Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino
Summary
O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.
Abstract
O desenvolvimento adequado do cérebro mamífero depende de um bom equilíbrio de proliferação de células-tronco neurais e diferenciação em diferentes tipos de células neurais. Esse equilíbrio é fortemente controlado pela expressão genética que é ajustada em vários níveis, incluindo transcrição, pós-transcrição e tradução. Nesse sentido, um conjunto crescente de evidências destaca um papel crítico da regulação translacional na coordenação das decisões de destino das células-tronco neurais. O fracionamento polissário é uma ferramenta poderosa para a avaliação do status translacional mRNA em níveis genéticos globais e individuais. Aqui, apresentamos um pipeline de perfil de polimento interno para avaliar a eficiência translacional nas células do córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Descrevemos os protocolos de preparação de gradiente de sacarose, lise tecidual, ultracentrifugação e análise baseada em fracionamento do status translacional mRNA.
Introduction
Durante o desenvolvimento do cérebro mamífero, as células-tronco neurais proliferam e se diferenciam para gerar neurônios e glia1,2 . A perturbação desse processo pode levar a alterações na estrutura e função cerebral, como visto em muitos distúrbios neurodesenvolvimentos3,4. O comportamento adequado das células-tronco neurais requer a expressão orquestrada de genes específicos5. Embora o controle epigenético e transcricional desses genes tenha sido intensamente estudado, achados recentes sugerem que a regulação genética em outros níveis também contribui para a coordenação da proliferação e diferenciação de células-tronco neurais6,7,8,9,10. Assim, abordar os programas de controle translacional avançará muito nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à decisão do destino das células-tronco neurais e ao desenvolvimento cerebral.
Três técnicas principais com diferentes pontos fortes foram amplamente aplicadas para avaliar o status translacional do mRNA, incluindo perfil ribossomo, tradução de purificação de afinidade ribossosome (TRAP) e perfil de polimento. O perfil ribossomo usa sequenciamento de RNA para determinar fragmentos de mRNA protegidos por ribossomo, permitindo a análise global do número e localização da tradução de ribossomos em cada transcrição para inferir indiretamente a taxa de tradução, comparando-a à transcrição11. TRAP aproveita as proteínas ribossômicas marcadas por epitope para capturar mRNAs12com limite ribossomo . Dado que as proteínas ribossômicas marcadas podem ser expressas em tipos de células específicas usando abordagens genéticas, o TRAP permite a análise da tradução de forma específica do tipo celular. Em comparação, o perfil polissário, que usa fracionamento de gradiente de densidade de sacarose para separar porção livre e mal traduzida (monossomos mais leves) daqueles que estão sendo ativamente traduzidos por ribossomos (polissomos mais pesados), fornece uma medição direta da densidade ribossomo no mRNA13. Uma vantagem que essa técnica oferece é sua versatilidade para estudar a tradução de mRNA específico de interesse, bem como análise de translatome em todo o genoma14.
Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado de perfil polisso para analisar o córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Usamos um sistema montado em casa para preparar gradientes de densidade de sacarose e coletar frações para aplicações a jusante. O protocolo aqui apresentado pode ser adaptado facilmente para analisar outros tipos de tecidos e organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O perfil polimento é uma técnica comumente usada e poderosa para avaliar o status translacional nos níveis de gene único e genoma14 . Neste relatório, apresentamos um protocolo de perfil polisome utilizando uma plataforma montada em casa e seu aplicativo para analisar o córtex do mouse em desenvolvimento. Esta plataforma econômica é fácil de montar e gerar gradientes robustos e reprodutíveis de sacarose e perfil polisso com alta sensibilidade.
Vale ressaltar q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 para G.Y.). G.Y. é uma cadeira de pesquisa do Canadá. A S.K. foi financiada pela Mitacs Globalink Graduate Fellowship e pela ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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