Site-Directed <em>&#966;C31</em>-Mediated Integration and Cassette Exchange in <em>Anopheles</em> Vectors of Malaria

Adriana Adolfi; Amy Lynd; Gareth J. Lycett; Anthony A. James

doi:10.3791/62146

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Genetics

Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Published: February 02, 2021

doi:

10.3791/62146

Adriana Adolfi^1,2, Amy Lynd¹, Gareth J. Lycett¹, Anthony A. James^2,3

¹Vector Biology Department,Liverpool School of Tropical Medicine, ²Department of Microbiology & Molecular Genetics,University of California, ³Department of Molecular Biology & Biochemistry,University of California

Summary

Le protocole décrit comment obtenir des modifications dirigées par le site dans le génome des moustiques du paludisme anophèles en utilisant le système φC31 . Les modifications décrites comprennent à la fois l’intégration et l’échange de cassettes transgéniques dans le génome des lignes d’amarrage portant attP.

Abstract

L’analyse génomique fonctionnelle et les stratégies connexes de lutte génétique contre le paludisme reposent sur des méthodes validées et reproductibles pour modifier avec précision le génome des moustiques anophèles. Parmi ces méthodes, le système φC31 permet une intégration précise et stable dirigée par site des transgènes, ou la substitution de cassettes transgéniques intégrées par échange de cassettes médiées par recombinase (RMCE). Cette méthode repose sur l’action de l’intégrase bactériophage Streptomyces φC31 pour catalyser la recombinaison entre deux sites d’attachement spécifiques désignés attP (dérivé du phage) et attB (dérivé de la bactérie hôte). Le système utilise un ou deux sites attP qui ont été intégrés précédemment dans le génome du moustique et le(s) site(s) attB dans l’ADN du modèle de donneur. Nous illustrons ici comment modifier de manière stable le génome des lignes d’amarrage des anophèles portant attP à l’aide de deux plasmides: un donneur marqué attB portant le modèle d’intégration ou d’échange et un plasmide auxiliaire codant pour l’intégrase φC31. Nous rapportons deux résultats représentatifs de la modification dirigée par le site médiée par φC31 : l’intégration unique d’une cassette transgénique chez an. stephensi et rmCE chez les moustiques An. gambiae. La manipulation du génome médiée par φC31 offre l’avantage d’une expression transgénique reproductible à partir de sites génomiques validés et neutres en termes de condition physique, permettant des analyses qualitatives et quantitatives comparatives des phénotypes. La nature de l’intégration dirigée par site simplifie également considérablement la validation du site d’insertion unique et du schéma d’accouplement pour obtenir une lignée transgénique stable. Ces caractéristiques et d’autres font du système φC31 un composant essentiel de la boîte à outils génétique pour la manipulation transgénique des moustiques du paludisme et d’autres insectes vecteurs.

Introduction

La capacité de modifier le génome des moustiques vecteurs de maladies de manière fiable et reproductible a renforcé la validation fonctionnelle in vivo des gènes et ouvert les portes à des stratégies de lutte antivectorielle réalisables, telles que celles ciblant les moustiques anophèles qui transmettent le paludisme1.

L’édition précoce du génome des moustiques reposait uniquement sur une transformation médiée par des éléments transposables (TE), piggyBac étant le transposon le plus couramment utilisé chez Anopheles2,3,4. Cependant, la nature aléatoire de l’intégration te peut entraîner des modifications indésirables telles que des knockouts de gènes (mutagénèse insertionnelle) et des effets de position significatifs sur ^{l’expression} du transgène5,6,7,8. Les insertions multiples sont également courantes lors de l’utilisation de piggyBac5,9, ce qui rend laborieux la validation et l’isolement des lignées transgéniques avec des insertions uniques. D’autres inconvénients incluent leur remobilisation potentielle, comme observé dans la lignée germinale d’Anopheles stephensi lorsqu’il fournit une source de transposase piggyBac10,11,12, et leur taille limitée de cargaison d’ADN (10-15 kb de longueur) avec une efficacité de transformation diminuant avec l’augmentation de la taille du plasmide ^donneur13,14.

Des approches d’intégration dirigées vers le site ont été introduites pour contourner ces problèmes. La modification du génome dirigée par le site la plus courante chez les moustiques est celle médiée par le système φC31 (figure 1a). Ceci est entraîné par une intégrase virale qui catalyse la recombinaison entre deux sites d’attachement hétérospécifique (att) présents naturellement dans le génome du bactériophage φC31 (attP) et dans l’hôte de la bactérie Streptomyces (attB)¹⁵. La recombinaison des deux sites est unidirectionnelle et entraîne la formation de sites hybrides (attL et attR). La recombinaison de tels sites hybrides (conduisant à l’excision de l’ADN) nécessiterait non seulement la présence d’une intégrase virale active, mais aussi d’un autre facteur de recombinaison codé par les ^phages16,17. Un site d’intégration stable est ainsi généré qui soulage la question d’une éventuelle remobilisation ^{indésirable15}. De plus, le système permet l’intégration de cargaisons volumineuses (par exemple, l’intégration de constructions de 100 kb > a été signalée dans D. melanogaster18), ce qui augmente considérablement les capacités de charge. L’intégration se produit dans un seul locus génomique prédéfini qui simplifie grandement la validation de l’insertion et du schéma d’accouplement pour obtenir une lignée transgénique stable. Enfin, la nature orientée site de l’intégration permet la normalisation de l’expression car les transgènes alternatifs sont situés dans le même locus et sont donc régulés dans le même contexte génomique voisin. En effet, l’une des principales applications de la technique est la comparaison directe des phénotypes conférés par différents transgènes suite à l’insertion dans un locus identique.

La réalisation de l’intégration médiée par φC31 implique deux phases: la phase I est la création de lignes d’amarrage transgéniques transportant un ou plusieurs sites attP, et la phase II est l’intégration dirigée par le site d’une cargaison flanquée d’attB dans le génome de la ligne d’amarrage19. La création de lignes d’amarrage de phase I s’est appuyée sur l’intégration aléatoire médiée par TE de constructions marquées attP et a donc impliqué un processus laborieux initial (y compris des analyses de transfert de sud et de PCR inverse sur une progéniture mono-femelle) pour isoler et valider des lignées transgéniques portant un seul événement d’intégration dans des emplacements génomiques uniques, transcriptionnellement actifs et neutres en termes de condition physique. Néanmoins, plusieurs lignes d’amarrage pour l’intégration unique médiée par φC31 ont été développées et validées dans An. gambiae19,20,21,22 et dans An. stephensi23,24,25 (tableau 1). Chacune de ces lignées varie en termes d’emplacement génomique du site d’amarrage et de fond génétique spécifique à la souche et à partir d’elles, une grande variété de nouvelles lignées transgéniques peuvent être créées. La validation complexe des intégrations médiées par TE pour la production de lignes d’amarrage peut désormais être contournée par la technologie CRISPR/^Cas926 ; cependant cela repose sur la connaissance a priori des loci neutres à cibler et de leurs séquences environnantes.

L’intégration médiée par φC31 a été largement appliquée à l’édition du génome des insectes à partir de l’organisme modèle D. melanogaster27, aux moustiques Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 et An. stephensi24, ainsi qu’à d’autres insectes, notamment Ceratitis capitata30 et Bombyx ^mori31.

Une limitation de l’intégration médiée par φC31, en particulier compte tenu des rejets potentiels sur le terrain pour la lutte antivectorielle, est l’intégration dans le génome du moustique de l’ensemble du plasmide donneur porteur d’attB, y compris les séquences indésirables telles que les marqueurs géniques de résistance aux antibiotiques et les composants de l’épine dorsale plasmidique d’origine bactérienne. Pour y remédier, une modification du système standard, l’échange de cassettes à médiation recombinase (RMCE), a été mise en œuvre pour permettre le remplacement précis d’une cassette transgénique précédemment intégrée par un nouvel ADN donneur (Figure 1b). Ceci est réalisé en utilisant deux sites att inversés flanquant les cassettes donneuse et receveuse à chaque extrémité, ce qui entraîne deux événements de recombinaison indépendants à se produire simultanément, ce qui entraîne un échange de cassettes sans intégration de l’épine dorsale plasmidique. Cette conception améliorée contourne l’intégration de séquences indésirables et élargit l’application des systèmes φC31 pour inclure, par exemple, l’intégration de cargaisons d’ADN non marquées par dépistage de la perte d’un marqueur fluorescent précédemment ^intégré32.

RMCE a d’abord été obtenu avec D. melanogaster32 et plus tard appliqué avec succès à des insectes non modèles, y compris An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 et B. ^mori35. Plusieurs lignes d’amarrage pour RMCE ont été développées et validées en Gambie5,9,26 (Tableau 1). À notre connaissance, le RMCE n’a pas encore été exploré chez d’autres espèces de vecteurs d’Anophèles.

À ce jour, le système φC31 a été largement utilisé chez les moustiques anophèles pour introduire et étudier une variété de molécules, y compris les effecteurs antimalaires19,24,36, les composants du système GAL4/UAS pour surexprimer et détruire les gènes pour les études de résistance aux ^{insecticides9,33}, les éléments régulateurs, les gènes rapporteurs5,21,37 et les éléments de forçage ^{génétique26} ^,³⁸.

Ce protocole décrit comment effectuer 1) l’intégration dirigée par le site d’une cargaison flanquée d’attB et 2) le RMCE d’une construction flanquée de sites attB inversés dans le génome des lignes d’amarrage d’Anophèles . Ceci est réalisé en utilisant deux plasmides: un plasmide marqué attB du donneur portant le transgène d’intérêt, et un plasmide auxiliaire exprimant l’intégrase φC31 . Les principaux vecteurs du paludisme An. gambiae et An. stephensi sont utilisés comme exemples spécifiques, mais ces protocoles sont applicables à d’autres espèces d’Anophèles .

Graphique 1. Modifications du génome dirigées par le site, intégration unique et échange de cassettes médié par la recombinase (RMCE), à l’aide du système φC31. L’intégrase φC31 (INT, double flèche grise) catalyse la recombinaison entre le(s) site(s) attB (rayé violet) présent(s) dans un plasmide donneur et le(s) site(s) attP (rayé bleu) présent(s) dans une ligne d’amarrage réceptrice, ce qui entraîne la formation de sites hybrides attL et attR. A) L’intégration est réalisée lorsque les sites attB et attP uniques se recombinent et aboutissent à la présence de deux marqueurs intégrés (bleu et rouge). B) Le RMCE se produit lorsque deux sites attB/P se recombinent simultanément et entraîne le remplacement de la cassette entre les sites att de la ligne d’amarrage (marqueur bleu) par celle portée par le plasmide donneur (marqueur rouge). C) Séquences nucléotidiques partielles d’attP (bleu) et d’attB (violet) et les sites hybrides attL/R. La recombinaison se produit entre les séquences de base « TT » surlignées en noir gras. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Remarque : Un flux de travail schématique du protocole illustré est illustré à la figure 2. 1. Conception des plasmides marqués φC31 attB (Figure 3) Créer des plasmides donneurs attB portant les composants essentiels suivants Marqueur fluorescent dominant Choisissez un promoteur pour piloter l’expression du marqueur fluorescent.REMARQUE: Pour la transgénèse des anophèles, les marqueurs fluorescents sont généralement sous la régulation du promoteur 3xP33, qui stimule l’expression dans les yeux et le cordon nerveux. Alternativement, le promoteur PUBc5 peut être utilisé lorsque l’expression dans plusieurs tissus est souhaitée. Les plasmides donneurs et les lignes d’amarrage utilisés comme exemples dans ce protocole sont marqués à l’aide du promoteur 3xP3. Choisissez une protéine fluorescente (FP) compatible avec celle de la ligne d’amarrage de réception afin qu’elle soit facilement reconnaissable.REMARQUE: N’utilisez pas le même marqueur qui est déjà présent dans la ligne d’amarrage et évitez l’utilisation simultanée de GFP (vert) / YFP (jaune) et GFP (vert) / CFP (cyan) car ils sont très difficiles à différencier de manière fiable. Les plasmides donneurs utilisés comme exemples dans ce protocole sont marqués avec DsRed ou YFP car ils doivent être intégrés dans une ligne d’amarrage marquée avec CFP. site(s) de recombinaison attB Utiliser un seul site attB pour l’intégration d’une cassette transgénique (conception single-attB ) (Figure 3A). Utilisez deux sites attB inversés pour le RMCE (conception double attB) où les sites sont inversés l’un par rapport à l’autre et joignez le modèle d’ADN du donneur (Figure 3B).REMARQUE : L’orientation du ou des sites attB doit être compatible avec celle du ou des sites attP présents dans la ligne d’amarrage. Cargaison transgénique souhaitée Utilisez toutes les autres caractéristiques souhaitées à intégrer dans le génome du moustique en fonction du but spécifique de l’expérience. Nous décrivons ici l’intégration d’une molécule effectrice antipaludique dans le génome d’An. stephensi et l’intégration des composants du système GAL4/UAS dans les moustiques An. gambiae . Composants de l’épine dorsale plasmidique Inclure, entre autres composants essentiels pour la réplication des plasmides chez les bactéries, un marqueur pour la sélection des plasmides in vitro (c.-à-d. un gène de résistance aux antibiotiques).REMARQUE: L’épine dorsale plasmidique sera intégrée dans le génome du moustique dans la conception à un seul attB pour l’intégration (Figure 3A), tandis qu’elle ne sera pas insérée dans la conception à double attB pour RMCE (Figure 3B). 2. Préparation des plasmides pour le mélange de microinjection REMARQUE: Le protocole illustré ici implique l’utilisation de deux plasmides: un plasmide donneur marqué attB portant le transgène d’intérêt, et un plasmide auxiliaire qui exprime l’intégrase φC31 sous la régulation du promoteur Hsp70 de la drosophile40. Purifiez les plasmides donneurs et auxiliaires à l’aide d’un kit de purification de plasmides sans endotoxines.REMARQUE: Séquencer la préparation finale de plasmide utilisée pour l’injection afin de vérifier l’intégrité de tous les composants. Combiner des quantités appropriées des deux plasmides pour obtenir un mélange avec une concentration finale de 350 ng/μL du plasmide donneur et de 150 ng/μL du plasmide auxiliaire lorsqu’il est remis en suspension dans un tampon d’injection.REMARQUE: Lors du calcul du volume de mélange nécessaire, considérez que 10-15 μL sont suffisants pour chaque jour d’injections prévues et que l’ADN peut être préparé à l’avance et stocké à -20 ° C. Des concentrations de plasmides auxiliaires intégrases de 60 à 500 ng/μL et des concentrations de plasmides donneurs de 85 à 200 ng/μL ont également été rapportées21,22,26,41. Précipiter l’ADN en ajoutant 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 2,5 volumes d’EtOH glacé à 100 % et de vortex. Un précipité blanc doit être immédiatement visible. Le fait d’avoir des préparations plasmidiques initiales très concentrées (c.-à-d. ~1 μg/μL) améliore l’efficacité des précipitations.REMARQUE: Point d’arrêt – Le précipité peut être stocké à -20 ° C pendant la nuit. Centrifuger à 15 000 x g pendant 20 min à 4 °C, jeter le surnageant et laver la pastille avec 1 mL d’EtOH glacé à 70 %. Laver la pastille avec 1 mL d’EtOH glacé à 70 % et centrifuger à 15 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant sans déranger la pastille et séchez à l’air. Remettre la pastille dans 1x tampon d’injection (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, 0,22 μm filtre stérilisé) pour atteindre une concentration finale totale de 500 ng/μL.REMARQUE: Supposons qu’une partie de l’ADN sera perdue pendant le processus de précipitation; par conséquent, ajoutez d’abord un plus petit volume de tampon d’injection, vérifiez la concentration sur un spectrophotomètre (par exemple, Nanodrop), puis ajoutez un volume restant approprié pour atteindre 500 ng / μL. Assurez-vous que l’ADN est soigneusement remis en suspension, préparez des aliquotes de 10 à 15 μL chacune et conservez-les à -20 °C. Le jour de l’injection, décongeler une aliquote et centrifuger à 15 000 x g pendant 5 min pour éliminer les résidus de particules.REMARQUE: Une autre méthode d’élimination des particules consiste à filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm. Évitez la présence de résidus de particules dans le mélange d’injection car ils entraînent un blocage de l’aiguille lors de la microinjection embryonnaire. 3. Microinjection d’embryons à partir d’une ligne d’amarrage d’Anophèle Nourrir par le sang des moustiques âgés de 4 à 7 jours à partir de la ligne d’amarrage souhaitée 72 h avant la microinjection (c.-à-d. pour injection le lundi et le mardi nourrir les femelles le vendredi précédent; pour injection le jeudi et le vendredi nourrir les femelles le lundi de la même semaine). Nourrir par le sang des moustiques de type sauvage (WT) (c.-à-d. des moustiques ayant le même bagage génomique que la ligne d’amarrage) le même jour; ceux-ci seront nécessaires pour le croisement.REMARQUE: La taille et la qualité du repas sanguin affectent la qualité des œufs, il est donc recommandé de toujours utiliser du sang frais (c.-à-d. du sang prélevé au cours des 7 jours précédents). L’alimentation par bras ou l’alimentation de souris peut augmenter la qualité et la quantité des œufs, mais ces méthodes ne sont pas encouragées. Des protocoles approuvés spécifiques seront nécessaires pour l’utilisation humaine et animale. Effectuer des micro-injections embryonnaires Effectuer des micro-injections d’embryons d’An. gambiae dans 25 mM de NaCl42 en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 45 degrés. Pour un protocole détaillé pour la collecte, l’alignement et la micro-injection d’embryons, voir Pondeville et al.43 et Lobo et al.44. Effectuer des microinjections embryonnaires d’An. stephensi dans de l’huile d’halocarbure 700:27 (2:1) en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 30 degrés. Un protocole détaillé pour la collecte, l’alignement et la micro-injection d’embryons peut être trouvé dans Terenius et al.45 et Lobo et al.44. Transférer les œufs immédiatement après l’injection dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée stérile (pH 7,2) et les remettre dans des conditions insectaires. À l’éclosion, transférer quotidiennement les larves de G0 dans un plateau contenant de l’eau distillée salée (0,1 % de sel tonique) et les ramener aux nymphes. Taux d’éclosion record (c.-à-d. nombre de larves écloses/nombre d’embryons injectés).REMARQUE: Le mouvement des embryons facilite l’éclosion, de sorte qu’un tourbillon doux est souhaitable. L’éclosion devrait commencer ~ 48 h après l’injection. Étant donné que l’injection peut entraîner un léger retard de développement, il est conseillé de surveiller les larves à éclosion tardive pendant 3 à 4 jours. 4. Croisement et filtrage des personnes transformées [ÉTAPE FACULTATIVE] Criblage G0 (injecté) 1ère ou 2ème larve d’instar (L1-L2) pour l’expression transitoire du marqueur fluorescent. Utilisez une pipette en verre à pointe fine pour transférer les larves de G0 L1-L2 vers une lame de microscope avec des puits. Placez une larve dans chaque puits. Utilisez un stéréoscope à fluorescence avec le filtre approprié pour dépister la présence d’une expression transitoire du marqueur fluorescent.REMARQUE: Le modèle d’expression transitoire est dicté par le promoteur utilisé. Lors de l’utilisation du promoteur 3xP3, l’expression transitoire du marqueur fluorescent est visible dans les papilles anales (voir la figure 6 dans Pondeville et al.43) Arrière G0 positifs individus séparément. Trier les pupes G0 par sexe sous un stéréoscope52. Laissez les mâles émerger dans des cages séparées en groupes de 3 à 5 (familles fondatrices) et ajoutez un excès de 10 fois de femelles WT appariées selon l’âge.REMARQUE: Étant donné que les mâles s’accouplent plusieurs fois, il est important de fournir un excès de femelles WT pour maximiser les chances d’accouplement de chaque mâle. Laissez les femelles émerger dans des cages séparées en groupes de 10 à 15 (familles fondatrices) et ajoutez un nombre égal de mâles WT appariés selon l’âge.REMARQUE: S’il y a peu d’espace dans l’insecte, les femelles peuvent émerger toutes ensemble dans une seule cage. Le ratio femelle/mâle peut être aussi bas que 1 mâle pour 3 femelles. Laissez les adultes s’accoupler pendant 4 à 5 jours et fournissez aux femelles un repas de sang.REMARQUE: Le sang nourrit et recueille les œufs des femelles G0 plusieurs fois pour maximiser les chances d’obtenir des transformants de plusieurs cycles gonotrophes. Le sang nourrit les individus WT en même temps pour le croisement. Ramassez les œufs et élevez les G1 émergents de la prochaine génération. Dépister les larves G1 L3-L4 pour une fluorescence appropriée afin d’identifier les transformants. Recueillir les larves dans une boîte de Pétri tapissée de papier filtre ou sur une lame de microscope et l’écran à l’aide d’un stéréoscope fluorescent avec des filtres appropriés pour la présence du marqueur introduit avec la cargaison étiquetée attB.REMARQUE: La fluorescence entraînée par le promoteur 3xP3 est visible à tous les stades postmbryoniques et le dépistage peut être effectué sur des larves plus jeunes, mais celles-ci sont plus fragiles et doivent être manipulées relativement soigneusement. Les nymphes peuvent également être dépistées. Pour les conceptions à un seul attB pour l’écran d’intégration pour la présence du marqueur nouveau et préexistant; ils doivent tous deux être présents puisque la nouvelle cassette est insérée à côté de l’originale (Figure 3A, Figure 4). REMARQUE : Exception de filtrage pour les conceptions à un seul attB : lorsque vous utilisez des lignes d’ancrage sans marqueur22, écran pour la présence du nouveau marqueur uniquement. Lors de l’utilisation de lignes d’accueil où l’intégration entraîne l’inactivation du marqueur préexistant21, écran pour la présence du nouveau marqueur et la perte du marqueur préexistant. Pour les conceptions à double attB pour RMCE, l’écran de présence du nouveau marqueur et la perte du marqueur préexistant, seul le marqueur nouvellement introduit doit être présent puisque la nouvelle cassette remplace l’original (Figure 3B, Figure 5).REMARQUE: Des événements d’intégration occasionnels peuvent être récupérés dans les expériences RMCE où un seul attP se recombina et donc les deux marqueurs seront présents. Le dépistage des individus G1 peut également être effectué au stade de la nymphe en suivant la même procédure52. Transférer les individus G1 transformés en un plateau larvaire et les ramener aux nymphes. Éliminez les individus non fluorescents et les individus ayant un modèle d’expression de marqueur inattendu. Triez les nymphes G1 transformées par sexe et croisez-les en masse avec des individus WT de sexe opposé appariés à l’âge. Permettez aux adultes de s’accoupler pendant 4 à 5 jours, de fournir un repas de sang, de recueillir les œufs et d’élever la progéniture G2 de la prochaine génération. Pour les expériences d’intégration unique, collectez les œufs directement à partir de la croix en masse car le site d’intégration est identique chez tous les individus. Pour les expériences RMCE, prélever des œufs de femelles individuelles et maintenir la progéniture séparément jusqu’à ce que l’évaluation moléculaire soit terminée en raison de la présence potentielle de deux orientations de cassette alternatives (Figure 3B). Dépister la descendance G2 (au stade larvaire ou nymphe) pour détecter la présence du marqueur fluorescent (50 % des individus devraient être positifs), jeter la progéniture non fluorescente. Mettez de côté un sous-ensemble d’individus G2 positifs pour l’analyse moléculaire, élevez le reste à l’âge adulte.REMARQUE: Si tous les individus G2 doivent être maintenus en vie, une analyse moléculaire peut être effectuée sur les empreintes d’un seul adulte46 ou des extractions d’ADN de cas nymphal (communication personnelle de L. Grigoraki). Alternativement, l’analyse moléculaire peut être effectuée après que tous les individus G2 ont ovipositif et que les œufs ont éclos. Permettre aux mâles et aux femelles adultes de s’intercroiser dans la même cage pour établir la nouvelle lignée transgénique.REMARQUE: Pour les expériences RMCE, l’intercroision adulte doit se produire entre frères et sœurs dérivant d’une seule femelle jusqu’à ce que l’orientation de l’insertion soit déterminée par analyse moléculaire. 5. Validation moléculaire du site d’insertion par amplification de l’ADN (PCR) Préparer une carte du site d’insertion prévu dans le génome de la ligne d’amarrage après la transformation. Intégration unique : S’assurer que le site d’insertion prévu porte la construction d’amarrage d’origine plus toute la séquence du plasmide donneur entre les deux sites hybrides attL et attR (Figure 3A). RMCE : Assurez-vous que le site d’insertion prévu est identique à celui de la ligne d’accueil où les sites attL inversés hybrides remplacent les sites attP inversés d’origine et le modèle d’échange remplace la cassette initialement présente entre eux (Figure 3B). Concevoir des amorces d’oligonucléotides pour amplifier la jonction d’insertion de chaque côté du locus d’intégration. Intégration unique : Concevoir des paires d’amorces d’oligonucléotides qui s’étendent sur les sites attR et/ou attL . Un amorce doit se lier à la construction d’amarrage précédemment intégrée et l’autre au transgène nouvellement intégré (Figure 3A). RMCE: Le remplacement de la cassette peut se produire dans deux orientations différentes par rapport au chromosome (désigné A et B). Concevoir d’autres combinaisons de 4 amorces d’oligonucléotides pour donner un produit discret dans une seule des orientations, une paire étant diagnostique pour l’orientation A et l’autre pour l’orientation B (Figure 3B, Figure 6). Extraire l’ADN génomique d’individus G2 positifs et effectuer la PCR diagnostique et l’électrophorèse sur gel pour visualiser la présence d’amplicons diagnostiques attendus à partir des cartes de site d’intégration prévues.REMARQUE: L’ADN peut également être extrait des jambes d’un seul adulte46 ou des cas nymphaux (communication personnelle de L. Grigoraki). Séquencer les produits de PCR pour confirmer les séquences attendues. Graphique 2. Diagramme de flux de travail pour la modification du génome φC31 dirigée par le site chez les moustiques anophèles . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 3. Base moléculaire de l’intégration unique médiée par φC31 (A) et RMCE (B). A) Cartes schématiques de l’insertion génomique dans une ligne d’amarrage d’An. stephensi (80,9, tableau 1) portant un seul site attP et marquée d’une CFP (en haut), d’un plasmide donneur de conception à attB unique marqué de DsRed (au milieu) et du site d’insertion attendu résultant d’une intégration réussie (en bas). B) Cartes schématiques de l’insertion génomique dans une ligne d’amarrage d’An. gambiae (A11, tableau 1) portant deux sites attP inversés et marqués avec CFP (en haut), un plasmide donneur de conception double attB marqué avec YFP (au milieu), et le site d’insertion attendu résultant d’un RMCE réussi (en bas). Ligne ondulée: génome de moustique; Flèches rayées: bras de transposon piggyBac; 3xP3 : promoteur du marqueur fluorescent ; SV40: terminateur viral; Ori : origine de la réplication ; AmpR : gène de résistance à l’ampicilline. Les lignes de croisement représentent le(s) site(s) de recombinaison entre les sites attP et attB. Les flèches noires numérotées représentent les sites de liaison de l’amorce pour la validation moléculaire du locus d’insertion (étape 5 du protocole). Des plasmides simples et doubles marqués attB entièrement annotés sont disponibles auprès des auteurs sur demande. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Le protocole illustré ici permet de générer une lignée transgénique Anopheles stable en ~ 10 semaines (en supposant un cycle de vie de moustique de 21 jours). Les taux d’éclosion des larves post-injection chez An. gambiae devraient être généralement inférieurs à ceux d’An. stephensi, mais des taux d’éclosion compris entre 10 et 50 % ont été signalés9,20,24,26,33,43,47. Avec une technique d’injection appropriée, des taux d’éclosion de ≥20% sont généralement suffisants pour produire des transformants. L’absorption de l’ADN par les embryons peut être évaluée en criblant les jeunes larves pour l’expression transitoire du marqueur fluorescent. Dans des expériences RMCE réussies à An. gambiae utilisant le promoteur 3xP3, jusqu’à 50% des larves G0 survivantes ont montré une expression épisomique du marqueur dans les papilles anales48. Les estimations généralisées de l’efficacité de la transformation sont difficiles à évaluer entre les laboratoires et même parmi les expériences, car la transformation dépend d’une interaction complexe de variables, notamment la pureté, la concentration, la taille et la toxicité potentielle de l’ADN injecté, la qualité des œufs, la manipulation des œufs avant et après injection, l’élevage des moustiques et, surtout, l’expérience de l’opérateur. Des taux de transformation allant jusqu’à 7% ont été obtenus pour RMCE en An. gambiae (calculés comme le nombre d’événements de transformation indépendants dans le total des individus G0)9,26,33, et jusqu’à 2,2% de taux de transformation pour l’intégration dans An. stephensi. Nous suggérons d’injecter au moins 500 embryons, ce qui devrait conduire à l’éclosion d’au moins 100 larves de G0 et à 2 à 7 fondateurs adultes G0 à partir desquels une progéniture transformée de manière stable peut être obtenue. En cas de dépistage de l’expression transitoire chez les larves de G0, on peut s’attendre à ce que jusqu’à 40 larves positives soient détectées. Des exemples de validation phénotypique de la transformation via le criblage de marqueurs fluorescents régulés par le promoteur 3xP3 sont présentés à la figure 4 et à la figure 5. La figure 4 montre une nouvelle ligne d’An. stephensi obtenue par insertion d’une cassette marquée DsRed dans une ligne d’accueil marquée CFP (80.9, tableau 1), ce qui donne une descendance G1 exprimant les deux marqueurs comme indiqué par la fluorescence rouge et bleue détectée dans les yeux. On s’attend plutôt à ce que les conceptions RMCE entraînent le remplacement du marqueur inséré à l’origine dans la ligne d’amarrage par celui du plasmide donneur. La figure 5A et la figure B illustrent cet échange de marqueurs dans une ligne d’amarrage An. gambiae marquée avec CFP (A11, tableau 1) où, après un RMCE réussi, le marqueur CFP est perdu et le marqueur YFP est acquis, ce qui entraîne une fluorescence jaune (mais pas bleue) des yeux et du cordon nerveux33. Parfois, le RMCE peut entraîner un seul événement d’intégration au lieu de l’échange de la cassette transgénique souhaitée, comme illustré à la figure 5C, où une larve marquée à la fois avec la CFP d’origine et les nouveaux marqueurs YFP est montrée. Il est rapporté que jusqu’à 50 % du nombre total d’événements de transformation sont des intégrations uniques9,33. Lors du dépistage de la présence d’un marqueur fluorescent, il est crucial de distinguer son signal d’une éventuelle autofluorescence de fond. Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation de la PCP, car les larves d’anophèles présentent une autofluorescence bleue naturelle (figure 6A). Il est nécessaire d’augmenter le grossissement et de se concentrer sur les tissus et les organes où la fluorescence devrait être entraînée par le promoteur pour identifier les véritables individus positifs à la CFP, comme illustré à la figure 6B , à l’aide du marqueur 3xP3-CFP. Les transformants individuels sont finalement évalués moléculairement par PCR pour confirmer le site d’insertion attendu. La figure 7 rend compte de la validation par PCR chez des individus d’une lignée d’échange An. gambiae montrant les deux orientations potentielles d’insertion dans le génome du moustique33. Graphique 4. Validation de l’intégration unique de φC31 chez les larves d’An. stephensi (vue dorsale). A) La ligne d’amarrage (80.9, tableau 1) exprime la PCP aux yeux sous la réglementation du promoteur 3xP3 . B) Une intégration réussie se traduit par l’expression du DsRed nouvellement acquis ainsi que du marqueur CFP d’origine dans les yeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 5. Validation de φC31 RMCE chez les larves d’An. gambiae (vue ventrale). A) La ligne d’amarrage (A10, tableau 1) exprime la PCP sous la régulation du promoteur 3xP3 dans les yeux (e) et le cordon nerveux (nc)5. B) Le succès du RMCE entraîne l’échange de marqueurs fluorescents de CFP à YFP33. C) Un seul événement d’intégration s’est produit au cours de l’expérience RMCE où la larve transformante exprime à la fois les marqueurs CFP et YFP. Cette larve porte des composants GAL4 / UAS qui provoquent un large modèle d’expression de YFP, particulièrement fort dans les muscles abdominaux (am). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 6. Autofluorescence de la PCF chez les larves d’An. gambiae (vue dorsale). A) Image côte à côte d’une larve L4 positive (CFP+) et négative (CFP-) à l’aide du filtre CFP. B) Image en gros plan des yeux larvaires qui révèle un individu CFP+ vs CFP-. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 7. Validation moléculaire de l’orientation de l’insertion de cassettes dans l’An. gambiae transgénique représentatif créée par φC31 RMCE. La cassette transgénique peut être insérée dans l’une des deux orientations alternatives (A ou B) par rapport au site d’insertion. Chaque réaction PCR (I – IV) utilise une combinaison d’amorces (5-8)33 conçues pour donner un fragment d’amplification diagnostique pour chaque orientation comme indiqué dans les cartes plasmidiques schématiques. T1: orientation de transport individuelle transgénique représentative de l’insertion A; T2: orientation de transport individuelle transgénique représentative de l’insertion B; WT: type sauvage; DL: ligne d’accueil; -: contrôle négatif de la réaction où l’eau a été utilisée comme modèle. Ce chiffre a été modifié par rapport à Adolfi et al. (2019)33. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Espèce Filtrer Nom attP(s) Chromo-certains Marqueur promoteur Institution d’origine Référence An. stephensi Indiana 26.10b Célibataire 2R 3xP3-eCFP Université de Californie Irvine 25 An. stephensi Indiana 44Cb Célibataire X 3xP3-eCFP Université de Californie Irvine 23, 24 An. stephensi Indiana 80,9b Célibataire 2L 3xP3-eCFP Université de Californie Irvine Cette étude An. gambie G3 113 Célibataire 2R 3xP3-eCFP Université de Californie Irvine Cette étude An. gambie KIL Ec Célibataire 3R 3xP3-eCFP Keele Univ. 19, 43 An. gambie G3 X1 Célibataire 2L Pas de marqueur Université de Strasbourg 22 An. gambie G3 YAttP Célibataire Y 3xP3-RFP Imperial College Londres 21 An. gambie G3 A10b Double 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 5 An. gambie G3 A11b Double 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 9 un. Souche de l’Université Johns Hopkins (don de M. Jacobs-Lorena) et dans la culture à l’Université de Californie Irvine pour >20 ans. b. Ces lignes sont disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable. c. Cette ligne est disponible dans le dépôt BEI www.beiresources.org sous le nom de MRA-1163. Tableau 1. Anopheles attP docking lines.

Discussion

La conception précise de plasmides marqués attB qui sont compatibles avec la ligne d’amarrage de choix est primordiale pour le succès de l’expérience. Une attention particulière doit être accordée au choix du marqueur utilisé pour le criblage des transformants, y compris la couleur de fluorescence et son motif d’expression, qui sera soumis au motif déjà présent dans la ligne d’amarrage. Il est nécessaire d’utiliser des marqueurs fluorescents qui se distinguent facilement : les bonnes combinaisons de marqueurs comprennent RFP (rouge)/CFP (cyan), RFP (rouge)/GFP (vert), RFP (rouge)/YFP (jaune) et YFP (jaune)/CFP (cyan), tandis que les combinaisons à éviter sont YFP (jaune)/GFP (vert) et CFP (cyan)/GFP (vert). Le promoteur 3xP33^, spécifique aux yeux et au cordon nerveux, est le plus fréquemment utilisé pour stimuler l’expression de marqueurs fluorescents pour la transgénèse des moustiques. En effet, toutes les lignes d’amarrage Anopheles actuellement disponibles utilisent ce promoteur. Les régions régulatrices alternatives sont celles du gène de la polyubiquitine An. gambiae (PUBc)⁵ ou du promoteur viral IE120, qui déterminent l’expression dans plusieurs tissus. Lorsqu’ils sont utilisés avec 3xP3, ces promoteurs élargiraient les combinaisons de couleurs possibles et même l’utilisation du même fluorophore. Les promoteurs indiqués sont actifs tout au long du cycle de vie des moustiques, ce qui permet le dépistage et la surveillance de la fluorescence à tous les stades de la vie. Une considération supplémentaire lors de la conception du plasmide est la taille de la cargaison à intégrer ou à échanger. Bien que le système φC31 ait des capacités de charge ^{remarquables18}, il faut considérer que la taille du plasmide donneur est généralement en corrélation négative avec l’efficacité de la ^{transformation22}.

Dans le protocole décrit, la source d’intégrase est un plasmide auxiliaire exprimant l’enzyme de manière omniprésente40. La présence omniprésente de l’intégrase peut conduire à la transformation des cellules somatiques si les microinjections ne sont pas dirigées avec précision vers la zone où la lignée germinale se forme. Bien que de tels événements de transformation soient perdus car ils ne sont pas héréditaires, les effets somatiques peuvent diminuer la condition physique des individus injectés. Pour éviter cela et augmenter l’efficacité de la transformation, l’expression de l’intégrase peut être limitée à la lignée germinale, par exemple en utilisant le promoteur ^vasa22,26. D’autres protocoles décrivent l’utilisation de l’ARN messager transcrit in vitro (ARNm) comme source d’intégrase φC311119,24,43. Cependant, cela implique la préparation laborieuse de l’ARNm et nécessite une manipulation prudente du mélange d’injection et l’utilisation de réactifs sans RNase pour éviter la dégradation. Les sources plasmidiques d’intégrase ont été démontrées à la fois dans An. gambiae9,21,22,26,33,37 et An. stephensi (communication personnelle A.A.) pour être fiables et conduire à une transformation efficace, et sont donc notre option préférée. Une autre option pour la livraison d’intégrase est sa production in vivo dans des lignes d’assistance auto-amarrées. De telles lignées ont été créées à An. gambiae qui expriment l’intégrase φC31 sous la régulation des nanos promoteurs spécifiques de la lignée germinale et se sont avérées conduire à une amélioration de la survie et de l’efficacité de la ^{transformation20}. Cependant, les charges d’aptitude potentielles imposées par la production in vivo de l’enzyme intégrase sur la ligne d’assistance doivent être prises en compte.

Comme pour les autres techniques transgéniques, un soin particulier doit être réservé à l’élevage et au croisement d’individus issus d’embryons injectés afin de maximiser les chances de récupérer des transformants. Les individus qui ont hérité de manière stable du transgène peuvent d’abord être récupérés à la progéniture _G1. Cependant, les premiers signes de transformation potentielle peuvent être évalués par la présence d’une expression épisomique transitoire du marqueur fluorescent dans les papilles anales et/ou le cordon nerveux des larves du premier et du deuxième stade _G0 lors de l’utilisation du promoteur 3xP343. Bien que la présence d’une fluorescence transitoire suggère une livraison réussie de plasmides, elle ne garantit pas une transformation germinale héréditaire. De même, l’absence d’expression transitoire n’exclut pas une transformation réussie. Néanmoins, il a été observé que les individus transitoirement positifs sont plus susceptibles de produire une progéniture transgénique que les individus transitoirement ^{négatifs43,48}. Entre des mains expertes, l’élevage et le croisement d’individus positifs uniquement peuvent être une option pour réduire le nombre de moustiques. Cependant, compte tenu de l’importance et de la fragilité des petites larves de _G0, le moins de manipulation est encore conseillé et l’élevage de tous les individus de _G0 est toujours recommandé.

Le schéma d’accouplement rapporté dans ce protocole est conçu pour maximiser les chances d’accouplement et pour isoler les événements de transformation indépendants. Cependant, si l’espace insectaire ou la disponibilité du personnel est un problème, les adultes _G0 peuvent être regroupés par sexe dans des cages individuelles si suffisamment d’individus de sexe opposé sont fournis. Une telle configuration ne permettra pas la discrimination entre plusieurs événements de transformation se produisant chez des individus de la même cage. Selon la configuration expérimentale, la présence d’un marqueur double (intégration simple) ou simple (RMCE) est attendue pendant le processus de dépistage. Dans les expériences d’intégration unique, il est important de vérifier la présence du marqueur d’origine de la ligne d’amarrage, tandis que dans RMCE, il est important de vérifier la perte du marqueur précédemment intégré. En effet, il n’est pas rare dans les conceptions RMCE de récupérer des transformants dans lesquels une seule intégration au lieu d’un échange s’est produite en raison de la recombinaison d’un seul site attP9,33. Chez ces personnes, les deux marqueurs fluorescents sont présents ainsi que l’ensemble de l’épine dorsale plasmidique du donneur, ce qui souligne l’importance d’effectuer un dépistage approfondi des deux marqueurs fluorescents.

Alors que la présence de modèles de fluorescence attendus indique une transformation réussie, la caractérisation moléculaire du site d’insertion doit être entreprise. Pour ce faire, la préparation de cartes précises du locus d’insertion prédit, y compris les régions génomiques flanquantes de la ligne d’amarrage, est cruciale pour la conception d’amorces d’oligonucléotides diagnostiques adéquates pour les analyses d’amplification génique. Des événements d’intégration uniques entraînent la formation de sites hybrides attR et attL à la jonction entre l’ADN nouvellement intégré et la cassette précédemment insérée. Ces sites peuvent être ciblés pour la validation des sites d’insertion. Dans les conceptions RMCE, l’insertion de la cassette donneuse peut se produire dans deux orientations alternatives par rapport au locus génomique, de sorte que quatre amorces peuvent être utilisées dans d’autres combinaisons de PCR pour détecter l’orientation de la ligne. Comme l’orientation de l’insertion de la cassette peut affecter l’expression transgénique, dans l’analyse comparative de l’expression génique, il est important d’utiliser des lignes portant la même orientation d’insertion.

Lorsque vous travaillez avec un faible nombre de transformants, il peut ne pas être souhaitable de sacrifier des individus entiers pour l’analyse moléculaire. Une option consiste à effectuer une analyse moléculaire de l’ADN extrait des jambes d’un seul ^adulte46, car la perte de jambes n’affecte pas la capacité d’une femelle adulte à s’accoupler et à ovipositer49. Cependant, il existe un risque d’endommager l’individu dans le processus de retrait de la jambe. Le succès a été obtenu en utilisant des cas de nymphes écartés (communication personnelle de L. Grigoraki), mais l’approche la plus sûre consiste à effectuer une analyse moléculaire sur les parents _G2 après avoir obtenu une progéniture _G3 viable.

Ces dernières années, CRISPR/Cas9 a révolutionné la façon d’effectuer l’édition du génome spécifique au site26,41,50,51. Contrairement au RMCE dirigé par le site, les intégrations géniques médiées par CRISPR/Cas9 (knock-ins) sont indépendantes de la présence de sites de recombinaison pré-insérés avec un seul événement de transformation en une étape nécessaire. Néanmoins, le système CRISPR/Cas9 repose sur la présence de grandes séquences génomiques connues flanquant le site d’insertion souhaité pour une réparation dirigée par homologie réussie ainsi que sur la reconnaissance efficace du site médiée par les ARN guides. Ces conditions ne peuvent pas toujours être remplies ou peuvent être laborieuses à dépanner et, compte tenu de la disponibilité de plusieurs lignes d’amarrage à An. gambiae et An. stephensi et de lignées dérivées de celles-ci, le système φC31 reste un outil très précieux pour effectuer des comparaisons phénotypiques directes entre transgènes aux mêmes emplacements génomiques.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à Kiona Parker (UCI) d’avoir fourni des images de larves transgéniques d’An. stephensi , et à Fraser Colman (LSTM) et Beth Poulton (LSTM) d’avoir fourni des larves transgéniques d’An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) a également fourni une aide précieuse lors de l’imagerie des larves d’An. gambiae . Ce travail a été financé par le Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) et le Director Catalyst Fund du LSTM décerné aux AA (DCF2014AA). A.A.J. est professeur Donald Bren à l’Université de Californie à Irvine.

Materials

1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides	VWR	MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm	Leica	10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm	Leica	10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII	Omega Optical	500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2	Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)	R1181
Stable brush Size 0

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Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-Directed φC31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria. J. Vis. Exp. (168), e62146, doi:10.3791/62146 (2021).

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