Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma
Summary
El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.
Abstract
El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.
Introduction
Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren que la regulación genética a otros niveles también contribuye a la coordinación de la proliferación y diferenciación de células madre neuronales6,7,8,9,10. Por lo tanto, abordar los programas de control traslacional avanzará en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la decisión del destino de las células madre neuronales y el desarrollo del cerebro.
Se han aplicado ampliamente tres técnicas principales con diferentes fortalezas para evaluar el estado traslacional del ARNM, incluyendo la elaboración de perfiles ribosomas, la purificación de afinidad ribosoma traducible (TRAP) y el perfilado de polisomas. La elaboración de perfiles ribosomas utiliza secuenciación de ARN para determinar fragmentos de ARNM protegidos por ribosomas, lo que permite el análisis global del número y la ubicación de los ribosomas traduciendo en cada transcripción para inferir indirectamente la tasa de traducción comparándola con la abundancia de transcripción11. TRAP aprovecha las proteínas ribosomales etiquetadas con epitopos para capturar los mRNAs ribosomas unidos al ribosoma12. Dado que las proteínas ribosomales etiquetadas se pueden expresar en tipos celulares específicos utilizando enfoques genéticos, TRAP permite el análisis de la traducción de una manera específica del tipo celular. En comparación, la elaboración de perfiles de polisomas, que utiliza el fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa para separar la porción libre y mal traducida (monosomas más ligeros) de aquellos que se traducen activamente por ribosomas (polisomas más pesados), proporciona una medición directa de la densidad ribosoma en el ARNm13. Una ventaja que ofrece esta técnica es su versatilidad para estudiar la traducción de mRNA específica de interés, así como el análisis de translatome en todo el genoma14.
En este artículo, describimos un protocolo detallado de perfilado de polisoma para analizar la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Utilizamos un sistema ensamblado en casa para preparar gradientes de densidad de sacarosa y recoger fracciones para aplicaciones posteriores. El protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para analizar otros tipos de tejidos y organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. es una Cátedra de Investigación de Canadá. S.K. fue financiado por Mitacs Globalink Graduate Fellowship y ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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