Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome
Summary
Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell’espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.
Abstract
Il corretto sviluppo del cervello dei mammiferi si basa su un buon equilibrio tra proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali in diversi tipi di cellule neurali. Questo equilibrio è strettamente controllato dall’espressione genica che viene messa a punto a più livelli, tra cui trascrizione, post-trascrizione e traduzione. A questo proposito, un crescente corpus di prove evidenzia un ruolo critico della regolamentazione traslizionale nel coordinamento delle decisioni sul destino delle cellule staminali neurali. Il frazionamento polisoma è un potente strumento per la valutazione dello stato traslazione dell’mRNA a livello genico globale e individuale. Qui presentiamo una pipeline di profilazione polisomaria internamente per valutare l’efficienza traslibrazionale nelle cellule dalla corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Descriviamo i protocolli per la preparazione del gradiente di saccarosio, la lisi tissutale, l’ultracentrifugazione e l’analisi basata sul frazionamento dello stato traslazione dell’mRNA.
Introduction
Durante lo sviluppo del cervello dei mammiferi, le cellule staminali neurali proliferano e si differenziano per generare neuroni e glia1,2 . La perturbazione di questo processo può portare ad alterazioni della struttura e della funzione cerebrale, come si vede in molti disturbi del neurosviluppo3,4. Il corretto comportamento delle cellule staminali neurali richiede l’espressione orchestrata di genispecifici 5. Mentre il controllo epigenetico e trascrizionale di questi geni è stato intensamente studiato, recenti scoperte suggeriscono che la regolazione genica ad altri livelli contribuisce anche alla coordinazione della proliferazione e differenziazione delle cellule staminalineurali 6,7,8,9,10. Pertanto, affrontare i programmi di controllo traslizionale farà avanzare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi alla base della decisione del destino delle cellule staminali neurali e dello sviluppo cerebrale.
Tre tecniche principali con diversi punti di forza sono state ampiamente applicate per valutare lo stato traslazionale dell’mRNA, tra cui la profilazione ribosoma, la traduzione della purificazione dell’affinità ribosoma (TRAP) e la profilazione polisome. La profilazione ribosoma utilizza il sequenziamento dell’RNA per determinare frammenti di mRNA protetti da ribosomi, permettendo all’analisi globale del numero e della posizione della traduzione dei ribosomi su ogni trascrizione di dedurre indirettamente il tasso di traslazione confrontandolo con l’abbondanza ditrascrizione 11. TRAP sfrutta le proteine ribosomiche taggate all’epitopo per catturare mRNA legati al ribosoma12. Dato che le proteine ribosomiche taggate possono essere espresse in specifici tipi di cellule utilizzando approcci genetici, TRAP consente l’analisi della traduzione in modo specifico del tipo cellulare. In confronto, la profilazione polisomeria, che utilizza il frazionamento del gradiente di densità del saccarosio per separare la porzione libera e scarsamente tradotta (monosomi più leggeri) da quelli tradotti attivamente dai ribosomi (polisomi più pesanti), fornisce una misurazione diretta della densità ribosoma su mRNA13. Un vantaggio che questa tecnica offre è la sua versatilità per studiare la traduzione di mRNA specifici di interesse e l’analisi del trasoma a livello genomico14.
In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato di profilazione polisoma per analizzare la corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Utilizziamo un sistema assemblato in casa per preparare gradienti di densità di saccarosio e raccogliere frazioni per applicazioni a valle. Il protocollo qui presentato può essere adattato facilmente per analizzare altri tipi di tessuti e organismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La profilazione polisoma è una tecnica comunemente usata e potente per valutare lo stato traslazione sia a livello di singolo gene che di genoma14 . In questo report, presentiamo un protocollo di profilazione polisoma utilizzando una piattaforma assemblata in casa e la sua applicazione per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Questa piattaforma economica è facile da assemblare e generare gradienti di saccarosio robusti e riproducibili e profilazione polisoma con elevata sensibil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. è una presidente di ricerca canadese. S.K. è stato finanziato dalla Mitacs Globalink Graduate Fellowship e dalla Borsa di studio per studenti laureati ACHRI.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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