Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi
Summary
Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA’ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.
Abstract
Memeli beyninin doğru gelişimi, nöral kök hücre çoğalması ve farklı nöral hücre tiplerine farklılaşmanın ince bir dengesine dayanır. Bu denge, transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri dahil olmak üzere birden fazla düzeyde ince ayarlı gen ekspresyonu ile sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bu bağlamda, büyüyen bir kanıt kütlesi, nöral kök hücre kader kararlarının koordinasyonunda çeviri düzenlemesinin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Polizom fraksiyonasyonu, mRNA çeviri durumunun hem küresel hem de bireysel gen düzeylerinde değerlendirilmesi için güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan fare serebral korteksinden hücrelerde çevirisel verimliliği değerlendirmek için şirket içi bir polisome profilleme boru hattı sunuyoruz. Sükroz gradyan hazırlama, doku lizisi, ultrasantrifüjasyon ve mRNA çeviri durumunun fraksiyonasyona dayalı analizi için protokolleri açıklıyoruz.
Introduction
Memeli beyninin gelişimi sırasında, sinirsel kök hücreler nöronlar oluşturmak için çoğalır ve farklılaşır ve glia1,2 . Bu sürecin pertürbasyonu, birçok nörogelişimsel bozuklukta görüldüğü gibi beyin yapısında ve işlevinde değişikliklere yol açabilir3,4. Nöral kök hücrelerin uygun davranışı, belirli genlerin düzenlenmiş ifadesini gerektirir5. Bu genlerin epigenetik ve transkripsiyonel kontrolü yoğun olarak çalışılmış olsa da, son bulgular diğer seviyelerde gen düzenlemesinin nöral kök hücre çoğalması ve farklılaşması 6 ,7, 8,9,10koordinasyonuna da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle, çevirisel kontrol programlarını ele almak, nöral kök hücre kader kararının ve beyin gelişiminin altında kalan mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde ilerletecektir.
Ribozom profilleme, ribozom benzeşim saflaştırma (TRAP) ve polisome profilleme dahil olmak üzere mRNA’nın çeviri durumunu değerlendirmek için farklı güçlere sahip üç ana teknik yaygın olarak uygulanmıştır. Ribozom profilleme, ribozom korumalı mRNA parçalarını belirlemek için RNA dizilimini kullanır ve her transkriptteki ribozomların çeviri sayısının ve konumunun küresel analizinin, transkript bolluğu ile karşılaştırarak dolaylı olarak çeviri oranını çıkarabilmesini sağlar11. TRAP, ribozomlara bağlı mRNA’ları yakalamak için epitop etiketli ribozomal proteinlerden yararlanır12. Etiketli ribozomal proteinlerin genetik yaklaşımlar kullanılarak belirli hücre tiplerinde ifade edilebildiği göz önüne alındığında TRAP, çevirinin hücre tipine özgü bir şekilde analiz edilmesine izin verir. Buna karşılık, serbest ve kötü çevrilmiş kısmı (daha hafif monosomes) ribozomlar (daha ağır poliomlar) tarafından aktif olarak çevrilenlerden ayırmak için sakkaroz yoğunluğu gradyan fraksiyonunu kullanan polisome profilleme, mRNA13üzerinde ribozom yoğunluğunun doğrudan ölçümünü sağlar. Bu tekniğin sunduğu avantajlardan biri, belirli bir mRNA’nın çevirisini ve genom çapında translatom analizini incelemek için çok yönlülüğüdür14.
Bu yazıda, gelişmekte olan fare serebral korteksini analiz etmek için ayrıntılı bir polisome profilleme protokolünü açıklıyoruz. Sakkaroz yoğunluk gradyanları hazırlamak ve aşağı akış uygulamaları için fraksiyonları toplamak için ev yapımı bir sistem kullanıyoruz. Burada sunulan protokol, diğer doku ve organizma türlerini analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polisome profilleme, çeviri durumunu hem tek gen hem de genom çapında değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir tekniktir14 . Bu raporda, ev yapımı bir platform ve gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için uygulamasını kullanarak polisome profilleme protokolü sunuyoruz. Bu uygun maliyetli platformun montajı ve yüksek hassasiyete sahip sağlam, tekrarlanabilir sakkaroz gradyanları ve polisome profilleme üretilmesi kolaydır.
T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma bir NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.) tarafından finanse edildi. G.Y. Kanada Araştırma Başkanı. S.K., Mitacs Globalink Lisansüstü Bursu ve ACHRI Lisansüstü Öğrenci Bursu tarafından finanse edildi.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
