造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製

すべての動物実験は、オランダ動物実験法および科学的目的のための動物使用の保護に関する欧州理事会(2010/63 / EU)に従って実施されました。 1 .胚調製プロトコル 受精鶏卵のインキュベーション受精したばかりの鶏卵を15°Cで最長1週間保存します。 受精卵を孵化させるには、先のとがった面を下にして垂直に37°Cの加湿インキュベーターに入れます。孵卵中に卵を回転させる必要はありません。注:永久マーカーを使用して卵の上の孵卵の開始日を書きます。 最大5日(120時間)の胚の準備(HHステージ26-28)22作業エリアの準備加熱プレートを37°Cに温めます。 金属製の卵ホルダー(図1A、B)、金属製の計量ボートホルダー(図1C、D)、およびPBSで満たされた10mLの三角ボックスを加熱プレートに置きます。 計量ボート(85 mm× 85 mm × 25 mm)に10 mmの超音波ゲル層を充填し、充填された計量ボートを予熱した金属製計量ボートホルダーに入れます。注:計量ボートに超音波ゲルを充填すると、胚とCAMが上昇します。これは、胚とCAMの注射またはイメージングに有益ですが、胚とCAMを卵殻から取り出すためには必要ありません。 一端の一部を折り返して、もうくっつかないようにテープ(長さ約3 cm)をいくつか用意します。 卵殻から卵の内容物を取り出す生後5日齢の孵化受精卵を取り、予熱した金属製の卵ホルダーに移します(図1A、B)。卵を同じ向き(つまり、日付を上に)に保つようにしてください。注:気嚢と胚およびCAMを卵の上部の同じ位置に保つには、卵を同じ方向に保つことが重要です。 ピンセットの先のとがった背面(または同様のもの; 図1E)卵の最上部(日付が書かれている場所)に小さなくぼみを作ります(図2A)。 ピンセットの先のとがった裏側を使用して、卵の約2/3下の卵の側面に2番目のくぼみを作ります(図2B)。注: インデントを大きくしすぎて穴が開かないように注意してください。誤って穴が開いた場合は、テープで穴を塞ぎ、別のくぼみをしないでください。 大きなピンセット(図1E)を使用して、卵の上のくぼんだ領域から卵殻の小片を取り出します(日付が書かれています)。卵殻の上部にある気嚢が卵の外側の空気と接触していることを確認してくださいが、殻を深く貫通しすぎないようにしてください。注:上部のくぼみを作るときに殻が深く貫通しすぎると、胚とCAMが損傷する可能性があり、胚は殻からの除去に耐えられません。上部の小さな穴が卵の内側と外側の間に空気接触を作り出すことが重要です。これを行わないと、手順の次のステップで真空が発生し、CAMの下に大きな気泡が閉じ込められ、胚とCAMが役に立たなくなります。卵の中の気嚢の位置を確認するには、その位置が常に正確に上にあるとは限らず、さらに横にある可能性があるため、光源を使用できます。 5 mLのシリンジと19 Gの針を使用して、卵の2/3側の2番目のくぼみから殻を貫通し、~2 mLの卵白を引き抜きます(図2C)。注意: 胚とCAMを損傷する可能性を防ぐために、針が卵の底に向かって下を向いていることを確認してください。このステップにより、卵の内容物の除去に必要な卵の上部に大きなエアポケットが作成されます。手順1.2.2.3で誤ってくぼみの代わりに穴が開いた場合は、卵白を引き出すために針でテープを刺します。別のテープでパンクを再シールします。 針を取り出し、テープを使用して側面の隙間を塞ぎます(図2D)。注意: 卵白が卵から漏れるのを防ぐために、針を取り出す前に指を使って上部の穴を閉じることができます。テープを貼ったまま卵白が漏れ続ける場合は、まずティッシュで卵白を取り除き、テープが正しくくっつくことを確認します。 計量ボートに卵白を加えて注射器を空にします。 大きなピンセット(図1E)を使用して、卵の上部にある小さな開口部を拡大します(図2E)。上部の開口部から卵の中を見ると、胚とCAMが見えます。できるだけ多くの卵殻を取り除きながら、胚とCAMの位置を特定し続けます(図2F)。注:殻の中の胚とCAMの位置を最大限に見やすくするために、卵を動かし続けます。シェルの開口部の端がCAMより低くならないようにしてください。これに加えて、内膜を貫通せず、鋭いエッジを防ぎます。 開口部を作成したら、卵を180°回転させ、卵の上部に作成された開口部が下部を向くように卵を卵ホルダーに戻します。胚は浮き上がり、底から見えなくなります(図2G)1〜2分かかります。次のステップに進む前に、胚全体とCAM(すべての血管を含む)が消え、卵黄だけが見えることを確認してください(図2H)。注:2分経っても胚が下から見える場合は、卵を時計回りに1〜2分間回します。これは胚とCAMが浮き上がるのを助けます。 側面の開口部からテープをはがします。卵の内側が底の開口部から膨らんでいるかどうか見てください。この場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は、注射器の針を使用して側面の開口部をもう一度穴を開け、卵の真空を解放します。卵黄袋に穴を開ける可能性を防ぐために、針で上を向いてください。卵が底の開口部から膨らむまで続けます。 金属製の計量ボートホルダーの計量ボートの近くに卵の底を保持しながら(図1C、D)、小さなピンセットの鋭いポイントの1つを使用して、開口部の幅全体にわたって膜に水平方向の引っかき傷をそっと作り(図1F)、卵の内容物を計量ボートにそっと落とします(図2I)。注意: 卵の内容物が出ない場合は、注射器の針を使用して、針を上に向けて側面の開口部を再度穴を開けます。 胚が計量ボートに横向きにある場合、通常は自然に上がります。これが起こらない場合は、ティッシュペーパーを使用して胚の位置を変えます。ティッシュペーパーの片面を胚の上に置き、ティッシュペーパーをもう一方の端に引きずり、プラスチック製のパスツールピペットを使用して数滴~30 μLのPBS(37°C)でティッシュペーパーを放出します。 心拍がまだ存在し、CAM血管が無傷で出血がなく、卵黄の漏れがないことを確認することにより、胚が生きているかどうかを視覚的に確認します。これらのことのいずれかが正しくない場合は、胚とCAMが生存できないため破棄してください。 胚とCAMが37°Cに保たれ、CAM血管が劣化し、最終的に胚が死んでしまうため、乾燥しないようにしてください。これを防ぐには、37°C PBSの~30 μLの小滴を胚とCAMに定期的に入れます。 6〜7日(144〜168時間)の古い胚の準備(HHステージ28〜32)22作業エリアの準備セクション 1.2.1 の説明に従ってステージを準備します。 卵殻から卵の内容物を取り出す実験の2時間前に、生後6〜7日の孵化卵を取り、卵の上部が下を向くようにインキュベーター内で卵を180°回転させます。1時間後、卵を元の位置に回転させ、さらに1時間放置します。注:実験の2時間前に卵を回転させると、卵の内容物を殻から取り出しやすくなります。 回転した後、インキュベーターから卵を取り出します。 ステップ 1.2.2.2 からステップ 1.2.2.4 まで実行します。 5 mLシリンジと19 G針を使用して、卵の2/3側の2番目のくぼみからシェルを貫通し、5〜6 mLの卵白を引き出します。針が卵の底に向かって下を向いていることを確認してください。注:使用した5 mLシリンジを使用すると、最大6 mLまで引き出すことができるため、1回の浸透のみが必要です。 針を取り出し、テープを使用して側面の隙間を塞ぎます(図2D)。 計量ボートの超音波ゲルに卵白を加えて注射器を空にします。 大きなピンセット(図1E)を使用して、卵の上部にある小さな開口部を拡大します(図2E)。開口部をできるだけ大きくするようにしてくださいが、シェルの開口部の端がCAMより低くならないようにしてください。これに加えて、内膜を貫通せず、鋭いエッジを防ぐようにしてください。 ステップ1.3.2.4で抜き出した容量よりも~1 mL多い37°C PBSをシリンジに充填します。 サイドギャップからテープを剥がし、充填されたシリンジでギャップを貫通し、シェルに空にします。針が卵の底に向かって下を向いていることを確認してください。注:卵白はPBS(~1cP)よりも粘度が高い(~160cP)27ため、卵白をPBSに置き換えると、卵の内容物を殻から取り出しながら、胚とCAMへの緊張とストレスの両方を軽減します。 針を取り出し、テープで隙間をすばやく再シールします(図2D)。 卵を180°回転させ、卵の上部に作成された開口部が下部を向くように卵を卵ホルダーに戻します。胚全体とCAM(すべての血管を含む)が消え、卵黄だけが見えるまで卵を時計回りに回します。 ステップ 1.2.2.10 からステップ 1.2.2.14 まで実行します。 8日(192時間)の古い胚の準備(HHステージ32-35)22作業エリアの準備加熱プレートを37°Cに温めます。 金属製の計量ボートホルダー(図1C、D)とPBSで満たされた10mLの三角ボタンを加熱プレートに置きます。 170 x 110 x 70 mmなどの浅い容器を取り、容器に1 Lの37°C PBSを満たします。 計量ボート(85 × 85 × 25 mm)を直径90 mmのペトリ皿に入れます。ペトリ皿と計量ボートを容器の底に置き、それらが完全に水没していることを確認します。 卵殻から卵の内容物を取り出す実験の2時間前に、生後8日目の孵化卵を取り、卵の上部が下を向くようにインキュベーター内で卵を180°回転させます。1時間後、卵を元の位置に回転させ、さらに1時間放置します。注:実験の2時間前に卵を回転させると、卵の内容物を殻から取り出しやすくなります。 インキュベーターから生後8日のインキュベート卵を取ります。 卵を水平に持ち、大きなピンセットの先のとがった背面(図1E)を使用して、卵の1/2下に小さなくぼみを作ります。卵殻を360°周回してリング状に小さなくぼみを作り続けます。インデント間には~10 mm の間隔を空けます。注意: この手順中に、くぼみの間に小さな亀裂が形成され始める可能性があります。 シェルの周りに小さなくぼみを作成したら、大きなピンセットの先のとがった背面を使用して、2つの小さなくぼみの間にシェルを割って、1つの大きな穴を開けます。 卵を37°CのPBSに完全に沈め、5分間水没させます。5分後、卵を容器内の計量ボートの近くに置いておきます。両方の親指の上部を大きな穴に入れ、卵をそっと開きます。卵は小さなくぼみに沿って割れます。 卵殻の周りに亀裂が形成されたら、2つの卵殻をそっと引き離し、卵の内容物が殻から分離するまで2つの部分をゆっくりと前後に動かし続けます。次に、卵の内容物を計量ボートにそっと落とします。注意: 2枚の卵殻を前後に動かすと、より多くのPBSが卵殻に流れ込み、卵の内容物を殻から分離するのに役立ちます。時々、卵白が卵殻の内側にくっつくことがあります。このような場合は、ピンセットを使用して卵白を殻から分離します。 計量ボートと卵の含有量が入ったペトリ皿をPBSからゆっくりと持ち上げます。PBSから出たら、計量ボートを少し傾けて余分なPBSを取り除きます。 卵の内容物を含む計量ボートを金属製の計量ボートホルダーに入れ、目的の実験セットアップに移動します。 2. 選択したアプリケーション マイクロバブルやその他の溶液をCAM容器に注入するインジェクション設定の準備マイクロフォージを使用してガラスキャピラリーチューブからガラス針を引き出すか(図3A)、引っ張られたガラス毛細管針を購入します。 ガラス毛細管針の先端が斜角になっていない場合は、針の先端のごく一部を折ってください。ガラス針を鉱物油で満たし、マイクロインジェクションシステムに入れます。ガラス針の鉱物油に気泡がないことを確認してください。注意: 鉱油は、使用した注入システムの製造元の指示に従って追加されます。 マイクロインジェクションシステムが許す限り、引っ張られたガラス毛細管針を空にし、ガラス針に空気を部分的に補充します。注意: 少量の空気は、鉱油と注入される溶液の混合物を防ぎます。 このプロトコルマイクロバブルに10μLの所望の溶液をワックス状のフィルムの上に置きます(図3B)。複数の溶液が必要な場合は、ピペッティング前に溶液を混合することができます7。注意: 針にマイクロバブルを充填する前に、マイクロバブルドロップをワックスフィルムに~1分間放置して、マイクロバブルがドロップの上部に浮かんで集中するようにします。F型カスタムメイド超音波造影剤28の場合、この濃縮工程により、注入されるマイクロバブル濃度が~30%増加する。鶏胚血中の注射後濃度は、5日齢の胚の場合は32 x 10 3マイクロバブル/ μL、6日齢の胚の場合は19 x 103マイクロバブル/ μLになります。 ガラス針の先端をワックス状フィルムの液滴に配置して、ガラス針にマイクロバブルおよび/または他の溶液を満たします。マイクロバブルを吸引するときは、針先を液滴の上部に配置して、マイクロバブル濃縮溶液を吸引してください。注:マイクロバブルを注入する前に、ガラス針の先端を最高点まで上げ、~2分間待ちます。これにより、マイクロバブルがガラス針の先端に集中するようになります。 CAM容器への注入注入する前に、実体顕微鏡でCAMを見て、注入するのに最適な容器を選択します。常に胚の 静脈 の1つに注射してください。これらは血流が胚に向かって移動する血管です。静脈は、酸素化された血液のために動脈よりも色が薄い29。さらに、静脈は常に動脈の上にありますが、周囲に動脈がない前部および後部の硝子体静脈(つまり、 図6A、Bにアスタリスクで示されている分岐の少ない静脈)の2つの例外があります。注:枝の1つに注射すると、注射中の血流の閉塞が制限されます。良好な注射部位は、 図6A、Bに矢印で示されている。注入された物質が胚に向かって流れるように強制するため、静脈に注射することが重要です。これに加えて、動脈に注射すると、ガラス針を外すときに大量の出血が発生し、胚が死滅します。 ガラス針と胚を、ガラス針の先端と選択した静脈が同じ焦点面と同じ方向線になるように配置します。選択した静脈と平行に針をできるだけ水平に配置するようにしてください。針先が血管壁に触れる必要があります。注意: ガラス針をできるだけ水平に配置することにより、容器全体を貫通する可能性が低くなります。 位置決め後、ゆっくりと前進し、ガラス針で容器壁を貫通します。貫通中、CAMは最初にガラス針の動きによって押しのけられます。容器の壁が貫通するまでガラス針を前進させ続けます。注意: 誤って血管に穴を開けた場合は、針をゆっくりと引っ込めて内腔に戻します。内腔内に戻ったら、針を少し持ち上げ、血管に沿って前方に移動して針の位置を変更します。 貫通後、ガラス針をわずかに引っ込めて先端を血管内腔内に配置しやすくし、ガラス針を横に動かして血管壁に取り付けられていないことを確認します。少量の溶液をゆっくりと注入して、先端が血管内腔の内側に配置されていることを確認します(図3C)。 注入された溶液が血流に従うことを確認してください。そうでない場合は、ガラス針をわずかに動かし、ガラス針が正しく配置されるまで少量を注入し続けます17。 希望の量を注入したら、大量の出血を防ぐために、ガラス針を容器内に~15秒間放置します。次に、ガラス針を少し横、上下、前後に数回動かして、ガラス針を静かに引っ込めます。注:一部の出血は正常です。ガラス針は卵白で簡単に詰まり、鈍くなるため、注射ごとに新しいガラス針を使用してください。 胚および/またはCAM血管の顕微鏡イメージング音響膜付きホルダーの準備2つの平行な50μm厚の音響透過性ポリカーボネート膜を備えた正方形のプラスチックホルダーからなる細胞培養チャンバー26を取り、さらに音響膜付きホルダーと称する。ふたで両方のポートを閉じます。 メスを使用して、音響膜でホルダーから2つの膜の1つを取り除きます。注意: メンブレンを取り外すには、プラスチックの接着剤ラインのすぐ隣でメンブレンをカットします。他の膜の損傷を防ぐために、端から滑り落ちないように注意してください。 小さなガラスビーカーで80〜95°Cに加熱することにより、デミ水溶液中の2%アガロースを~15 mL調製します。ガラスビーカーを溶かしたアガロース溶液で冷水栓で冷却します。注意: アガロースが熱すぎると、音響膜が溶けて表面に凹凸が生じます。 溶液を約37°Cまで冷却したら、ホルダー全体がいっぱいになるまで、音響膜を使用してホルダーに溶液をゆっくりと注ぎます。アガロース層がプラスチックフレーム内に均等に分布するように、音響膜でホルダーを少し傾けます(図4A)。アガロース層が平らであることを確認し、アガロースを室温に設定します。 卵黄袋から胚とCAMを取り出し、音響膜でホルダーに置くセクション1.2、1.3、または1.4で説明されているように、卵から卵の内容物を取り出します。 必要に応じて、セクション2.1.2で説明されているように、マイクロバブルやその他の溶液をCAMに注入します。 1 Lのペトリ皿に~500 mLの37°C PBSを満たし、アガロースを含む音響膜を皿の底に置きます。アガロース層が上を向いていることを確認してください。 小さなハサミを使用して、卵の含有量物が計量ボートに入っている間に、CAM全体の周りの卵黄袋(Vitellus膜とも呼ばれます) の膜にすばやく 切り込みます(図4B)。はさみを同じ位置に保ち、計量ボートを回転させながら切断すると、精度と速度が向上します。注:最初のカットが行われた瞬間から、卵黄が漏れ始めます。これにより、胚とCAMの視認性が低下します。6〜7カット以内にCAMの周りを完全にカットしてみてください。これには20秒以上かかることはありません。小さなピンセット(図1F)を使用して、硝子膜の端を保持し、CAMへの切断を防ぐことができます。 大さじを使用して、計量ボートから胚とCAMを含む切り欠き膜をすくい上げます。計量ボートからスプーンをゆっくりと持ち上げ、胚とCAMを含む切り欠き膜が残りの卵黄袋膜にまだ付着しているかどうかを目視検査します。このような場合は、はさみを使用して追加のカットを作成します。すくいながら、スプーンを少し傾けてできるだけ多くの卵黄を取り除きますが、乾かさないでください。切り出した胚とCAMを入れた膜を1Lシャーレに移し、37°C PBSに沈め、スプーンを取り出した。 胚とCAMを含む膜を37°CのPBSに沈めたら、小さなピンセット(図1F)を使用して膜の一方の端をつかみ、膜の周りをゆっくりと渦巻いて、まだ付着している卵黄を取り除きます。 卵黄をすべて取り除いたら、小さなピンセットを使用して胚とCAMを含む膜を移動し、音響膜を備えたホルダーの上に配置します。 昆虫標本ピンを1本使用して、胚とCAMを含む膜を片隅に固定します。CAMの血管に穴を開けることは避け、メンブレンのみを固定してください。 2番目の昆虫標本ピンを使用して、胚とCAMを含む膜を斜め反対側の角に固定します。 胚とCAMを含む音響膜でホルダーを37°C PBSからゆっくりと持ち上げます。ホルダーを少し傾けて、ほとんどのPBSを取り除きます。 小さなピンセット(図1F)を使用して、胚とCAMを含む膜を引き伸ばして、音響膜を備えたホルダー全体に均等に分配し、膜の残りの部分を固定します。胚とCAMを含む膜が平らになるようにわずかに引き伸ばされていることを確認してください(図4C)。 胚とCAMを含む膜を固定した音響膜を備えたホルダーを、37°Cに保たれた顕微鏡セットアップに入れます。 カバーガラスまたは音響的および光学的に透明な膜(目的の対物レンズと超音波の使用に応じて)を胚またはCAM(図4D)の関心領域の上に配置して、光学的視覚化を可能にします。 ニワトリ胚および/またはCAM血管の超音波イメージングニワトリ胚およびCAM血管の側面からの超音波イメージングセクション1.2、1.3、または1.4の説明に従って卵の含有量を取り出します。ただし、標準の計量ボートは使用しないでください。代わりに、音響的に透明な壁が1つあるカスタムメイドの計量ボートを使用してください。注:標準の計量ボートは、計量ボートの片側を切り取り、エポキシ接着剤を使用して接着されたポリエステルホイルの窓と交換することによって調整されました。 好みの超音波トランスデューサを37°Cの水浴に沈め、必要なスタンドオフ距離で目的の場所に配置します。 透明な壁が探触子に面するように計量ボートを水浴に入れます。計量ボートが探触子と同じ高さになるのに十分な深さであることを確認してくださいが、計量ボートに水が入らないようにします(図5A)。 必要に応じて、顕微鏡やレーザーなど、胚またはCAM血管の上部に別のセットアップを追加します(図5A)。 音響干渉のない胚およびCAM血管の上部からの超音波イメージング2 Lビーカーグラスに37°C PBSを充填します。500 Lビーカーグラスの底に2 mLビーカーグラスを逆さまに置きます。500mLビーカーグラス内の空気を避けてください。注意: 500 mLビーカーガラスは、卵の含有量が入った計量ボートをPBS表面に近づけることを目的としています。ビーカーを他のサイズの物体に置き換えることにより、トランスデューサーと卵の含有量の間の距離を変えることができます。 充填した2 Lビーカーグラスと500 mLビーカーグラスを37°Cの水浴に入れます。 セクション1.2、1.3、または1.4の説明に従って卵の含有量を取り出します。 卵の内容物を37°C PBSで濡らし、胚を透明な粘着フィルムで覆います。これは、胚を同じ位置に保ち、胚が回転したり浮いたりするのを防ぐために行うことができます。注意: 卵の内容物をPBSで濡らすことで、べたつきが少なくなり、卵の内容物を透明な粘着フィルムで覆いやすくなります。 卵の含有量が入った計量ボートを直径90mmのペトリ皿に入れ、ペトリ皿をPBSにゆっくりと沈めます(図5B)。注意: 2つのclを使用しますamp 向かい合ったペトリ皿の側面に、ペトリ皿を沈めやすくなります。 超音波トランスデューサを希望のスタンドオフ距離に配置します。 可動トランスデューサーによるニワトリ胚およびCAM血管の超音波イメージングセクション1.2、1.3、または1.4の説明に従って卵の含有量を取り出します。 小さなガラスビーカーで溶液を80〜95°Cまで加熱することにより、デミ水中の2%アガロース溶液を調製します。ガラスビーカーを溶かしたアガロース溶液で流水タブで冷却します。 アガロース溶液を平らな容器に注ぎ、厚さ約1mmのアガロースパッドを作ります。完全に冷却してセットしたら、メスを使用してアガロースパッドを希望のサイズにカットします。注意: アガロースパッドの厚さを変更して、超音波トランスデューサーが正しく機能するために必要な目的の焦点距離を得ることができます。 アガロースパッドを胚とCAMの上に置きます(図5C)。アガロースパッドの上部に37°CのPBSを~30 μLを数滴加え、アガロースパッドと探触子の間に薄いPBS層を作成します。注意: PBSを使用すると、探触子がアガロースパッドに付着するのを防ぐことができます。これは、例えば、モーターを使用して2次元トランスデューサを機械的に動かし、3次元スキャンを行う場合に有益です(図9B)11。トランスデューサを移動する必要がない場合は、PBSを超音波ゲルで置き換えることもできます。 目的の超音波トランスデューサーを配置します。