التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا
Summary
يصف البروتوكول كيفية تحقيق تعديلات موجهة للموقع في جينوم بعوض ملاريا الأنوفيليس باستخدام نظام φC31 . وتشمل التعديلات الموصوفة كلا من تكامل وتبادل الأشرطة المعدلة وراثيا في جينوم خطوط الالتحام الحاملة ل attP.
Abstract
يعتمد التحليل الجينومي الوظيفي والاستراتيجيات ذات الصلة للمكافحة الجينية للملاريا على طرق معتمدة وقابلة للتكرار لتعديل جينوم بعوض الأنوفيليس بدقة. من بين هذه الطرق ، يسمح نظام φC31 بالتكامل الدقيق والمستقر الموجه نحو الموقع للجينات المحورة ، أو استبدال الكاسيت المعدلة وراثيا المتكاملة عبر تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE). تعتمد هذه الطريقة على عمل البكتيريا العقدية φC31 integrase لتحفيز إعادة التركيب بين موقعين محددين للتعلق المعينين attP (المشتقين من العاثية) و attB (المشتق من البكتيريا المضيفة). يستخدم النظام موقعا أو موقعين من مواقع attP التي تم دمجها سابقا في جينوم البعوض وموقع (مواقع) attB في الحمض النووي لقالب المانح. نوضح هنا كيفية تعديل جينوم خطوط التحام الأنوفيلة الحاملة ل attP بشكل ثابت باستخدام اثنين من البلازميدات: متبرع يحمل علامة attB يحمل قالب التكامل أو التبادل وبلازميد مساعد يشفر تكامل φC31 integrase. لقد أبلغنا عن نتيجتين تمثيليتين للتعديل الموجه بوساطة φC31: التكامل الفردي لكاسيت معدل وراثيا في An. Stephensi و RMCE في البعوض An. gambiae. يوفر التلاعب بالجينوم بوساطة φC31 ميزة التعبير الجيني العابر القابل للتكرار من مواقع الجينوم المحايدة التي تم التحقق من صحتها ، مما يسمح بإجراء تحليلات نوعية وكمية مقارنة للأنماط الظاهرية. كما أن طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع تبسط إلى حد كبير التحقق من صحة موقع الإدراج الفردي ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. هذه الخصائص وغيرها تجعل من نظام φC31 مكونا أساسيا في مجموعة الأدوات الجينية للتلاعب المعدل وراثيا ببعوض الملاريا وغيره من نواقل الحشرات.
Introduction
وقد عززت القدرة على تعديل جينوم نواقل البعوض للأمراض بشكل موثوق وقابل للتكرار التحقق الوظيفي للجينات في الجسم الحي وفتحت الأبواب أمام استراتيجيات قابلة للتحقيق لمكافحة النواقل الوراثية، مثل تلك التي تستهدف بعوض الأنوفيليس الذي ينقل الملاريا1.
اعتمد تحرير جينوم البعوض المبكر فقط على التحول بوساطة العناصر القابلة للتحويل (TE) ، مع كون piggyBac هو الترانسبوزون الأكثر استخداما في Anopheles2,3,4. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي الطبيعة العشوائية لتكامل TE إلى تعديلات غير مرغوب فيها مثل الضربات القاضية الجينية (الطفرات الإدراجية) وتأثيرات الموضع الكبيرة على التعبير الجيني المتغير5،6،7،8. عمليات الإدراج المتعددة هي أيضا أمر شائع الحدوث عند استخدام piggyBac5,9 ، مما يجعل التحقق من صحة وعزل الخطوط المعدلة وراثيا مع عمليات الإدخال الفردية شاقة. وتشمل العيوب الأخرى إعادة تعبئتها المحتملة ، كما لوحظ في الخط الجرثومي ل Anopheles stephensi عند توفير مصدر ل piggyBac transposase10,11,12 ، وحجمها المحدود من شحنات الحمض النووي (10-15 كيلو بايت في الطول) مع انخفاض كفاءة التحول مع زيادة حجم البلازميد المانح 13,14.
تم إدخال نهج التكامل الموجهة نحو الموقع للتحايل على هذه القضايا. تعديل الجينوم الأكثر شيوعا الموجه للموقع في البعوض هو ذلك الذي يتوسط فيه نظام φC31 (الشكل 1 أ). ويعزى ذلك إلى التكاملات الفيروسية التي تحفز إعادة التركيب بين موقعين مرتبطين غير متجانسين (att) يحدثان بشكل طبيعي في جينوم البكتيريا φC31 (attP) وفي مضيف بكتيريا العقدية (attB)15. إعادة تركيب الموقعين أحادية الاتجاه وتؤدي إلى تكوين مواقع هجينة (attL و attR). إن إعادة تركيب مثل هذه المواقع الهجينة (التي تؤدي إلى استئصال الحمض النووي) لن تتطلب فقط وجود إنتيغراز فيروسي نشط ولكن أيضا عامل إعادة تركيب آخر مشفر بالعاثيات16,17. وهكذا ينشأ موقع تكامل مستقر يخفف من مسألة احتمال إعادة التعبئة غير المرغوب فيها(15). علاوة على ذلك ، يسمح النظام بدمج الشحنات الكبيرة (على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن تكامل هياكل > 100 كيلو بايت في D. melanogaster18) ، مما يزيد بشكل كبير من القدرات الاستيعابية. يحدث التكامل في موضع جينومي واحد محدد مسبقا مما يبسط إلى حد كبير التحقق من صحة الإدخال ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. وأخيرا، تسمح طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع بتطبيع التعبير حيث توجد الجينات المحورة البديلة في نفس الموضع وبالتالي يتم تنظيمها في نفس السياق الجينومي المجاور. في الواقع ، أحد التطبيقات الرئيسية لهذه التقنية هو المقارنة المباشرة للأنماط الظاهرية التي تمنحها الجينات المحورة المختلفة بعد إدخالها في موضع مماثل.
ينطوي تحقيق التكامل بوساطة φC31 على مرحلتين: المرحلة الأولى هي إنشاء خطوط إرساء معدلة وراثيا تحمل موقع (مواقع) attP، والمرحلة الثانية هي التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB في جينوم خط الالتحام 19. اعتمد إنشاء خطوط الالتحام في المرحلة الأولى على التكامل العشوائي بوساطة TE للتركيبات الموسومة بعلامة attP ، وبالتالي تضمن عملية شاقة أولية (بما في ذلك اللطخة الجنوبية وتحليلات PCR العكسية على ذرية أنثى واحدة) لعزل والتحقق من صحة الخطوط المعدلة وراثيا التي تحمل حدث تكامل واحد في مواقع جينومية فريدة ونشطة نسخيا ومحايدة للياقة البدنية. ومع ذلك ، تم تطوير العديد من خطوط الالتحام للتكامل الفردي بوساطة φC31 والتحقق من صحتها في An. gambiae19,20,21,22 وفي An. stephensi23,24,25 (الجدول 1). يختلف كل من هذه الخطوط من حيث الموقع الجينومي لموقع الالتحام والخلفية الجينية الخاصة بالسلالة ويمكن من خلالها إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا الجديدة. يمكن الآن التحايل على التحقق المعقد من عمليات التكامل بوساطة TE لإنتاج خطوط الإرساء بواسطة تقنية CRISPR/Cas926؛ ومع ذلك ، يعتمد هذا على المعرفة المسبقة بالمواقع المحايدة التي سيتم استهدافها والتسلسلات المحيطة بها.
تم تطبيق التكامل بوساطة φC31 على نطاق واسع لتحرير جينوم الحشرات من الكائن الحي النموذجي D. melanogaster27 ، إلى البعوض Aedes aegypti13,28 ، Ae. albopictus29 ، An. gambiae19 ، و An. stephensi24 ، بالإضافة إلى الحشرات الأخرى بما في ذلك Ceratitis capitata30 و Bombyx mori31.
ومن القيود المفروضة على التكامل بوساطة φC31، لا سيما بالنظر إلى الإطلاقات الميدانية المحتملة لمكافحة النواقل، التكامل في جينوم البعوض لكامل البلازميد المانح الحامل ل attB، بما في ذلك التسلسلات غير المرغوب فيها مثل العلامات الجينية المقاومة للمضادات الحيوية ومكونات العمود الفقري للبلازميد ذات الأصل البكتيري. ولمعالجة ذلك، تم تنفيذ تعديل للنظام القياسي، وهو تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE)، الذي يسمح بالاستعاضة الدقيقة عن كاسيت معدل وراثيا كان متكاملا سابقا بحمض نووي جديد للمتبرع (الشكل 1 ب). ويتحقق ذلك باستخدام موقعين مقلوبين يحيطان بأشرطة الكاسيت المانحة والمتلقية في كل طرف، مما يدفع حدثين مستقلين لإعادة التركيب يحدثان في وقت واحد مما يؤدي إلى تبادل الكاسيت دون تكامل العمود الفقري للبلازميد. هذا التصميم المحسن يتحايل على تكامل التسلسلات غير المرغوب فيها ويوسع نطاق تطبيق أنظمة φC31 لتشمل على سبيل المثال تكامل شحنات الحمض النووي غير المميزة عن طريق فحص فقدان علامة الفلورسنت المدمجة سابقا32.
تم تحقيق RMCE أولا مع D. melanogaster32 وتم تطبيقه لاحقا بنجاح على الحشرات غير النموذجية بما في ذلك An. gambiae9,26,33 و Ae. aegypti34 و Plutella xylostella34 و B. mori35. تم تطوير العديد من خطوط الإرساء ل RMCE والتحقق من صحتها في An. gambiae5,9,26 (الجدول 1). على حد علمنا ، لم يتم استكشاف RMCE بعد في أنواع ناقلات الأنوفيلة الأخرى.
حتى الآن، تم استخدام نظام φC31 على نطاق واسع في بعوض الأنوفيليس لإدخال ودراسة مجموعة متنوعة من الجزيئات بما في ذلك المستجيبات المضادة للملاريا19،24،36، ومكونات نظام GAL4/UAS للمبالغة في التعبير عن الجينات وتدميرها لدراسات مقاومة المبيدات الحشرية9،33، والعناصر التنظيمية، والجينات المراسلة5،21،37، وعناصر محرك الجينات26 ، 38.
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء 1) التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB و 2) RMCE لمبنى محاط بمواقع attB مقلوبة في جينوم خطوط التحام Anopheles . ويتحقق ذلك باستخدام اثنين من البلازميدات: بلازميد المتبرع الموسوم بعلامة attB الذي يحمل الجين المتحول محل الاهتمام ، والبلازميد المساعد الذي يعبر عن تكامل φC31 . وتستخدم نواقل الملاريا الرئيسية An. gambiae و An. stephensi كأمثلة محددة، ومع ذلك فإن هذه البروتوكولات تنطبق على أنواع الأنوفيلة الأخرى.
الشكل 1. تعديلات الجينوم الموجهة للموقع ، والتكامل الفردي وتبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE) ، باستخدام نظام φC31. يحفز تكامل φC31 (INT ، سهم مزدوج رمادي) إعادة التركيب بين موقع (مواقع) attB (مخطط أرجواني) موجود في بلازميد مانح وموقع (مواقع) attP (مخطط أزرق) موجود في خط الالتحام المتلقي ، مما يؤدي إلى تكوين مواقع هجينة attL و attR. أ) يتحقق التكامل عندما يتم إعادة دمج مواقع attB و attP المفردة وينتج عنها وجود علامتين متكاملتين (الأزرق والأحمر). ب) يحدث RMCE عندما يعاد دمج موقعين attB / P في وقت واحد ويؤدي إلى استبدال الكاسيت بين مواقع att لخط الالتحام (العلامة الزرقاء) بتلك التي يحملها البلازميد المانح (العلامة الحمراء). ج) تسلسلات النيوكليوتيدات الجزئية ل attP (الأزرق) و attB (الأرجواني) والمواقع الهجينة attL / R. تحدث إعادة التركيب بين التسلسلات الأساسية “TT” المميزة باللون الأسود الغامق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التصميم الدقيق للبلازميدات الموسومة بعلامة attB المتوافقة مع خط الإرساء المفضل أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. يجب النظر بعناية في اختيار العلامة المستخدمة لفحص المحولات ، بما في ذلك لون التألق ونمط تعبيره ، والذي سيخضع للنمط الموجود بالفعل في خط الالتحام. من الضروري استخدام علامات الفلورسنت التي يمكن تمييزها بسهولة: تشمل مجموعات العلامات الجيدة RFP (أحمر) / CFP (سماوي) ، RFP (أحمر) / GFP (أخضر) ، RFP (أحمر) / YFP (أصفر) ، و YFP (أصفر) / CFP (سماوي) ، في حين أن المجموعات التي يجب تجنبها هي YFP (أصفر) / GFP (أخضر) و CFP (سماوي) / GFP (أخضر). يعد المروج 3xP39 ، الخاص بالعينين والحبل العصبي ، هو الأكثر استخداما لدفع التعبير عن علامات الفلورسنت لتكوين البعوض. في الواقع ، تستخدم جميع خطوط إرساء Anopheles المتاحة حاليا هذا المروج. المناطق التنظيمية البديلة هي تلك الخاصة بجين An. gambiae polyubiquitin (PUBc)5 أو المروج الفيروسي IE120 ، الذي يدفع التعبير في أنسجة متعددة. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع 3xP3 ، فإن هؤلاء المروجين سيوسعون مجموعات الألوان المحتملة وحتى استخدام نفس الفلوروفور. ينشط المروجون المشار إليهم طوال دورة حياة البعوض مما يسمح بالفحص ومراقبة التألق في جميع مراحل الحياة. هناك اعتبار إضافي أثناء تصميم البلازميد وهو حجم الشحنة المراد دمجها أو تبادلها. في حين أن نظام φC31 لديه قدرات حمل ملحوظة18 ، ينبغي اعتبار أن حجم البلازميد المانح يرتبط بشكل سلبي بشكل عام بكفاءة التحول22.
في البروتوكول الموصوف ، مصدر integrase هو بلازميد مساعد يعبر عن الإنزيم في كل مكان40. قد يؤدي وجود التكاملات في كل مكان إلى تحول الخلايا الجسدية إذا لم يتم توجيه الحقن المجهري بدقة إلى المنطقة التي يتشكل فيها الخط الجرثومي. في حين أن أحداث التحول هذه ستفقد لأنها غير قابلة للتوريث ، فإن التأثيرات الجسدية يمكن أن تقلل من لياقة الأفراد الذين يتم حقنهم. لتجنب ذلك وزيادة كفاءة التحول، يمكن أن يقتصر تعبير integrase على الخط الجرثومي، على سبيل المثال باستخدام مروج vasa22,26. تصف بروتوكولات أخرى استخدام الحمض النووي الريبي الرسولي المنسوخ في المختبر (mRNA) كمصدر ل φC31 integrase19,24,43. ومع ذلك ، فإن هذا ينطوي على إعداد شاق للحمض النووي الريبوزي المرسال ويتطلب معالجة دقيقة لمزيج الحقن واستخدام الكواشف الخالية من RNase لتجنب التدهور. وقد ثبت أن مصادر البلازميد للتكامل في كل من An. gambiae9,21,22,26,33,37 و An. Stephensi (A.A. التواصل الشخصي) موثوقة وتؤدي إلى تحول فعال ، وبالتالي فهي خيارنا المفضل. خيار آخر لتسليم integrase هو إنتاجه في الجسم الحي في خطوط مساعدة ذاتية الالتحام. تم إنشاء مثل هذه الخطوط في An. gambiae التي تعبر عن تكامل φC31 تحت تنظيم nanos المروج الخاص بالخط الجرثومي ووجد أنها تؤدي إلى تحسين كفاءة البقاء على قيد الحياة والتحول20. ومع ذلك ، يجب النظر في أحمال اللياقة البدنية المحتملة التي يفرضها الإنتاج في الجسم الحي لإنزيم integrase على خط المساعدة.
وكما هو الحال مع التقنيات المعدلة وراثيا الأخرى، يجب إيلاء عناية خاصة لتربية وعبور الأفراد المشتقين من الأجنة المحقونة لزيادة فرص استعادة المحولات إلى أقصى حد. يمكن أولا استرداد الأفراد الذين ورثوا الجين المحور بثبات في ذرية G1. ومع ذلك ، يمكن تقييم العلامات المبكرة للتحول المحتمل من خلال وجود تعبير عرضي عابر لعلامة الفلورسنت في الحليمات الشرجية و / أو الحبل العصبي ليرقات G0 الأولى والثانية عند استخدام مروج 3xP343. في حين أن وجود التألق العابر يشير إلى نجاح توصيل البلازميد ، إلا أنه لا يضمن تحول الخط الجرثومي الوراثي. وبالمثل ، فإن عدم وجود تعبير عابر لا يستبعد التحول الناجح. ومع ذلك ، فقد لوحظ أن الأفراد الإيجابيين بشكل عابر هم أكثر عرضة لإنتاج ذرية معدلة وراثيا مقارنة بالأفراد السلبيين العابرين 43,48. في أيدي الخبراء ، قد تكون تربية وعبور الأفراد الإيجابيين فقط خيارا لتقليل أعداد البعوض. ومع ذلك ، نظرا لأهمية وهشاشة يرقات G0 الصغيرة ، لا يزال من المستحسن أقل قدر من التلاعب ويوصى دائما بتربية جميع أفراد G0.
تم تصميم مخطط التزاوج المبلغ عنه في هذا البروتوكول لزيادة فرصة التزاوج إلى أقصى حد وعزل أحداث التحول المستقلة. ومع ذلك ، إذا كانت المساحة الحشرية أو توافر الموظفين يمثل مشكلة ، فيمكن تجميع البالغين G0 حسب الجنس في أقفاص واحدة إذا تم توفير عدد كاف من الأفراد من الجنس الآخر. مثل هذا الإعداد لن يسمح بالتمييز بين أحداث التحول المتعددة التي تحدث في الأفراد من نفس القفص. اعتمادا على الإعداد التجريبي ، من المتوقع وجود علامة مزدوجة (تكامل فردي) أو واحدة (RMCE) أثناء عملية الفحص. في تجارب التكامل الفردي ، من المهم التحقق من وجود العلامة الأصلية من خط الإرساء ، بينما في RMCE من المهم التحقق من فقدان العلامة المدمجة سابقا. في الواقع ، ليس من غير المألوف في تصميمات RMCE استعادة المحولات التي حدث فيها تكامل واحد بدلا من التبادل بسبب إعادة تركيب موقع attP واحد9,33. في مثل هؤلاء الأفراد ، توجد علامات الفلورسنت بالإضافة إلى العمود الفقري البلازميد الكامل للمتبرع الذي يسلط الضوء على أهمية إجراء فحص شامل لكل من علامات الفلورسنت.
في حين أن وجود أنماط التألق المتوقعة يشير إلى التحول الناجح ، يجب إجراء التوصيف الجزيئي لموقع الإدراج. وللقيام بذلك، يعد إعداد خرائط دقيقة لموضع الإدخال المتوقع، بما في ذلك المناطق الجينومية المحيطة بخط الالتحام، أمرا بالغ الأهمية لتصميم أوليغونوكليوتيد أوليغونوكليوتيد تشخيصي كاف لتحليلات تضخيم الجينات. تؤدي أحداث التكامل الفردي إلى تكوين مواقع هجينة attR و attL عند التقاطع بين الحمض النووي المدمج حديثا والكاسيت الذي تم إدخاله مسبقا. يمكن استهداف هذه المواقع للتحقق من صحة موقع الإدراج. في تصاميم RMCE ، يمكن أن يحدث إدخال كاسيت المتبرع في اتجاهين بديلين فيما يتعلق بالموضع الجينومي ، وبالتالي يمكن استخدام أربعة اشعال في مجموعات PCR بديلة للكشف عن الاتجاه الذي يحمله الخط. نظرا لأن اتجاه إدخال الكاسيت قد يؤثر على التعبير الجيني العابر ، في تحليل التعبير الجيني المقارن ، من المهم استخدام خطوط تحمل نفس اتجاه الإدراج.
عند العمل مع أعداد منخفضة من المحولات ، قد لا يكون من المستحسن التضحية بأفراد كاملين من أجل التحليل الجزيئي. ويتمثل أحد الخيارات في ذلك في إجراء تحليل جزيئي على الحمض النووي المستخرج من أرجل شخص بالغ واحد46 لأن فقدان الساق لا يؤثر على قدرة الأنثى البالغة على التزاوج والبيض49. ومع ذلك ، هناك خطر من إتلاف الفرد في عملية إزالة الساق. تم الحصول على النجاح باستخدام حالات العذراء المهملة (L. Grigoraki التواصل الشخصي) ، ولكن النهج الأكثر أمانا هو إجراء التحليل الجزيئي على الآباء G2 بعد الحصول على ذرية G3 قابلة للحياة.
في السنوات الأخيرة، أحدثت تقنية كريسبر/كاس9 ثورة في طريقة إجراء تحرير الجينوم الخاص بالموقع26,41,50,51. على عكس RMCE الموجهة للموقع ، فإن عمليات تكامل الجينات بوساطة CRISPR / Cas9 (طرق الاختراق) مستقلة عن وجود مواقع إعادة التركيب المدرجة مسبقا مع حدث تحويل من خطوة واحدة فقط مطلوبة. ومع ذلك، يعتمد نظام كريسبر/كاس9 على وجود تسلسلات جينومية كبيرة معروفة تحيط بموقع الإدخال المطلوب للإصلاح الموجه بالتماثل الناجح، وكذلك على التعرف الفعال على الموقع بوساطة الحمض النووي الريبي المرشد. لا يمكن دائما استيفاء هذه الشروط أو قد تكون شاقة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وبالنظر إلى توفر خطوط التحام متعددة في An. gambiae و An. Stephensi والخطوط المشتقة منها ، يظل نظام φC31 أداة قيمة للغاية لإجراء مقارنات مباشرة بين الأنماط الظاهرية بين الجينات المحورة في نفس المواقع الجينومية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لكيونا باركر (UCI) لتقديمها صورا ليرقات An. Stephensi المعدلة وراثيا ، ولفريزر كولمان (LSTM) وبيث بولتون (LSTM) لتوفير يرقات An. gambiae المعدلة وراثيا. كما قدمت بيث بولتون (LSTM) مساعدة ثمينة أثناء تصوير يرقات الغامبيا . تم تمويل هذا العمل من قبل معهد تاتا لعلم الوراثة والمجتمع (TIGS) وصندوق محفز مدير LSTM الممنوح ل A.A. (DCF2014AA). A.A.J. هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين.
Materials
| 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| 8-well microslides | VWR | MARI1216690 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | |||
| Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm | Leica | 10446363 | |
| Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm | Leica | 10447079 | |
| Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII | Omega Optical | 500QM25, 500QM35 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Petri dishes | |||
| Potassium chloride | |||
| Sodium Chloride | |||
| Sodium phosphate dibasic | |||
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | R1181 | |
| Stable brush Size 0 |
References
- Adolfi, A., Lycett, G. J. Opening the toolkit for genetic analysis and control of Anopheles mosquito vectors. Current Opinion in Insect Science. 30, 8-18 (2018).
- Grossman, G. L., Rafferty, C. S., Clayton, J. R., Stevens, T. K., Mukabayire, O., Benedict, M. Q. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 10 (6), 597-604 (2001).
- Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. Journal of Biological Chemistry. 277 (11), 8759-8762 (2002).
- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Molecular Biology. 11 (4), 291-297 (2002).
- Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
- Carballar-Lejarazú, R., Jasinskiene, N., James, A. Exogenous gypsy insulator sequences modulate transgene expression in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7176-7181 (2013).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
- Nolan, T., Petris, E., Müller, H. M., Cronin, A., Catteruccia, F., Crisanti, A. Analysis of two novel midgut-specific promoters driving transgene expression in Anopheles stephensi mosquitoes. PLoS ONE. 6 (2), 16471 (2011).
- Lynd, A., Balabanidou, V., Vontas, J., Lycett, G. J. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: appliction to cuticular hydrocarbon synthesis. BioRxiv. , (2019).
- O’Brochta, D. A., Alford, R. T., Pilitt, K. L., Aluvihare, C. U., Harrell, R. A., Harrell, R. A. piggyBac transposon remobilization and enhancer detection in Anopheles mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16339-16344 (2011).
- O’Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based enhancer-trapping in the malaria mosquito Anopheles stephensi. G3. 2 (11), 1305-1315 (2012).
- Macias, V. M., et al. nanos-Driven expression of piggyBac transposase induces mobilization of a synthetic autonomous transposon in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 87, 81-89 (2017).
- Nimmo, D. D., Alphey, L., Meredith, J. M., Eggleston, P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome. Insect Molecular Biology. 15 (2), 129-136 (2006).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: Versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354, 301-309 (2011).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. M. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5505-5510 (1998).
- Khaleel, T., Younger, E., Mcewan, A. R., Varghese, A. S., Smith, M. C. M. A phage protein that binds φC31 integrase to switch its directionality. Molecular Microbiology. 80 (6), 1450-1463 (2011).
- Farruggio, A. P., Chavez, C. L., Mikell, C. L., Calos, M. P. Efficient reversal of phiC31 integrase recombination in mammalian cells. Biotechnology Journal. 7 (11), 1332-1336 (2012).
- Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS ONE. 6 (1), 14587 (2011).
- Meredith, J. M., Underhill, A., McArthur, C. C., Eggleston, P. Next-Generation Site-Directed Transgenesis in the Malaria Vector Mosquito Anopheles gambiae: Self-Docking Strains Expressing Germline-Specific phiC31 Integrase. PLoS ONE. 8 (3), 59264 (2013).
- Bernardini, F., et al. Site-specific genetic engineering of the Anopheles gambiae Y chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7600-7605 (2014).
- Volohonsky, G., et al. Tools for Anopheles gambiae Transgenesis. G3. 5 (6), 1151-1163 (2015).
- Amenya, D. A., et al. Comparative fitness assessment of Anopheles stephensi transgenic lines receptive to site-specific integration. Insect Molecular Biology. 19 (2), 263-269 (2010).
- Isaacs, A. T., et al. Transgenic Anopheles stephensi coexpressing single-chain antibodies resist Plasmodium falciparum development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 1922-1930 (2012).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2015).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of Transgenic Drosophila by Using the Site-Specific Integrase from Phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
- Franz, A. W. E., et al. Comparison of transgene expression in Aedes aegypti generated by mariner Mos1 transposition and site-directed recombination. Insect Molecular Biology. 20 (5), 587-598 (2011).
- Labbé, G., Nimmo, D., Alphey, L. piggybac-and PhiC31-Mediated Genetic Transformation of the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (8), 788 (2010).
- Schetelig, M. F., Scolaric, F., Handler, A. M., Kittelmann, S., Gasperi, G., Wimmer, E. A. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18171-18176 (2009).
- Yonemura, N., et al. phiC31-integrase-mediated, site-specific integration of transgenes in the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Applied Entomology and Zoology. 43 (11), 997-1008 (2013).
- Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
- Adolfi, A., Poulton, B., Anthousi, A., Macilwee, S., Ranson, H., Lycett, G. J. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
- Haghighat-Khah, R. E., et al. Site-specific cassette exchange systems in the aedes aegypti mosquito and the Plutella xylostella moth. PLoS ONE. 10 (4), 0121097 (2015).
- Long, D., Lu, W., Zhang, Y., Bi, L., Xiang, Z., Zhao, A. An efficient strategy for producing a stable, replaceable, highly efficient transgene expression system in silkworm, Bombyx mori. Scientific Reports. 5 (1), 8802 (2015).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006113 (2017).
- Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
- Dong, Y., Simões, M. L., Marois, E., Dimopoulos, G. CRISPR/Cas9 -mediated gene knockout of Anopheles gambiae FREP1 suppresses malaria parasite infection. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006898 (2018).
- Lombardo, F., Lycett, G. J., Lanfrancotti, A., Coluzzi, M., Arcà, B. Analysis of apyrase 5′ upstream region validates improved Anopheles gambiae transformation technique. BMC research notes. 2, 24 (2009).
- Pondeville, E., et al. Efficient ΦC31 integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
- Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nature protocols. 1 (3), 1312-1317 (2006).
- Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. 5, 216 (2007).
- Lynd, A., et al. Insecticide resistance in Anopheles gambiae from the northern Democratic Republic of Congo, with extreme knockdown resistance (kdr) mutation frequencies revealed by a new diagnostic assay. Malaria Journal. 17 (1), 412 (2018).
- Marinotti, O., et al. Development of a population suppression strain of the human malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Malaria Journal. 12 (1), 142 (2013).
- Adolfi, A. In vivo functional genetic analysis of insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. University of Liverpool. , (2017).
- Isaacs, A. T., Lynd, A., Donnelly, M. J. Insecticide-induced leg loss does not eliminate biting and reproduction in Anopheles gambiae mosquitoes. Scientific Reports. 7, 46674 (2017).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly efficient site-specific mutagenesis in malaria mosquitoes using CRISPR. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Poulton, B. C., et al. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , (2021).
