ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום
Summary
התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.
Abstract
ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.
Introduction
במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים5. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול6,7,8,9,10. לפיכך, התייחסות לתוכניות הבקרה התרגומיות תקדם מאוד את הבנתנו את המנגנונים שבבסיס החלטת גורל תאי הגזע העצביים והתפתחות המוח.
שלוש טכניקות עיקריות עם עוצמות שונות יושמו באופן נרחב כדי להעריך את המצב התרגומי של mRNA, כולל פרופיל ריבוזום, תרגום טיהור זיקה ריבוזום (TRAP) ופרופיל פוליזום. פרופיל ריבוזום משתמש ברצף RNA כדי לקבוע שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזום, ומאפשר ניתוח גלובלי של מספר ומיקום של תרגום ריבוזומים על כל תעתיק כדי להסיק בעקיפין את שיעור התרגום על ידי השוואתו לשפעתעתיק 11. TRAP מנצלת חלבונים ריבוזומליים מתויגים באפיטופ כדי ללכוד mRNAs12הקשורים לריבוזום . בהתחשב בכך שהחלבונים הריבוזומליים המתויגים יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ספציפיים באמצעות גישות גנטיות, TRAP מאפשרת ניתוח של תרגום באופן ספציפי לסוג התא. לשם השוואה, פרופיל פוליזום, המשתמש בשבר שיפוע בצפיפות סוכרוז כדי להפריד חלק חופשי ותורגם בצורה גרועה (מונוזומים קלים יותר) מאלה המתורגמים באופן פעיל על ידי ריבוזומים (פוליזומים כבדים יותר), מספק מדידה ישירה של צפיפות הריבוזום ב- mRNA13. יתרון אחד טכניקה זו מציעה היא צדדיות שלה ללמוד את התרגום של mRNA ספציפי של עניין, כמו גם ניתוח תרגום רחב הגנום14.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של פרופיל פוליזום כדי לנתח את קליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו משתמשים במערכת ביתית כדי להכין מעברי צבע של צפיפות סוכרוז ולאסוף שברים עבור יישומים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי לנתח סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות14 . בדו”ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN/04246-2018 ל- G.Y.). G.Y. הוא קתדרת מחקר בקנדה. S.K. מומן על ידי מלגת בוגרי Mitacs Globalink ומלגת סטודנטים לתארים מתקדמים של ACHRI.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
