该协议描述了有关如何获得和使用5至8天大的鸡胚胎及其脉络膜尿囊膜(CAM)作为体内模型的三种方法,以研究对比增强超声成像和微泡介导的药物递送。
鸡胚和富含血管的脉络膜尿囊膜(CAM)是一种有价值的 体内 模型,用于研究生物医学过程,新的超声脉冲方案或用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送的新型换能器。其原因是CAM的胚胎和血管网络的可访问性以及模型的低成本。进入胚胎和CAM血管的一个重要步骤是将蛋内容物从蛋壳中取出。在该协议中,描述了在孵育的第5天和第8天之间将内容物从蛋壳中取出的三种方法,从而使胚胎在这些天内在蛋壳内发育。所描述的方法只需要简单的工具和设备,与卵外培养胚胎(~50%)相比,5天存活成功率更高,6天存活成功率为90%,6天存活成功率为75%,7天存活成功率为50%,8天龄孵化 卵 存活成功率为60%。该协议还描述了如何将空化核(例如微气泡)注入CAM血管系统,如何将含有胚胎和CAM的膜与其余的鸡蛋内容物分离以进行光学透明研究,以及如何在各种短期超声实验中使用鸡胚和CAM。 体内鸡胚和CAM模型与研究用于对比增强超声成像的新型成像方案,超声造影剂和超声脉冲方案以及揭示超声介导的药物递送机制非常相关。
卵外鸡胚胎和富含血管的脉络膜尿囊膜(CAM)已被证明是研究各种生物和生物医学过程(如胚胎发生,肿瘤学和药物递送)的合适模型1,2,3,4。超声已被用于胚胎心脏发育的成像4,5和用于在注射时激活空化核,例如微泡,用于血管药物输送6,7。与其他动物模型相比,鸡胚价格低廉,需要的基础设施和设备更少,并且立法不那么严格8.打开鸡蛋后,鸡胚胎和CAM容器很容易进入,而对于哺乳动物胚胎和容器来说,这要困难得多。除此之外,鸡胚和CAM血管提供心跳和脉动的血流。CAM在血管解剖学上与哺乳动物相似,可用于药物筛选8,9,10。由于这些特性,CAM血管也被证明是研究对比增强超声成像(CEUS)的合适模型11,12,13,14,15,16。此外,该模型可用于使用超高速相机光学研究超声造影剂在超声场中的行为,以及声辐射力对药物7,17,18,19的推进,结合和外渗的影响。虽然鸡胚和CAM不太适合长期实验,但它们对短期体内实验是有益的。
为了在实验过程中提高鸡胚和CAM的可见性和可控性,重要的是将含有胚胎和CAM的鸡蛋内容物从蛋壳中取出18。以前涉及超声造影剂的鸡胚胎研究使用了5至6天大的胚胎7,11,12,17,19和14至18天大的胚胎13,14,15,16。已经详细描述了将蛋内容物从壳中取出的多种方法18,20,21。然而,据我们所知,先前发表的方法侧重于在孵化3天后(即汉堡和汉密尔顿(HH)阶段19-2022)将鸡蛋含量从蛋壳中取出,并继续卵外培养。这种卵外培养方法具有多种缺点,包括培养过程中死亡风险增加(~50%)1,18,抗生素的使用18,20,以及与卵内生长相比,总血管长度减少23。由于在蛋壳内培养胚胎提供了最自然的环境,因此最简单的方法是将胚胎在蛋壳内孵育直到实验当天。出于这个原因,在孵化 5 到 8 天时将鸡蛋内容物从蛋壳中取出的方法对于 5 到 8 天大的胚胎的实验尤其有益。
在该协议中,我们描述了三种方法,当胚胎处于发育的第5至8天(HH 26-3522)时,将卵内容物从蛋壳中取出,允许胚胎在蛋壳内发育直到实验当天。CAM容器的直径范围从8天大胚胎24的较小毛细血管中的直径为10-15μm,到6天和8天大的胚胎24,25的较大容器中的直径为115-136μm。所描述的三种方法只需要基本的实验室工具,并在实验开始之前降低并发症的风险,从而减少不必要的成本和劳动力。我们还详细介绍了一种将含有胚胎和CAM的膜与卵黄袋分离的方法,使CAM在显微镜研究中具有光学透明性。由于包含胚胎和CAM的膜可以固定在例如带有声膜的支架上,因此该设置也可以使声学透明26,当光路将受到卵黄的影响时,允许显微镜和超声研究相结合。最后,我们描述了其他几种可用于超声或CEUS成像的超声设置。
该协议描述了有关如何获得和使用5至8天大的鸡胚胎及其CAM作为 体内模型的三种方法,以研究造影剂增强超声成像和微泡介导的药物递送。将5天大的胚胎(第1.2节)和6至7天大的胚胎(第1.3节)取出蛋的最关键步骤是:1)在取出蛋清之前,在鸡蛋顶部打一个小孔,穿过整个蛋壳进入气囊;2)为外壳中的大开口创建光滑的边缘。对于将8天大的胚胎从壳中取出的方法(第1.4节),最关键的步骤是:1)制作足够数量的压痕以沿着鸡蛋产生漂亮的裂缝;2)将鸡蛋浸没在PBS中。为了确保所有方法的胚胎活力,重要的是将卵子及其内容物保持在37°C。 此外,避免注射到CAM动脉。建议在研究期间目视监测胚胎的心率,以确保胚胎活力。为了确认胚胎的确切发育阶段,可以使用Hamburger&Hamilton22的指示。
重要的是要防止损坏胚胎、CAM 和卵黄袋。这种损伤会影响胚胎和CAM的活力,血流和可见性。此外,对卵黄袋的损坏以及因此膜的低刚性使得无法注射到CAM容器中。一个5天大的胚胎有一个相对较小的气囊,因此为了能够在壳上开一个足够大的孔,通过这个孔可以去除卵子内容物,需要取出2毫升的蛋清。结果,蛋壳和胚胎之间创造了更多的空间。取出蛋清后,需要用胶带封闭针头进入的孔。如果蛋清仍然泄漏,请再贴一块胶带。除此之外,在侧面的孔上涂上胶带会在鸡蛋内部产生真空,当在步骤1.2.2.8中创建大孔时,可以防止鸡蛋内容物因其自身重量而脱落。当蛋壳的边缘太锋利或鸡蛋内容物落入称重舟太严格时,也会发生胚胎或 CAM 损坏,因此蛋壳应保持非常靠近称重船。在发育的第5天和第6天之间,CAM开始附着在壳膜32上。当将鸡蛋内容物从蛋壳中取出时,这种附着会增加损坏胚胎和 CAM 的风险。通过在将PBS注射到鸡蛋中以用于6至7天的孵化蛋或按照8天孵化蛋的描述在PBS填充的容器中打开鸡蛋,可以降低损坏的风险。关于注射到CAM静脉:如果第一次注射失败,如果损伤轻微或另一个CAM静脉,可以在同一静脉的上游进行第二次注射。胚胎和CAM与蛋黄分离使胚胎和CAM血管光学透明。结果,胚胎失去了营养的主要来源33。这种营养损失可能是观察到的心率降低80 bpm的原因,而6天大的胚胎仍与蛋黄30接触的6天大胚胎的~190,以及在此分离程序后2小时的存活时间减少。另一个可以在降低心率和存活时间方面发挥作用的因素是将蛋黄分离的胚胎和CAM血管保持在37°C的挑战。 显微镜载物台培养箱可能会有所帮助。除此之外,CAM与蛋黄的分离可能会导致组织的机械变化,因为膜张力变小。较低的膜张力可能导致血管内剪切速率增加,从而导致心率降低。
卵外鸡胚和CAM血管与体内模型一样具有一些局限性,包括仅短时间观察,用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送研究。由于第 5 天血容量小,第 5 天为 100±23 μL,第 634 天血容量为 171±23 μL,因此可以注射的最大血容量为 ~5 μL。在发育的后期阶段(第7天及以上),血管刚度增加,蛋黄弹性降低。这可能会使老年胚胎的成功注射复杂化。一旦注射微泡,它们就会循环数小时,因为鸡胚在这个阶段没有完全发育的免疫系统35。因此,微泡不能像人类36,37那样在~6分钟内清除,使得典型的超声分子成像研究需要5-10分钟的等待期才能清除非结合靶向微泡38不可行。为了靶向微气泡,需要使用能够与禽内皮细胞结合的合适配体,如前面描述的血管生成标志物αvβ 37。该模型需要考虑的其他方面是,与人类相比,在较老的胚胎(>8天)中将胚胎和CAM血管与卵黄分离的难度增加,以及血细胞比额降低~20%39。后者可能影响微气泡振荡,因为已知微气泡振荡在更粘稠的环境中被阻尼40。CAM 动脉的氧合量低于CAM 静脉 41,42。例如,在研究血液氧合的光声成像时,应考虑到这种差异。
这里描述的方法允许在超声成像或药物递送研究当天(通常在孵化的第5至8天)将蛋内容物从蛋壳中取出。这与现有方法不同,在现有方法中,鸡蛋内容物在孵育3天后从壳中取出并进一步发展为卵外培养物18,20,21。优点是5天孵化卵的存活率为90%,6天存活率为75%,7天存活率为50%,8天龄孵化种蛋存活率为60%,而从蛋壳中取出并进一步孵育的3天龄胚胎存活率为~50% 1,18 在培养过程中避免使用抗生素18,20和大型无菌培养箱用于Ex 卵子培养。6至8天大的胚胎的存活率较低,因为CAM开始附着在壳21上,这使得CAM膜在提取时更容易破裂。还描述了胚胎与CAM形式的蛋黄分离,使胚胎和CAM光学透明。
通过将鸡蛋内容物置于不同的设置中,鸡胚和CAM可用于多种超声成像研究,如IVUS,光声,不使用或与2D和3D超声造影剂一起使用。重点可以是开发新的超声脉冲方案或测试新型换能器。除此之外,该模型还可用于研究新型超声造影剂及其在流动下血管中的行为。由于微气泡介导的药物递送的机制仍然未知43,因此使用体内CAM模型可能有助于通过研究与细胞反应相关的微泡行为来阐明其机制。最后,CAM血管已被证明是研究异种移植肿瘤移植的合适系统44。这就有可能使用CAM血管作为模型,使用超声波研究肿瘤成像,并使用CEUS研究肿瘤内的血流。肿瘤通常移植在8或9天大的胚胎1,14,45的CAM血管上,在孵育的第3天将胚胎从蛋壳中取出并在卵外进一步发育。该协议中描述的方法可用于在卵中培养胚胎,直到肿瘤移植的那一天。
作者相信,本文将对希望使用鸡胚胎及其脉络膜尿囊膜(CAM)作为造影剂和流动研究应用的 体内模型的研究人员有所帮助。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NWO的一部分应用和工程科学(TTW)(Vidi项目17543)的支持。作者要感谢生物医学工程系的Robert Beurskens,Luxi Wei和Reza Pakdaman Zangabad以及实验医学仪器系的Michiel Manten和Geert Springeling的技术援助,他们都来自荷兰鹿特丹伊拉斯谟MC大学医学中心。
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Clamp (Kocher clamp) | |||
Cling film | |||
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) | MABIO, Tourcoing, France | CLINIcell25-50-T FER 00106 | |
Demi water | |||
Disposable plastic Pasteur pipets | VWR | 612-1747 | |
Eggs | Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands | Freshly fertilized | |
Fridge 15 °C | |||
Glass capillary needles | Drummond | 1-000-1000 | Inside diameter: 0.0413 inch |
Heating plate 37 °C | |||
Humidified incubator 37 °C | |||
Insect specimen pins | |||
Metal egg holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B | ||
Metal weighing boat holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D | ||
Microinjection system | FUJIFILM VisualSonics | ||
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-100ML | |
Needle, 19 G | VWR (TERUMO) | 613-5392 | |
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Petri dish, 1 L | Glass | ||
Petri dish, 90 mm diameter | VWR | 391-0559 | |
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) | FUJIFILM VisualSonics | ||
Probe (MS250) | FUJIFILM VisualSonics | 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency | |
Probe (MS550s) | FUJIFILM VisualSonics | transmission frequency of 40 MHz | |
Scalpel | VWR (SWANN-MORTON) | 233-5363 | |
Scissors, small | Fine Science Tools (FST) | 14558-09 | |
Syringe, 5 mL | VWR (TERUMO) | 613-0973 | |
Table spoon | |||
Tape (Scotch Magic tape) | Scotch | ||
Tissue paper | Tork | ||
Tweezers large | VWR (USBECK Laborgeräte) | 232-0107 | See figure 1E |
Tweezers small | DUMONT Medical, Switzerland | 0103-5/45 | See figure 1F |
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) | Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017). | ||
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | ||
Ultrasound contrast agent (Definity) | Lantheus medical imaging, United States | ||
Ultrasound gel | Aquasonic | ||
Waxi film (Parafilm) | Parafilm | ||
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) | VWR | 611-0094 |