이 프로토콜은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 연구하기 위해 생체 내 모델로 5-8일 된 닭 배아와 융모막(CAM)을 획득하고 사용하는 방법에 대한 세 가지 방법을 설명합니다.
닭 배아와 혈관이 풍부한 융모막(CAM)은 생의학 과정, 새로운 초음파 펄스 방식 또는 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 위한 새로운 변환기를 조사하는 데 유용한 생체 내 모델입니다. 그 이유는 CAM의 배아 및 혈관 네트워크의 접근성과 모델의 저렴한 비용 때문입니다. 배아 및 CAM 혈관에 접근하는 중요한 단계는 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내는 것입니다. 이 프로토콜에서는 배양 5 일에서 8 일 사이에 달걀 껍질에서 내용물을 꺼내는 세 가지 방법이 설명되어 있으므로 배아가 달걀 껍질 내부에서 오늘날까지 발달 할 수 있습니다. 설명 된 방법은 간단한 도구와 장비 만 필요하며 ex ovo 배양 배아 (~ 50 %)에 비해 5 일 동안 90 %, 6 일 동안 75 %, 7 일 동안 50 %, 8 일 된 배양 알의 경우 60 %의 더 높은 생존 성공률을 산출합니다. 이 프로토콜은 또한 마이크로 버블과 같은 캐비테이션 핵을 CAM 혈관 시스템에 주입하는 방법, 광학적으로 투명한 연구를 위해 배아와 CAM을 포함하는 막을 나머지 계란 함량과 분리하는 방법, 다양한 단기 초음파 실험에서 닭 배아와 CAM을 사용하는 방법을 설명합니다. 생체 내 닭 배아 및 CAM 모델은 조영제 강화 초음파 영상을 위한 새로운 영상 프로토콜, 초음파 조영제 및 초음파 펄스 방식을 조사하고 초음파 매개 약물 전달 메커니즘을 밝히는 데 매우 관련이 있습니다.
Ex ovo 닭 배아와 혈관이 풍부한 융모막 (CAM)은 배아 발생, 종양학 및 약물 전달 1,2,3,4와 같은 다양한 생물학적 및 생물 의학적 과정을 조사하는 데 적합한 모델로 입증되었습니다. 초음파는 배아 심장 발달 4,5의 이미징 및 혈관 약물 전달 6,7을 위해 마이크로 버블과 같은 주사시 캐비테이션 핵을 활성화하는 데 사용되었습니다. 닭 배아는 저렴하고 인프라와 장비가 덜 필요하며 다른 동물 모델에 비해 덜 엄격한 법률을 가지고 있습니다8. 닭 배아와 CAM 혈관은 난자를 연 후 쉽게 접근할 수 있는 반면 포유류 배아와 혈관에서는 훨씬 더 어려운 것으로 판명되었습니다. 이 외에도 닭 배아와 CAM 혈관은 심장 박동과 맥동 혈류를 제공합니다. CAM은 포유류와의 혈관 해부학에서 유사성을 나타내며 약물 스크리닝 8,9,10에 사용될 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 CAM 용기는 조영제 강화 초음파 영상(CEUS)11,12,13,14,15,16을 조사하는 데 적합한 모델임이 입증되었습니다. 또한이 모델은 초고속 카메라를 사용하여 초음파 분야에서 초음파 조영제의 거동과 약물 7,17,18,19의 추진, 결합 및 혈관 외 유출에 대한 음향 방사력의 영향을 광학적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 닭 배아와 CAM은 장기 실험에는 적합하지 않지만 단기 생체 내 실험에는 도움이 될 수 있습니다.
실험 동안 닭 배아 및 CAM에 대한 가시성 및 제어 가능성을 높이려면, 달걀 껍질18에서 배아 및 CAM을 포함하는 계란 함량을 취하는 것이 중요하다. 초음파 조영제를 사용한 이전의 닭 배아 연구는 5-6 일 된 배아 7,11,12,17,19 및 14-18 일 된 배아 13,14,15,16을 사용했습니다. 껍질 18,20,21에서 계란 함량을 제거하기 위해 여러 가지 접근법이 자세히 설명되었습니다. 그러나 우리가 아는 한, 이전에 발표 된 접근법은 3 일간의 배양 후 (즉, Hamburger & Hamilton (HH) 단계 19-2022) 달걀 껍질에서 난자 함량을 꺼내고 배양을 계속하는 데 중점을 둡니다. 이 exovo 배양 접근법은 배양 중 사망 위험 증가(~50%)1,18, 항생제 사용 18,20, 난소 성장에 비해 총 혈관 길이 감소 23을 포함하여 여러 가지 단점이 있습니다. 달걀 껍질 내에서 배아를 배양하는 것이 가장 자연스러운 환경을 제공하기 때문에 실험 당일까지 달걀 껍질 내에서 배아를 배양하는 것이 가장 쉽습니다. 이러한 이유로 배양 5-8 일에 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내는 접근법은 특히 5-8 일 된 배아에 대한 실험에 유용합니다.
이 프로토콜에서는 배아가 발달 5-8일(HH 26-3522)에 있을 때 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼내 실험 당일까지 달걀 껍질 내에서 배아가 발달할 수 있도록 하는 세 가지 방법을 설명합니다. CAM 용기 크기는 8 일 된 배아 24의 작은 모세 혈관에서 직경 10-15 μm에서 6 일 및 8 일 된 배아24,25의 더 큰 혈관에서 직경 115-136 μm까지 다양합니다. 설명 된 세 가지 방법은 기본 실험실 도구 만 필요하며 실험이 시작되기 전에 합병증의 위험을 줄여 불필요한 비용과 노동력을 줄입니다. 또한 배아와 CAM이 포함된 막을 노른자 자루에서 분리하여 현미경 연구를 위해 CAM을 광학적으로 투명하게 만드는 방법을 자세히 설명합니다. 배아 및 CAM을 함유하는 막이 예를 들어 음향 막이 있는 홀더 상에 고정될 수 있기 때문에, 셋업은 또한 음향적으로 투명하게 만들어질 수 있다(26), 광 경로가 노른자에 의해 영향을 받을 때 현미경 및 초음파 연구의 조합을 허용한다. 마지막으로 초음파 또는 CEUS 이미징에 사용할 수 있는 몇 가지 다른 초음파 설정에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달을 연구하기 위해 생체 내 모델로 5-8일 된 닭 배아와 CAM을 얻고 사용하는 방법에 대한 세 가지 방법을 설명합니다. 5 일 된 (섹션 1.2) 및 6-7 일 된 (섹션 1.3) 배아를 껍질에서 꺼내는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 달걀 흰자를 빼기 전에 달걀 꼭대기의 작은 구멍을 만들어 달걀 껍질 전체를 통해 공기 주머니로 들어갑니다. 2) 쉘의 큰 구멍을위한 부드러운 가장자리를 만듭니다. 껍질에서 8 일 된 배아를 꺼내는 방법 (섹션 1.4)의 경우 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 계란을 따라 멋진 균열을 만들기 위해 충분한 수의 들여 쓰기를 만드십시오. 2) 계란을 PBS에 담그십시오. 모든 방법에 대한 배아 생존력을 보장하려면 난자와 그 내용물을 37 ° C로 유지하는 것이 중요합니다. 또한 CAM 동맥에 주사하지 마십시오. 연구 중 배아의 심박수를 육안으로 모니터링하는 것은 배아의 활력을 보장하기 위해 권장됩니다. 배아의 정확한 발달 단계를 확인하기 위해 Hamburger & Hamilton22의 표시를 사용할 수 있습니다.
배아, CAM 및 노른자 자루의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 이 손상은 배아와 CAM의 생존력, 혈류 및 가시성에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 노른자 자루가 손상되어 결과적으로 멤브레인의 강성이 낮아 CAM 용기에 주입이 불가능합니다. 5 일 된 배아는 비교적 작은 공기 주머니를 가지고 있으므로 껍질에 난자 함량을 제거 할 수있는 충분히 큰 구멍을 만들 수 있으려면 2mL의 달걀 흰자를 빼내야합니다. 결과적으로 달걀 껍질과 배아 사이에 더 많은 공간이 생깁니다. 달걀 흰자를 빼낸 후 바늘이 들어간 구멍을 테이프 조각으로 막아야합니다. 달걀 흰자가 여전히 새어 나오면 다른 테이프를 바르십시오. 이 외에도 측면의 구멍에 테이프를 붙이면 계란 내부에 진공이 생성되어 1.2.2.8단계에서 큰 구멍을 만들 때 자체 무게로 인해 계란 내용물이 떨어지는 것을 방지합니다. 배아 또는 CAM의 손상은 달걀 껍질의 가장자리가 너무 날카 롭거나 달걀 내용물이 계량 보트에 너무 엄격하게 떨어질 때도 발생할 수 있으므로 달걀 껍질을 계량 보트에 매우 가깝게 유지해야합니다. 현상 5일째와 6일 사이에, CAM은 쉘 멤브레인(32)에 부착되기 시작한다. 이 부착물은 달걀 껍질에서 난자 내용물을 꺼낼 때 배아와 CAM을 손상시킬 위험을 증가시킵니다. PBS를 주입 한 후 6 내지 7 일 배양 된 난자 또는 8 일 배양 난자에 대해 설명 된대로 PBS로 채워진 용기에 넣음으로써 손상 위험이 감소합니다. CAM 정맥으로의 주사와 관련하여: 첫 번째 주사가 실패하면 손상이 경미하거나 다른 CAM 정맥에 있는 경우 동일한 정맥에서 두 번째 주사를 더 업스트림으로 수행할 수 있습니다. 배아와 CAM을 노른자에서 분리하면 배아와 CAM 혈관이 광학적으로 투명해집니다. 결과적으로, 배아는 영양소의 주요 공급원을 잃는다33. 이러한 영양소 손실은 여전히 노른자와 접촉하는 6 일 된 배아의 경우 ~ 190과 비교하여 관찰 된80bpm의 낮은 심박수와이 분리 절차 후 2 시간의 감소 된 생존 시간에 대한 설명 일 수 있습니다. 감소된 심박수 및 생존 시간에 역할을 할 수 있는 또 다른 인자는 난황으로 분리된 배아 및 CAM 혈관을 37°C에서 유지하는 것이 도전이다. 현미경 스테이지 인큐베이터가 도움이 될 수 있습니다. 이 외에도 노른자에서 CAM이 분리되면 막 장력이 낮아지기 때문에 조직의 기계적 변화가 발생할 수 있습니다. 멤브레인 장력이 낮 으면 내부 혈관 전단 속도가 증가하여 심박수가 낮아질 수 있습니다.
exovo 닭 배아 및 CAM 혈관은 조영제 강화 초음파 영상 및 마이크로버블 매개 약물 전달 연구를 위한 단시간 관찰만을 포함하여 생체내 모델과 마찬가지로 몇 가지 제한이 있습니다. 5일째에 100±23μL, 6일째에 171±23μL의34μL의 작은 혈액량으로 인해 최대 ~5μL를 주사할 수 있습니다. 발달의 후기 단계 (7 일 이상)에서는 혈관 강성이 증가하고 노른자 탄력이 감소합니다. 이것은 오래된 배아에서 성공적인 주사를 복잡하게 만들 수 있습니다. 일단 마이크로버블이 주입되면, 닭 배아는 이 단계(35)에서 완전히 발달된 면역계를 갖지 않기 때문에 그들은 몇 시간 동안 순환한다. 따라서 마이크로 버블은 인간36,37에서와 같이 ~ 6 분 이내에 제거되지 않으므로 결합되지 않은 표적 마이크로 버블이 제거되기까지 5-10 분의 대기 기간을 가진 전형적인 초음파 분자 영상 연구가 불가능합니다 38. 마이크로버블을 표적화하기 위해, 조류 내피 세포에 결합할 수 있는 적합한 리간드가 혈관신생 마커 αvβ37에 대해 이전에 기술된 바와 같이 사용될 필요가 있다. 이 모델에 대해 고려해야 할 다른 측면은 오래된 배아(> 8일)에서 노른자에서 배아와 CAM 혈관을 분리하는 데 어려움이 증가하고 인간에 비해 ~20%39의 낮은 헤마토크릿입니다. 후자는 마이크로버블 진동에 영향을 미칠 수 있는데, 그 이유는 마이크로버블 진동이 더 점성이 있는 환경(40)에서 감쇠되는 것으로 알려져 있기 때문이다. CAM 동맥은 CAM 정맥41,42보다 산소가 적습니다. 이 차이는 예를 들어 혈액 산소 공급의 광 음향 영상을 연구 할 때 고려되어야합니다.
여기에 설명된 방법을 사용하면 초음파 영상 또는 약물 전달 연구 당일, 일반적으로 배양 5-8일에 달걀 껍질에서 계란 내용물을 꺼낼 수 있습니다. 이는 3일 배양 후 껍질에서 난자 함량을 꺼내 exovo 배양 18,20,21로 추가로 개발하는 기존 방법과 다릅니다. 장점은 5 일 동안 90 %, 6 일 동안 75 %, 7 일 동안 50 %, 7 일 동안 60 %, 8 일 된 배양 된 알의 경우 60 %의 더 높은 생존율이며, 달걀 껍질에서 꺼내어 추가로 배양 된 3 일 된 배아의 경우 ~ 50 %와 비교하여 1,18 배양 중 항생제 회피 18, 20 및ex ovo 배양을 위한 대형 멸균 배양기. 6-8일된 배아의 생존은 CAM이 껍질(21)에 부착되기 시작하여 추출시 CAM 막이 파열되기 더 쉽기 때문에 더 낮습니다. 배아와 CAM 형태의 노른자의 분리는 또한 배아와 CAM을 광학적으로 투명하게 만드는 것으로 설명된다.
계란 함량을 다른 설정에 배치함으로써 닭 배아와 CAM은 IVUS, 광 음향, 2D 및 3D의 초음파 조영제 없이 또는 함께 사용하는 것과 같은 다양한 초음파 영상 연구에 사용할 수 있습니다. 초점은 새로운 초음파 펄스 체계를 개발하거나 새로운 변환기를 테스트하는 것입니다. 이 외에도이 모델은 새로운 초음파 조영제와 흐름중인 혈관에서의 행동을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 마이크로버블-매개 약물 전달의 메카니즘이 아직 알려지지 않았기 때문에43, 생체내 CAM 모델의 사용은 세포 반응과 관련된 마이크로버블 거동을 연구함으로써 메카니즘을 해명하는데 도움이 될 수 있다. 마지막으로, CAM 혈관은 이종이식 종양 이식을 조사하기에 적합한 시스템인 것으로 입증되었다44. 이것은 초음파를 사용하여 종양 영상을 조사하고 CEUS를 사용하여 종양 내부의 혈류를 조사하기 위한 모델로 CAM 혈관을 사용할 수 있는 가능성을 만듭니다. 종양은 전형적으로 8 일 또는 9 일 된 배아 1,14,45의 CAM 혈관에 이식되며, 배양 3 일째에 배아를 달걀 껍질에서 꺼내어 난소 외에서 추가로 발달시킨다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 종양 이식 당일까지 ovo에서 배아를 성장시키는 데 사용될 수 있습니다.
저자들은 이 논문이 조영제 및 유동 연구의 적용을 위한 생체 내 모델로 닭 배아와 융모막 막(CAM)을 사용하려는 연구자들에게 도움이 될 것이라고 믿습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NWO의 일부인 응용 및 공학 과학 (TTW) (Vidi 프로젝트 17543)의 지원을 받았습니다. 저자는 네덜란드 로테르담 에라스무스 MC 대학 의료 센터의 기술 지원을 위해 생물 의학 공학과의 Robert Beurskens, Luxi Wei 및 Reza Pakdaman Zangabad와 실험 의료 계측과의 Michiel Manten 및 Geert Springeling에게 감사드립니다.
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Clamp (Kocher clamp) | |||
Cling film | |||
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) | MABIO, Tourcoing, France | CLINIcell25-50-T FER 00106 | |
Demi water | |||
Disposable plastic Pasteur pipets | VWR | 612-1747 | |
Eggs | Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands | Freshly fertilized | |
Fridge 15 °C | |||
Glass capillary needles | Drummond | 1-000-1000 | Inside diameter: 0.0413 inch |
Heating plate 37 °C | |||
Humidified incubator 37 °C | |||
Insect specimen pins | |||
Metal egg holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B | ||
Metal weighing boat holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D | ||
Microinjection system | FUJIFILM VisualSonics | ||
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-100ML | |
Needle, 19 G | VWR (TERUMO) | 613-5392 | |
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Petri dish, 1 L | Glass | ||
Petri dish, 90 mm diameter | VWR | 391-0559 | |
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) | FUJIFILM VisualSonics | ||
Probe (MS250) | FUJIFILM VisualSonics | 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency | |
Probe (MS550s) | FUJIFILM VisualSonics | transmission frequency of 40 MHz | |
Scalpel | VWR (SWANN-MORTON) | 233-5363 | |
Scissors, small | Fine Science Tools (FST) | 14558-09 | |
Syringe, 5 mL | VWR (TERUMO) | 613-0973 | |
Table spoon | |||
Tape (Scotch Magic tape) | Scotch | ||
Tissue paper | Tork | ||
Tweezers large | VWR (USBECK Laborgeräte) | 232-0107 | See figure 1E |
Tweezers small | DUMONT Medical, Switzerland | 0103-5/45 | See figure 1F |
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) | Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017). | ||
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | ||
Ultrasound contrast agent (Definity) | Lantheus medical imaging, United States | ||
Ultrasound gel | Aquasonic | ||
Waxi film (Parafilm) | Parafilm | ||
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) | VWR | 611-0094 |