בגנום היתושים בהתבסס על המטרה הספציפית של הניסוי. כאן, אנו מתארים את השילוב של מולקולת מפעיל נגד מלריה בגנום של An. stephensi ואת השילוב של הרכיבים של מערכת GAL4 / UAS לתוך יתושים An. gambiae . רכיבי עמוד שדרה של פלסמיד כלול, בין מרכיבים חיוניים אחרים לשכפול פלסמיד בחיידקים, סמן לבחירת פלסמיד במבחנה (כלומר, גן עמידות לאנטיביוטיקה).הערה: עמוד השדרה הפלסמיד ישולב בגנום היתושים בעיצוב ה-ATTB הבודד לאינטגרציה (איור 3A), בעוד שהוא לא יוכנס לעיצוב ה-ATTB הכפול עבור RMCE (איור 3B). 2. הכנת פלסמידים לתערובת המיקרו-נגיף הערה: הפרוטוקול המומחץ כאן כרוך בשימוש בשני פלסמידים: פלסמיד תורם מתויג attB הנושא את הטרנסג’פן של עניין, ו plasmid עוזר המבטא את φC31 integrase תחת הרגולציה של מקדם Hsp70 Drosophila Hsp7040. טהרו פלסמידים תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין.הערה: רצף את ההכנה הפלסמיד הסופית המשמשת להזרקה כדי לאמת את שלמות כל הרכיבים. שלב כמויות מתאימות של שני plasmids כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ng/ μL של פלסמיד התורם ו 150 ng/ μL של פלסמיד עוזר כאשר resuspended במאגר הזרקה.הערה: בעת חישוב הנפח הדרוש של תערובת, לשקול כי 10-15 μL מספיקים עבור כל יום של זריקות מתוכננות DNA ניתן להכין מראש ולאחסן ב -20 °C (60 °F). ריכוזי פלסמיד עוזר Integrase של 60-500 ng/μL וריכוזי פלסמיד תורם של 85-200 ng/μL דווחו גם21,22,26,41. לזרז את ה- DNA על ידי הוספת 0.1 כרכים של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 כרכים של קר כקרח 100% EtOH ומערבולת. משקעים לבנים צריכים להיות גלויים מיד. לאחר תכשירי פלסמיד ראשוניים מרוכזים מאוד (כלומר, ~ 1 מיקרוגרם / μL) משפר את יעילות המשקעים.הערה: נקודת עצירה – ניתן לאחסן את המשקעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 15,000 גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, להשליך את הסופר-נרטיב ולשטוף את הכדור עם מ”ל אחד של 70% EtOH קרים כקרח. לשטוף את הכדור עם 1 מ”ל של קר כקרח 70% EtOH וצנטריפוגה ב 15,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה ואוויר יבש. Resuspend את הכדור במאגר הזרקה 1x (0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ng / μL.הערה: נניח כי כמה DNA יאבד במהלך תהליך המשקעים; לכן, להוסיף נפח קטן יותר של מאגר הזרקה הראשון, לבדוק את הריכוז על spectrophotometer (למשל, Nanodrop), ולאחר מכן להוסיף נפח מתאים שנותר כדי להגיע 500 ng / μL. ודא כי ה- DNA הוא resuspended ביסודיות, להכין aliquots של 10-15 μL כל אחד ולאחסן אותם ב -20 °C (60 °F). ביום ההזרקה, להפשיר aliquot אחד צנטריפוגה ב 15,000 x g במשך 5 דקות כדי להסיר כל שאריות חלקיקים.הערה: שיטה חלופית להסרת חלקיקים היא לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הימנע נוכחות של שאריות חלקיקים בתערובת ההזרקה כפי שהם מובילים לחסימת מחט במהלך microinjection העובר. 3. מיקרו-חדירה של עוברים מקו עגינה של אנופלס דם להאכיל יתושים בני 4-7 ימים מקו העגינה הרצוי 72 שעות לפני microinjection (כלומר, להזרקה בימים שני ושלישי להאכיל נקבות ביום שישי הקודם; להזרקה בימים חמישי ושישי להאכיל נקבות ביום שני של אותו שבוע). יתושים מסוג בר (WT) להאכיל דם (כלומר, יתושים עם אותו רקע גנומי של קו העגינה) באותו יום; אלה יהיו נחוצים עבור outcrossing.הערה: הגודל והאיכות של ארוחת הדם משפיעים על איכות הביצה, ולכן מומלץ תמיד להשתמש בדם טרי (כלומר, דם שנלקח במהלך 7 הימים הקודמים). האכלת זרוע או האכלה בעכברים עשויה להגביר את איכות וכמות הביצים, אולם שיטות אלה אינן מעודדות. פרוטוקולים מאושרים ספציפיים יהיו נחוצים לשימוש בבני אדם ובבעלי חיים. ביצוע מיקרו-גירויים עובריים בצע An. gambiae עובר microinjections ב 25 mM NaCl42 על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות. לקבלת פרוטוקול מפורט עבור איסוף עוברים, יישור, ו microinjection להתייחס פונדוויל et al.43 ו Lobo et al.44. בצע An. stephensi עובר microinjections בשמן Halocarbon 700:27 (2:1) על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 30 מעלות. פרוטוקול מפורט לאיסוף עוברים, יישור ומיקרו-הנדסה ניתן למצוא בטרניוס ואח ‘ 45 ובלובו ואח ‘ 44. מעבירים ביצים מיד לאחר ההזרקה לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים (pH 7.2) ומחזירים אותן לתנאי חרקים. עם הבקיעה, מעבירים זחלי G0 למגש עם מים מזוקקים מלוחים (0.1% מלח טוניק) מדי יום ומאחור לגלמים. קצב בקיעה שיא (כלומר, מספר הזחלים בקעו / מספר העוברים המוזרקים).הערה: תנועת העובר מסייעת לבקוע, ולכן רצוי ערבוב עדין. הבקיעה צריכה להתחיל ~ 48 שעות לאחר ההזרקה. מאז הזרקה עלולה לגרום לעיכוב התפתחותי קל מומלץ לשמור על ניטור עבור זחלים מאוחרים בוקע במשך 3-4 ימים. 4. חצייה וסינון של אנשים שהשתנו [שלב אופציונלי] מסך G0 (מוזרק) 1 או 2 זחלי instar (L1-L2) עבור ביטוי חולף של הסמן פלואורסצנטי. השתמשו בפיפטה מזכוכית עדינה כדי להעביר זחלי G0 L1-L2 למגלשות מיקרוסקופ עם בארות. מניחים זחל אחד בכל באר. השתמש סטריאוסקופ פלואורסצנטיות עם המסנן המתאים כדי לסנן לנוכחות של ביטוי חולף של הסמן הפלואורסצנטי.הערה: תבנית הביטוי החולף מוכתבת על-ידי המקדם שבו נעשה שימוש. בעת שימוש במקדם 3xP3 , ניתן לראות ביטוי ארעי של הסמן הפלואורסצנטי בפפילות האנאליות (ראו איור 6 בפונדוויל ואח’ 43) G0 אחורי אנשים חיוביים בנפרד. מיין G0 גולם על ידי סקס תחת סטריאוסקופ52. תן לזכרים לצאת בכלובים נפרדים בקבוצות של 3-5 (משפחות מייסדים) ולהוסיף עודף של פי 10 של נקבות WT תואמות גיל.הערה: מכיוון שהזכרים מזדווגים מספר פעמים, חשוב לספק עודף של נקבות WT כדי למקסם את סיכויי ההזדווגות של כל זכר. תן לנקבות לצאת בכלובים נפרדים בקבוצות של 10-15 (משפחות מייסדים) ולהוסיף מספר שווה של זכרי WT תואמי גיל.הערה: אם יש מקום מוגבל בחומר החרקים, הנקבות יכולות לצאת כולן יחד בכלוב אחד. היחס בין נקבה לזכר יכול להיות נמוך כמו זכר אחד עד 3 נקבות. אפשר למבוגרים להזדווג במשך 4-5 ימים ולספק לנשים ארוחת דם.הערה: הזנת דם ואיסוף ביצים מנקבות G0 מספר פעמים כדי למקסם את הסיכויים לקבל טרנספורמטים ממחזורים גונוטרופיים מרובים. אנשי WT להאכיל דם בעת ובעונה אחת עבור outcrossing. לאסוף ביצים ואחורי המתעוררים הדור הבא G1s. מסך G1 L3-L4 זחלים עבור פלואורסצנטיות מתאימה כדי לזהות שנאים. לאסוף זחלים בצלחת פטרי מרופדת בנייר סינון או על שקופית מיקרוסקופ ומסך באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים לנוכחות הסמן שהוצג עם המטען המתויג ATTB.הערה: פלואורסצנטיות המונעת על ידי מקדם 3xP3 גלויה בכל השלבים הפוסט-מבריוניים וההקרנה עשויה להתבצע על זחלים צעירים יותר, אולם אלה שבירים יותר ויש לטפל בהם בזהירות יחסית. ניתן גם להקרין את הגולם. עבור עיצובי attB יחידים עבור מסך אינטגרציה לנוכחות הסמן החדש והקיים מראש; שניהם צריכים להיות נוכחים מאחר שהקלטת החדשה מוכנסת לצד הקלטת המקורית (איור 3A, איור 4). הערה: חריגת סינון עבור עיצובי attB יחידים: בעת שימוש בשורות עגינה ללא סמן22, מסך לנוכחות הסמן החדש בלבד. בעת שימוש בקווי עגינה שבהם השילוב גורם לאי-השבתה של הסמן הקיים 21, מסך לנוכחות הסמן החדש ואובדן הסמן הקיים. עבור עיצובי attB כפולים עבור RMCE, מסך לנוכחות הסמן החדש ואובדן הסמן הקיים מראש, רק הסמן החדש שהוצג צריך להיות נוכח מכיוון שהקלטת החדשה מחליפה את הקלטת המקורית (איור 3B, איור 5).הערה: אירועי אינטגרציה מזדמנים ניתן לשחזר בניסויי RMCE שבו רק attP אחד recombined ולכן שני הסמנים יהיו נוכחים. ההקרנה של אנשים G1 יכולה להתבצע גם בשלב הגולם בעקבות אותו הליך52. טרנספר הפך G1 אנשים לתוך מגש זחל ומאחורי לגולם. יש להשליך אנשים ויחידים שאינם פלואורסצנטיים עם תבנית ביטוי סמן בלתי צפויה. מיין את גולם G1 השתנה על ידי מין ולהצליב אותם בהמוניהם עם אנשים WT בגיל הנגדי תואם גיל. אפשר למבוגרים להזדווג במשך 4-5 ימים, לספק ארוחת דם, לאסוף את הביצים, ולגדל את הדור הבא של צאצאי G2 . לניסויי אינטגרציה בודדים, אסוף ביצים ישירות מהצלב ההמוני מכיוון שאתר האינטגרציה זהה לכל האנשים. לניסויי RMCE, אספו ביצים מנקבות בודדות ושמרו על צאצאים נפרדים עד להשלמת ההערכה המולקולרית בשל נוכחות אפשרית של שני כיווני קלטות חלופיים (איור 3B). מסננים את צאצאי G2 (בשלב הזחל או הגולם) לנוכחות הסמן הפלואורסצנטי (50% מהאנשים צפויים להיות חיוביים), להשליך צאצאים שאינם פלואורסצנטיים. מניחים בצד תת קבוצה של אנשים חיוביים G2 לניתוח מולקולרי, להעלות את השאר לבגרות.הערה: אם כל חולי G2 חייבים להישמר בחיים, ניתוח מולקולרי יכול להתבצע על הרגליים של מבוגר יחיד46 או עקירות DNA במקרה pupal (תקשורת אישית L. Grigoraki). לחלופין, ניתוח מולקולרי יכול להתבצע לאחר כל G2 אנשים יש oviposited וביצים בקעו. אפשר לזכרים ולנקבות בוגרים להתערב באותו כלוב כדי לבסס את הקו הטרנסגני החדש.הערה: עבור ניסויי RMCE, intercrosss למבוגרים חייב להתרחש בין אחים הנובעים מנקבה אחת עד אוריינטציה של הכנסה נקבעת באמצעות ניתוח מולקולרי. 5. אימות מולקולרי של אתר ההחדרה על ידי הגברת DNA (PCR) הכן מפה של אתר הכניסה החזוי בגנום של קו העגינה לאחר ההמרה. אינטגרציה יחידה: ודאו שאתר ההחדרה החזוי נושא את מבנה העגינה המקורי בתוספת כל הרצף של הפלסמיד התורם בין שני האתרים ההיברידיים attL ו – attR (איור 3A). RMCE: ודא שאתר ההוספה החזוי זהה לזה של קו העגינה שבו אתרי ATTL היברידיים הפוכים מחליפים את אתרי ה- ATTP ההופכים המקוריים ותבנית ההחלפה מחליפה את הקלטת הקיימת במקור ביניהם (איור 3B). עצב פריימרים של אוליגונוקלאוטיד כדי להגביר את צומת הכניסה משני צדי מוקד האינטגרציה. אינטגרציה יחידה: עצב זוגות פריימרים של אוליגונוקלאוטיד המשתרעים על פני אתרי attR ו/או attL . פריימר אחד חייב להיקשר למבנה העגינה ששולב בעבר והשני לטרנסג’ן המשולב החדש (איור 3A). RMCE: החלפת מגירה יכולה להתרחש בשני כיוונים שונים ביחס לכרומוזום (המכונה A ו- B). עצבו שילובים חלופיים של 4 פריימרים של אוליגונוקלאוטיד כדי להעניק מוצר נפרד באחת מהכיוונים בלבד, כאשר זוג אחד הוא אבחון לכיוון A, והשני לכיוון B (איור 3B, איור 6). לחלץ DNA גנומי מאנשים חיוביים G2 ולבצע את PCR אבחון אלקטרופורזה ג’ל כדי לדמיין את נוכחותם של אמפליונים אבחון צפויים ממפות אתר האינטגרציה החזוי.הערה: ניתן לחילופין לחלץ דנ”א מרגליו של מבוגר יחיד46 או מנרתיקי גומה (ל. גריגוראקי תקשורת אישית). רצף מוצרי PCR כדי לאשר רצפים צפויים. איור 2. דיאגרמת זרימת עבודה לשינוי הגנום φC31 מכוון לאתר יתושים אנופלס . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3. בסיס מולקולרי של אינטגרציה יחידה בתיווך φC31 (A) ו- RMCE (B). A) מפות סכמטיות של ההוספה הגנומית בקו עגינה An. stephensi (80.9, טבלה 1) הנושא אתר attP יחיד מסומן עם CFP (למעלה), פלסמיד תורם עיצוב attB יחיד מסומן עם DsRed (באמצע), ואתר ההכנסה הצפוי וכתוצאה מכך לאחר שילוב מוצלח (למטה). ב) מפות סכמטיות של ההוספה הגנומית בקו עגינה An. gambiae (A11, טבלה 1) הנושא שני אתרי attP הפוכים ומסומן ב- CFP (למעלה), פלסמיד תורם עיצוב attB כפול המסומן ב- YFP (אמצע), ואתר ההכנסה הצפוי הנובע לאחר RMCE מוצלח (למטה). קו גלי: גנום יתושים; חצים מפוספסים: זרועות טרנספוזון piggyBac; 3xP3: מקדם של סמן פלואורסצנטי; SV40: שליחות קטלנית ויראלית; אורי: מקור השכפול; AmpR: גן עמידות אמפיצילין. קווי חצייה מייצגים את האתרים של שילוב מחדש בין אתרי attP ו- attB. חצים שחורים ממוספרים מייצגים אתרי איגוד פריימר עבור אימות מולקולרי של מוקד הכניסה (שלב 5 של הפרוטוקול). פלסמידים עם ציון מלא של יחיד וכפול ב-ATTB זמינים מהמחברים על פי בקשה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

הפרוטוקול המודגם כאן מאפשר ליצור קו מהונדס אנופלס יציב בתוך ~ 10 שבועות (בהנחה מחזור חיים יתוש 21 יום). שיעורי הבקיעה לאחר הזרקה של זחלים ב An. gambiae צפויים להיות בדרך כלל נמוכים יותר מאשר An. stephensi, אולם שיעורי הבקיעה בין 10-50% דווחו 9,20,20,24,26,33,43,47. בהינתן טכניקת הזרקה מתאימה, שיעורי הבקיעה של ≥20% מספיקים בדרך כלל כדי להניב שנאים. ניתן להעריך את ספיגת הדנ”א על ידי העוברים על ידי סינון זחלים צעירים לביטוי חולף של הסמן הפלואורסצנטי. בניסויי RMCE מוצלחים ב An. gambiae באמצעות מקדם 3xP3 עד 50% של זחלי G0 ששרדו הראו ביטוי אפיזומי של הסמן פפיאלי48 אנאלי. הערכות כלליות של יעילות טרנספורמציה קשה להעריך בקרב מעבדות ואפילו בקרב ניסויים כמו טרנספורמציה תלויה ביחסי גומלין מורכבים של משתנים כולל טוהר, ריכוז, גודל, גודל, רעילות פוטנציאלית של ה- DNA המוזרק, איכות הביצים, טיפול לפני ואחרי הזרקה של ביצים, גידול יתושים, והכי חשוב את החוויה של המפעיל. שיעורי טרנספורמציה עד 7% הושגו עבור RMCE ב An. gambiae (מחושב כמספר אירועי טרנספורמציה עצמאיים בסך הכל G0 אנשים)9,26,33, ועד 2.2% שיעור טרנספורמציה לאינטגרציה An. stephensi. אנו מציעים הזרקת לפחות 500 עוברים, אשר אמור להוביל לבקוע של לפחות 100 G0 זחלים ול 2-7 G0 מייסדים בוגרים שממנו ניתן להשיג צאצאים שהשתנו ביציבות. אם ניתן לצפות להקרנה לביטוי ארעי בזחלי G0, ניתן לצפות לעד 40 זחלים חיוביים. דוגמאות לאימות פנוטיפי של טרנספורמציה באמצעות הקרנה של סמנים פלואורסצנטיים המווסתים על ידי מקדם 3xP3 מדווחות באיור 4 ובפיגור  5. איור 4 מציג קו חדש של An. stephensi המתקבל על ידי החדרת קלטת מסומנת DsRed לקו עגינה המסומן ב- CFP (80.9, טבלה 1), וכתוצאה מכך צאצאי G1 מבטאים את שני הסמנים כפי שצוין על ידי הפלואורסצנטיות האדומה והכחולה שזוהתה בעיניים. עיצובי RMCE צפויים במקום זאת לגרום להחלפת הסמן שהוכנס במקור לקו העגינה עם זה של פלסמיד התורם. איור 5A ו-Figure  B ממחישים חילופי סמן אלה בקו עגינה מסוג An. gambiae המסומן ב- CFP (A11, טבלה 1) כאשר לאחר RMCE מוצלח סמן ה- CFP אובד וסמן YFP נרכש וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות צהובה (אך לא כחולה) של העין וכבל העצב33. מדי פעם, RMCE יכול לגרום לאירוע אינטגרציה יחיד במקום לחילופי הקלטת הטרנסגנית הרצויה כפי שמודגם באיור 5C, שם מוצג זחל המסומן הן ב- CFP המקורי והן בסמני YFP החדשים. הוא דיווח כי עד 50% מכלל אירועי טרנספורמציה הם שילובים בודדים9,33. בעת הקרנה לנוכחות של סמן פלואורסצנטי זה חיוני כדי להבחין האות שלה מן autofluorescence רקע אפשרי. הדבר חשוב במיוחד בעת שימוש ב-CFP כאשר זחלי Anopheles מציגים אוטופלואורסצנטיות כחולה טבעית (איור 6A). הגדלת ההגדלה וההתמקדות ברקמות ובאיברים שבהם פלואורסצנטיות צפויה להיות מונעת על ידי האמרגן נחוצה כדי לזהות אנשים חיוביים אמיתיים של CFP כפי שמודגם באיור 6B באמצעות סמן 3xP3-CFP. שנאים בודדים מוערכים סוף סוף מולקולרית באמצעות PCR כדי לאשר את אתר הכניסה הצפוי. איור 7 מדווח על אימות PCR ביחידים מקו חילופי An. gambiae המציג את שתי הכיוונים הפוטנציאליים של החדרה בגנום היתושים33. איור 4. אימות של אינטגרציה יחידה φC31 בזחלי An. stephensi (תצוגת גב). א) קו העגינה (80.9, טבלה 1) מבטא CFP בעיניים תחת הרגולציה של מקדם 3xP3 . ב) אינטגרציה מוצלחת גורמת לביטוי של DsRed שנרכש לאחרונה, כמו גם את סמן CFP המקורי בעיניים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5. אימות של φC31 RMCE בזחלי An. gambiae (נוף גחון). A) קו העגינה (A10, טבלה 1) מבטא CFP תחת הרגולציה של מקדם 3xP3 בעיניים (ה) ואת כבל העצבים (nc)5. ב) תוצאות RMCE מוצלחות בהחלפת סמן פלואורסצנטי מ- CFP ל- YFP33. C) אירוע אינטגרציה יחיד התרחש במהלך ניסוי RMCE שבו זחל טרנספורמטיבי מבטא הן את סמני CFP והן את סמני YFP. זחל זה נושא רכיבי GAL4/UAS הגורמים לתבנית ביטוי רחבה של YFP, חזקה במיוחד בשרירי הבטן (am). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6. CFP autofluorescence בזחלי An. gambiae (נוף הגב). A) תמונה זה לצד זה של זחל L4 חיובי (CFP+) ושלילי (CFP-) L4 באמצעות מסנן CFP. ב) תמונת תקריב של העיניים הזחליות החושפת CFP + לעומת CFP- אדם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7. אימות מולקולרי של הכיוון של החדרת קלטות ב- An. gambiae מהונדס מייצג שנוצר על ידי φC31 RMCE. ניתן להוסיף את הקלטת המהונדסת לאחת משתי כיוונים חלופיים (A או B) ביחס לאתר ההוספה. כל תגובת PCR (I – IV) משתמשת בשילוב של פריימרים (5-8)33 שנועדו לתת קטע הגברה אבחוני עבור כל כיוון כפי שצוין במפות הפלסמיד הסכמטיות. T1: אדם מהונדס מייצג הנושא אוריינטציה של הכנסה A; T2: אדם מהונדס מייצג הנושא אוריינטציה של הכנסה B; WT: סוג פראי; DL: קו עגינה; -: בקרת תגובה שלילית שבה מים שימשו כתבנית. נתון זה שונה מאדולפי ואח’ (2019)33. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מינים זן שם attP(ים) כרומו-כמה מקדם-סמן מוסד המוצא הפניה א. סטיבנסי אינדיאנה 26.10b סינגל 2R 3xP3-eCFP יוניב מקליפורניה אירווין 25 א. סטיבנסי אינדיאנה 44Cb סינגל X 3xP3-eCFP יוניב מקליפורניה אירווין 23, 24 א. סטיבנסי אינדיאנה 80.9b סינגל 2L 3xP3-eCFP יוניב מקליפורניה אירווין מחקר זה א. גמביה G3 113 סינגל 2R 3xP3-eCFP יוניב מקליפורניה אירווין מחקר זה א. גמביה קיל Ec סינגל 3R 3xP3-eCFP קיל יוניב. 19, 43 א. גמביה G3 X1 סינגל 2L אין סמן יוניב, מלך שטרסבורג 22 א. גמביה G3 YAttp סינגל Y 3xP3-RFP אימפריאל קולג’ לונדון 21 א. גמביה G3 A10b כפול 2R 3xP3-eCFP בית הספר ליברפול Trop. Med. 5 א. גמביה G3 A11b כפול 2R 3xP3-eCFP בית הספר ליברפול Trop. Med. 9 a. זן מאוניברסיטת ג’ונס הופקינס (מתנתו של מ ‘ג’ייקובס-לורנה) ובתרבות באוניברסיטת קליפורניה אירוויין במשך >20 שנה. b. שורות אלה זמינות מהמחברים על פי בקשה סבירה. ג. קו זה זמין במאגר BEI www.beiresources.org כ- MRA-1163. טבלה 1. אנופלס attP קווי עגינה.

Discussion

העיצוב המדויק של פלסמידים מתויגים attB התואמים לקו העגינה של בחירה הוא בעל חשיבות עליונה להצלחת הניסוי. יש לשקול היטב את הבחירה של הסמן המשמש לסינון של שנאים, כולל צבע פלואורסצנטיות ודפוס הביטוי שלה, אשר יהיה כפוף לתבנית שכבר קיימת בקו העגינה. יש צורך להשתמש סמנים פלואורסצנטיים שניתן להבחין בקלות: שילובי סמן טובים כוללים RFP (אדום)/CFP (ציאן), RFP (אדום)/GFP (ירוק), RFP (אדום)/YFP (צהוב) ו- YFP (צהוב)/CFP (ציאן), בעוד שילובים שיש להימנע מהם הם YFP (צהוב)/GFP (ירוק) ו- CFP (ציאן)/GFP (ירוק). מקדם 3xP33, ספציפי לעיניים ולחוט העצבים, הוא הנפוץ ביותר להנעת הביטוי של סמנים פלואורסצנטיים עבור טרנסגנזה יתושים. ואכן, כל קווי העגינה של אנופלס הזמינים כיום משתמשים במקדם זה. אזורי רגולציה חלופיים הם של הגן פוליוביקוויטין An. gambiae (PUBc)5 או מקדם הנגיף IE120, אשר מניעים ביטוי ברקמות מרובות. כאשר נעשה שימוש יחד עם 3xP3, מקדמים אלה ירחיבו את שילובי הצבעים האפשריים ואפילו את השימוש באותו פלואורופור. היזמים המצוינים פעילים לאורך מחזור החיים של היתושים ומאפשרים סינון וניטור פלואורסצנטיות בכל שלבי החיים. שיקול נוסף במהלך תכנון הפלסמיד הוא גודל המטען שיש לשלב או להחליף. בעוד שלמערכת φC31 יש יכולות נשיאה יוצאות דופן18, יש לקחת בחשבון כי גודל הפלסמיד התורם בדרך כלל מתואם באופן שלילי עם יעילות טרנספורמציה22.

בפרוטוקול המתואר מקור האינטגראז הוא פלסמיד עוזר המבטא את האנזים בכל מקום40. הנוכחות בכל מקום של integrase עלול להוביל טרנספורמציה של תאים סומטיים אם microinjections אינם מכוונים במדויק לאזור שבו נוצר נבט. בעוד אירועי טרנספורמציה כאלה יאבדו כפי שהם אינם תורשתיים, אפקטים סומטיים יכולים להפחית את הכושר של אנשים מוזרקים. כדי למנוע זאת ולהגדיל את יעילות הטרנספורמציה, ביטוי integrase יכול להיות מוגבל לקו הנבט, למשל באמצעות מקדם vasa2,26. פרוטוקולים אחרים מתארים את השימוש ב- RNA שליח מתומלל במבחנה (mRNA) כמקור של φC31 integrase19,24,43. עם זאת, זה כרוך הכנה מייגעת של mRNA ודורש טיפול זהיר של תערובת ההזרקה ושימוש ריאגנטים חינם RNase כדי למנוע השפלה. מקורות פלסמיד של אינטגראס הוכחו הן An. gambiae9,21,22,26,33,37 ו An. stephensi (A.A. תקשורת אישית) להיות אמין ולהוביל טרנספורמציה יעילה, ולכן הם האפשרות המועדפת עלינו. אפשרות נוספת לאספקת integrase היא ייצור in vivo שלה בקווי עוזר עגינה עצמית. קווים כאלה נוצרו An. gambiae המבטאים את φC31 integrase תחת הרגולציה של ננו מקדם ספציפי נבטים ונמצאו להוביל להישרדות משופרת ויעילות טרנספורמציה20. עם זאת, יש לקחת בחשבון עומסי כושר פוטנציאליים המוטלים על ידי ייצור in vivo של האנזים integrase בקו המסייע.

כמו בטכניקות מהונדסות אחרות, טיפול מיוחד חייב להיות שמור לגידול וחצייה של אנשים הנובעים עוברים מוזרקים כדי למקסם את הסיכויים לשחזר טרנספורמציה. אנשים שירשו ביציבות את הטרנסג’ן ניתן לשחזר תחילה בצאצאי G1. עם זאת, סימנים מוקדמים של טרנספורמציה פוטנציאלית ניתן להעריך על ידי נוכחות של ביטוי אפיזומי חולף של סמן פלואורסצנטי בפפילות אנאלי ו / או חוט עצב של G0 הראשון והשני זחלי instar בעת שימוש 3xP3 מקדם43. בעוד נוכחות של פלואורסצנטיות חולפת מרמזת על משלוח פלסמיד מוצלח, זה לא מבטיח טרנספורמציה נבטית תורשתית. באופן דומה, היעדר ביטוי ארעי אינו שולל טרנספורמציה מוצלחת. עם זאת, נצפתה כי אנשים חיוביים חולפים נוטים יותר להניב צאצאים מהונדסים לעומת אלה שליליים חולפים43,48. בידיים מומחים, גידול וחצייה של אנשים חיוביים בלבד עשוי להיות אופציה להפחית את מספר היתושים. עם זאת, בהתחשב בחשיבות ובשבריריות של זחלי G0 קטנים, כמות המניפולציה הנמוכה ביותר עדיין מומלצת וגידול כל האנשים G0 מומלץ תמיד.

ערכת ההזדווגות המדווחת בפרוטוקול זה נועדה למקסם את הסיכוי להזדווגות ולבודד אירועי טרנספורמציה עצמאיים. עם זאת, אם מרחב חרקים או זמינות כוח אדם הוא בעיה, G0 מבוגרים יכולים להיות משולבים על ידי סקס בכלובים בודדים אם מספיק אנשים בני המין השני מסופקים. התקנה כזו לא תאפשר אפליה בין אירועי טרנספורמציה מרובים המתרחשים אצל אנשים מאותו כלוב. בהתאם להתקנה הניסיונית, נוכחות של סמן כפול (אינטגרציה יחידה) או יחיד (RMCE) צפויה במהלך תהליך ההקרנה. בניסויי אינטגרציה בודדים חשוב לאמת את נוכחותו של הסמן המקורי מקו העגינה, ואילו ב- RMCE חשוב לאמת את אובדן הסמן המשולב בעבר. אכן, זה לא נדיר בעיצובים RMCE לשחזר טרנספורמציה שבה אינטגרציה אחת במקום חילופי התרחש עקב recombination של אתר attP יחיד9,33. אצל אנשים כאלה שני סמנים פלואורסצנטיים נוכחים, כמו גם את כל עמוד השדרה plasmid התורם המדגיש את החשיבות של ביצוע הקרנה יסודית עבור שני סמנים פלואורסצנטיים.

בעוד שנוכחותם של דפוסי פלואורסצנטיות צפויים מצביעה על טרנספורמציה מוצלחת, יש לבצע אפיון מולקולרי של אתר ההחדרה. כדי לעשות זאת, הכנת מפות מדויקות של מוקד ההחדרה החזוי, כולל האזורים הגנומיים האגפים של קו העגינה, חיונית לתכנון פריימרים לאוליגונוקלאוטידים אבחנתיים נאותים לניתוחי הגברה גנטית. אירועי אינטגרציה בודדים גורמים להיווצרות אתרים היברידיים attR ו – attL בצומת שבין הדנ”א המשולב החדש לבין הקלטת שהוכנסה בעבר. ניתן לייעד אתרים אלה לאימות אתר הכנסה. בעיצובי RMCE, החדרת קלטת התורם יכולה להתרחש בשתי אוריינטציות חלופיות ביחס למוקוס הגנומי, ולכן ניתן להשתמש בארבעה פריימרים בשילובי PCR חלופיים כדי לזהות איזו כיוון הקו נושא. מכיוון שהכיוון של החדרת קלטות עשוי להשפיע על ביטוי טרנסג’ן, בניתוח ביטוי גנים השוואתי חשוב להשתמש בקווים הנושאים את אותו כיוון הכנסה.

כאשר עובדים עם מספר נמוך של שנאים זה לא יכול להיות רצוי להקריב אנשים שלמים לניתוח מולקולרי. אפשרות לכך היא ביצוע ניתוח מולקולרי על DNA המופק מרגליו של מבוגר יחיד46 כמו אובדן רגל אינו משפיע על יכולת נשית בוגרת להזדווג oviposit49. עם זאת, קיים סיכון של פגיעה באדם בתהליך של הסרת הרגל. ההצלחה הושגה באמצעות מקרים pupal זרוק (L. Grigoraki תקשורת אישית), אולם הגישה הבטוחה ביותר היא לבצע ניתוח מולקולרי על הורים G2 לאחר קבלת צאצאי G3 קיימא.

בשנים האחרונות, CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה באופן ביצוע עריכת הגנום הספציפי לאתר26,41,50,51.51. שלא כמו RMCE המופנה על ידי האתר, שילובי גנים בתיווך CRISPR/Cas9 (נוק-אין) אינם תלויים בנוכחותם של אתרי רקומבינציה שהוכנסו מראש עם אירוע טרנספורמציה של שלב אחד בלבד. עם זאת, מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על נוכחותם של רצפים גנומיים ידועים גדולים המאגפים את אתר הכניסה הרצוי לתיקון מכוון הומולוגי מוצלח, כמו גם על זיהוי האתר היעיל בתיווך RNAs מדריך. תנאים אלה לא תמיד ניתן לעמוד או עשוי להיות מייגע כדי לפתור בעיות, בהתחשב בזמינות של קווי עגינה מרובים An. gambiae ו An. stephensi וקווים הנגזרים מהם, מערכת φC31 נשאר כלי בעל ערך רב כדי לבצע השוואות פנוטיפיות ישירות בין טרנסג’נים באותם מיקומים גנומיים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לקיונה פרקר (UCI) על שסיפקה תמונות של זחלים מהונדסים An. stephensi , ולפרייזר קולמן (LSTM) ולבת’ פולטון (LSTM) על שסיפקו זחלי An. gambiae מהונדסים. בת ‘ פולטון (LSTM) גם סיפקה סיוע יקר במהלך ההדמיה של זחלי An. gambiae . עבודה זו מומנה על ידי מכון טאטא לגנטיקה וחברה (TIGS) וקרן Catalyst המנהלת של LSTM שהוענקה ל- A.A. (DCF2014AA). איי.איי.ג’יי הוא פרופסור לדונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.

Materials

1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adolfi, A., Lycett, G. J. Opening the toolkit for genetic analysis and control of Anopheles mosquito vectors. Current Opinion in Insect Science. 30, 8-18 (2018).
  2. Grossman, G. L., Rafferty, C. S., Clayton, J. R., Stevens, T. K., Mukabayire, O., Benedict, M. Q. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 10 (6), 597-604 (2001).
  3. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. Journal of Biological Chemistry. 277 (11), 8759-8762 (2002).
  4. Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Molecular Biology. 11 (4), 291-297 (2002).
  5. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  6. Carballar-Lejarazú, R., Jasinskiene, N., James, A. Exogenous gypsy insulator sequences modulate transgene expression in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7176-7181 (2013).
  7. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  8. Nolan, T., Petris, E., Müller, H. M., Cronin, A., Catteruccia, F., Crisanti, A. Analysis of two novel midgut-specific promoters driving transgene expression in Anopheles stephensi mosquitoes. PLoS ONE. 6 (2), 16471 (2011).
  9. Lynd, A., Balabanidou, V., Vontas, J., Lycett, G. J. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: appliction to cuticular hydrocarbon synthesis. BioRxiv. , (2019).
  10. O’Brochta, D. A., Alford, R. T., Pilitt, K. L., Aluvihare, C. U., Harrell, R. A., Harrell, R. A. piggyBac transposon remobilization and enhancer detection in Anopheles mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16339-16344 (2011).
  11. O’Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based enhancer-trapping in the malaria mosquito Anopheles stephensi. G3. 2 (11), 1305-1315 (2012).
  12. Macias, V. M., et al. nanos-Driven expression of piggyBac transposase induces mobilization of a synthetic autonomous transposon in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 87, 81-89 (2017).
  13. Nimmo, D. D., Alphey, L., Meredith, J. M., Eggleston, P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome. Insect Molecular Biology. 15 (2), 129-136 (2006).
  14. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: Versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354, 301-309 (2011).
  15. Thorpe, H. M., Smith, M. C. M. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5505-5510 (1998).
  16. Khaleel, T., Younger, E., Mcewan, A. R., Varghese, A. S., Smith, M. C. M. A phage protein that binds φC31 integrase to switch its directionality. Molecular Microbiology. 80 (6), 1450-1463 (2011).
  17. Farruggio, A. P., Chavez, C. L., Mikell, C. L., Calos, M. P. Efficient reversal of phiC31 integrase recombination in mammalian cells. Biotechnology Journal. 7 (11), 1332-1336 (2012).
  18. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  19. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS ONE. 6 (1), 14587 (2011).
  20. Meredith, J. M., Underhill, A., McArthur, C. C., Eggleston, P. Next-Generation Site-Directed Transgenesis in the Malaria Vector Mosquito Anopheles gambiae: Self-Docking Strains Expressing Germline-Specific phiC31 Integrase. PLoS ONE. 8 (3), 59264 (2013).
  21. Bernardini, F., et al. Site-specific genetic engineering of the Anopheles gambiae Y chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7600-7605 (2014).
  22. Volohonsky, G., et al. Tools for Anopheles gambiae Transgenesis. G3. 5 (6), 1151-1163 (2015).
  23. Amenya, D. A., et al. Comparative fitness assessment of Anopheles stephensi transgenic lines receptive to site-specific integration. Insect Molecular Biology. 19 (2), 263-269 (2010).
  24. Isaacs, A. T., et al. Transgenic Anopheles stephensi coexpressing single-chain antibodies resist Plasmodium falciparum development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 1922-1930 (2012).
  25. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2015).
  27. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of Transgenic Drosophila by Using the Site-Specific Integrase from Phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  28. Franz, A. W. E., et al. Comparison of transgene expression in Aedes aegypti generated by mariner Mos1 transposition and site-directed recombination. Insect Molecular Biology. 20 (5), 587-598 (2011).
  29. Labbé, G., Nimmo, D., Alphey, L. piggybac-and PhiC31-Mediated Genetic Transformation of the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (8), 788 (2010).
  30. Schetelig, M. F., Scolaric, F., Handler, A. M., Kittelmann, S., Gasperi, G., Wimmer, E. A. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18171-18176 (2009).
  31. Yonemura, N., et al. phiC31-integrase-mediated, site-specific integration of transgenes in the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Applied Entomology and Zoology. 43 (11), 997-1008 (2013).
  32. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  33. Adolfi, A., Poulton, B., Anthousi, A., Macilwee, S., Ranson, H., Lycett, G. J. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  34. Haghighat-Khah, R. E., et al. Site-specific cassette exchange systems in the aedes aegypti mosquito and the Plutella xylostella moth. PLoS ONE. 10 (4), 0121097 (2015).
  35. Long, D., Lu, W., Zhang, Y., Bi, L., Xiang, Z., Zhao, A. An efficient strategy for producing a stable, replaceable, highly efficient transgene expression system in silkworm, Bombyx mori. Scientific Reports. 5 (1), 8802 (2015).
  36. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006113 (2017).
  37. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  38. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  39. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  40. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  41. Dong, Y., Simões, M. L., Marois, E., Dimopoulos, G. CRISPR/Cas9 -mediated gene knockout of Anopheles gambiae FREP1 suppresses malaria parasite infection. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006898 (2018).
  42. Lombardo, F., Lycett, G. J., Lanfrancotti, A., Coluzzi, M., Arcà, B. Analysis of apyrase 5′ upstream region validates improved Anopheles gambiae transformation technique. BMC research notes. 2, 24 (2009).
  43. Pondeville, E., et al. Efficient ΦC31 integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  44. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nature protocols. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  45. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. 5, 216 (2007).
  46. Lynd, A., et al. Insecticide resistance in Anopheles gambiae from the northern Democratic Republic of Congo, with extreme knockdown resistance (kdr) mutation frequencies revealed by a new diagnostic assay. Malaria Journal. 17 (1), 412 (2018).
  47. Marinotti, O., et al. Development of a population suppression strain of the human malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Malaria Journal. 12 (1), 142 (2013).
  48. Adolfi, A. In vivo functional genetic analysis of insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. University of Liverpool. , (2017).
  49. Isaacs, A. T., Lynd, A., Donnelly, M. J. Insecticide-induced leg loss does not eliminate biting and reproduction in Anopheles gambiae mosquitoes. Scientific Reports. 7, 46674 (2017).
  50. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  51. Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly efficient site-specific mutagenesis in malaria mosquitoes using CRISPR. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  52. Poulton, B. C., et al. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , (2021).

Tags

Site-directed IntegrationAttB-mediated IntegrationCassette ExchangeAnophelesMalariaTransgenesisTransgenic MosquitoesEmbryo MicroinjectionMarker GeneHelper PlasmidIntegrase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-Directed φC31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria. J. Vis. Exp. (168), e62146, doi:10.3791/62146 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image