Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen

De volgende studie is goedgekeurd door de instellingscommissie van het Universitair Medisch Centrum Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 en A 2019-0222). Bovendien zijn alle veterinair relevante procedures goedgekeurd door de Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern onder de registratienummers LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 en 7221.3-1-007/19. 1. Experimentele vereisten Voldoe aan een aantal belangrijke randvoorwaarden om een biobank op te richten en te onderhouden. Gebruik een kliniek met een chirurgische afdeling en voldoende oncologische resecties samen met een goed uitgerust lab en voldoende academisch personeel. Een goede infrastructuur en een stevige contacten met een samenwerkende pathologieafdeling zijn verdere voorwaarden. Gebruik voor in vivo onderzoek een dierenfaciliteit met huisvestingsomstandigheden die geschikt zijn voor immunodeficiënte muizen. Krijg toestemming voor elk onderzoek naar van patiënten afgeleid materiaal van een ethische commissie voor de gezondheidszorg. Goedkeuring verkrijgen voor elk in vivo onderzoek van de bevoegde autoriteit volgens de lokale wettelijke voorschriften. 2. Monsterverzameling De dag voor de operatie Evalueer alle patiënten met reseceerbare colorectale of pancreaskanker en/of overeenkomstige uitzaaiingen om in aanmerking te komen voor biobanking. Vermijd het opnemen van gevallen met neoadjuvante voorbehandeling, zeer kleine tumoren, tumoren van onzekere waardigheid of laesies die eerder gedeeltelijk endoscopisch zijn gereseceerd. Krijg schriftelijke toestemming van de patiënt tijdens de discussie over geïnformeerde toestemming over de chirurgische procedure. Informeer tijdig alle betrokken chirurgen, het laboratoriumteam en de patholoog. Voorbeeldverwerving Informeer alle begeleiders in de operatiekamer (OR) direct voor aanvang van de chirurgische ingreep over de weefselafname voor de biobank.OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het weefsel niet in formaline mag worden bevestigd. Als het weefsel wordt ondergedompeld in formaline, wordt het ongeschikt voor geïntegreerde biobanking. Teken 40 ml gehepariniseerd bloed (2 x 20 ml spuit) en een standaard serumbuis van 7,5 ml onmiddellijk na verdovingsinductie en breng snel over naar het lab voor PBL-isolatie en serumverwerking (zie stap 3-4). Haal het gereseceerde monster rechtstreeks uit de operatietafel, plaats het in een geschikte container en breng het naar de pathologische afdeling. Noteer het tijdstip van onthechting van de circulatie, resectie en aankomst bij pathologie.OPMERKING: De geschiktheid van het monster voor biobankieren moet worden beoordeeld door de samenwerkende patholoog die een stukje tumor en niet-kwaadaardig weefsel ontleedt. Verwijder geen delen van het monster zelf die het daaropvolgende pathologische rapport in gevaar kunnen brengen. Plaats beide weefselstukken in een aparte polypropyleenbuis van 15 tot 50 ml met 10 tot 30 ml weefselopslagoplossing (of DPBS) op ijs. Noteer het tijdstip van ontvangst en breng de monsters onmiddellijk naar het lab.OPMERKING: De volgende protocolstappen 3-6 moeten onder strikte steriele omstandigheden in een lamineerstroomkast worden uitgevoerd. Gebruik alle vloeistoffen op kamertemperatuur. 3. Serumverwerking Centrifugeer de serumbuis van 7,5 ml bij 1128 x g en 4 °C gedurende 15 minuten in een voorgekoelde centrifuge. Aliquot 1 ml serum per tube in voorgelabelde cryotubes en invriezen in vloeibare stikstof. 4. Isolatie van PBL door dichtheid gradiëntcentrifugatie OPMERKING: Werk parallel met elk van de twee spuiten van 20 ml. Vul 20 ml ge hepariniseerd bloed in een 50 ml polypropyleen buis en voeg 15 ml DPBS toe. Neem 15 ml Pancoll met een serologische pipet, plaats de pipet voorzichtig helemaal tot aan de bodem van de polypropyleenbuis en laat de Pancoll heel langzaam los om een laag onder de bloed/DBPS-kolom te vormen. Centrifugeren bij 375 x g gedurende 15 minuten zonder rem. Aspireer en breng de ondoorzichtige interfaselaag tussen de middelste en bovenste kolom van beide monsters over in een verse polypropyleenbuis van 50 ml en vul met DPBS tot 50 ml. Centrifugeren bij 270 x g gedurende 15 minuten met rem. Aspireer en gooi het supernatant weg, resuspendeer de celkorrel in 4,5 ml vriesmedium. Aliquot 1,5 ml van de suspensie per cryobuis, sluit de buizen goed en plaats ze in een vriesbak die geschikt is voor langzaam invriezen en bewaren bij -80 °C. 5. Weefselverwerking OPMERKING: Begin met het genereren van snap bevroren monsters van tumor en gezond weefsel om de integriteit van nucleïnezuren te behouden. Het weefselexemplaar van de tumor Breng het tumormonster met verschillende ml weefselopslagoplossing over van de polypropyleenbuis naar een Petrischaal. Spoel indien nodig af met DPBS. Raak het monster niet aan en gebruik twee steriele scalpels om het weefsel te behandelen. Vermijd uitdroging op elk gewenst moment. Weeg het tumormonster op een handige schaal in een aparte schaal en noteer het weefselgewicht. Evalueer de grootte, vorm en weefselkwaliteit van het tumorweefsel voordat u gaat snijden. Streef ernaar om ten minste één stuk te verkrijgen ter grootte van een pinhead voor het invriezen van snap en vier kubussen van ongeveer 30 mm3 (randlengte 3 x 3x 3 mm) elk voor vitale cryopreservatie. Genereer zoveel mogelijk 30 mm3 -kubussen in viervoudige blokjes en genereer één stuk voor snap freezing per 5 viervoudige. Houd er ook rekening mee dat necrotische porties moeten worden afgesneden, zodat de kubussen alleen uit vitaal weefsel bestaan. Genereer plakjes met een dikte van 3 mm. Snijd necrotische porties af, te onderscheiden als gelachtige of vloeibare massa, en snijd de plakjes in blokjes van de twee gewenste maten.OPMERKING: Gooi op dit moment geen weefsel weg. Snap bevriezen Label cryotubes dienovereenkomstig (zie stap 7.7). Plaats een klein stukje weefsel per voorgelabelde cryobuis. Dompel de monsters onmiddellijk enkele minuten onder in vloeibare stikstof en bewaar ze vervolgens bij -80 °C. Cryopreservatie van vitaal weefsel Label cryotubes dienovereenkomstig (zie stap 7.7) en vul elk met 1,5 ml vriesmedium. Plaats de vriesbak naast de bank.OPMERKING: Volg de volgende stappen zo snel mogelijk. Aangezien de DMSO in het vriesmedium cytotoxische eigenschappen heeft, mag de tijd van het weefsel dat zonder de juiste koeling in het vriesmedium wordt ondergedompeld, niet langer zijn dan 2 minuten. Schik de 30 mm3 blokjes in viervorupten. Duw necrotisch weefsel en andere overblijfselen naar de rand van de schaal, maar gooi ze niet weg. Schep de kubussen met het scalpelblad en breng 4 blokjes per cryobuis over. Zorg ervoor dat de tumorstukken volledig ondergedompeld zijn in het vriesmedium. Sluit de buizen goed en plaats ze in een vriesbak die geschikt is voor langzaam invriezen en bewaar ze in een vriezer van -80 °C. Breng cryotubes over in een geschikt opslagsysteem voor langdurige opslag bij -140 °C of lager. Documentatie in het laboratoriuminventarisbeheersysteem is verplicht. Gezond weefselmonster: Herhaal stap 5.1.1. tot 5.1.6.4 voor het gezonde weefselmonster. 6. Primaire celcultuur Desintegreer de overblijfselen van het tumorweefsel, inclusief het necrotische schroot, in de Petrischaal met de scalpels in stukken zo klein mogelijk. Plaats een steriele celzeef (100 μm poriegrootte) bovenop een polypropyleenbuis van 50 ml. Gebruik een serologische pipet om 5-10 ml DPBS aan de Petrischaal toe te voegen, drijf de weefselresten en pipet op en neer om een suspensie te genereren. Breng de suspensie met de pipet over op de celzeef. Herhaal stap 6.3-6.4 totdat alle weefselresten uit de Petrischaal zijn opgelost. Gebruik de zuiger van een eenrichtingsspuit van 20 ml om de cel- en weefselsuspensie door de celzeef te persen. Spoel af met 5-10 ml verse DPBS, gooi de celzeef weg en sluit de buis goed. Centrifugeer de suspensie gedurende 5-10 minuten op 180 x g. Bereid een collageen-I voorgecoat 6 goed plaat met 1,5 ml medium per put. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 3 ml DPBS of medium en voeg 500 μL van de suspensie toe aan elke put. Plaats de plaat in de incubator (100% luchtvochtigheid, 5% CO2,37 °C) Controleer de plaat dagelijks op celgroei en verontreiniging.OPMERKING: Verdere celcultus tot het punt van vestiging van een permanente cellijn wordt hier niet beschreven. 7. PDX-generatie Voer in vivo experimenten alleen uit door naar behoren gekwalificeerde personen die voldoen aan de vereisten van de bevoegde autoriteit van uw rechtsgebied. Huis immunodeficiënte muizen onder specifiek ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden die voldoen aan de eisen van de gebruikte muizenstam. De hygiënische maatregelen omvatten individueel geventileerde kooien, autoclaved voedsel, water en nestmateriaal, evenals een veiligheidsluchtslot en het dragen van persoonlijke, beschermende apparatuur. Autoclaaf alle instrumenten van tevoren en gebruik slechts één set instrumenten voor elk tumorgeval om kruisbesmetting te voorkomen. Behandel het tumorweefsel zo aseptisch mogelijk. Alle hieronder genoemde plastic voorwerpen moeten steriel, voor eenmalig gebruik en na elke operatie worden weggegooid.OPMERKING: Bepaald door de methode om vier tumorweefselstukken per cryobuis in te vriezen, vereist de PDX-generatie altijd twee muizen per monster, idealiter resulterend in vier PDX-tumoren. Kies de gewenste primaire tumor voor engraftment via het laboratoriuminventarisbeheersysteem en breng het monster (vitaal bewaard tumorweefsel) over van de hoofdopslagtank naar een draagbare vloeibare stikstofcontainer (Tussentijdse opslag bij -80 °C op droogijs is ook handig). Trek persoonlijke beschermingsmiddelen aan voordat u de SPF-sectie betreedt (scrubs, klompen, schort, haarbedekking, chirurgisch masker en overschoenen), desinfecteer uw handen en alle apparatuur. Matrigel weken Verwijder de cryobuis uit de vloeibare stikstofcontainer en wacht op ontdooiing van het monster. Label een 50 ml polypropyleen buis en vul met 35 ml DPBS. Kantel de cryobuis op en neer en breng de inhoud onmiddellijk over naar de polypropyleenbuis zodra de weefsel-medium-slush kan worden verschoven. Spoel voorzichtig de stukjes tumorweefsel, gooi het hoofdvolume uit de buis in een apart vat, sluit het deksel en plaats de buis naast elkaar, zodat de vier weefselstukken zich in het deksel verzamelen. Plaats een Petrischaal op de koelaccumulator en plaats 100 μL Matrigel als een enkele druppel in het midden. Gebruik anatomische tang om de tumorstukken over te brengen naar de Matrigel. Zorg ervoor dat elk stuk volledig bedekt is met Matrigel. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Muizenanesthesie (2 muizen per monster, werk parallel) Bereid een 3:1- bouillon van een ketamine (100 mg/ml) en xylazine (20 mg/ml) verdovingsoplossing. De aanbevolen dosis is 90/6 mg/kg lichaamsgewicht. Weeg de muis af en stel de benodigde verdovingsoplossing op in een insulinespuit voor eenmalig gebruik. Plaats de muis op het rooster van de kooi, trek voorzichtig aan zijn staart met één hand om een voorwaartse beweging op te wekken en krab tegelijkertijd de nek met een knijpgreep van de andere hand. Til de muis van het raster op en draai de hand, zodat de rug van dat dier op je handpalm rust. Immobiliseer een van de achterpoten met je pink en injecteer de verdovende middelen intraperitoneaal. Leg de muis terug in zijn kooi en wacht op verdovende inductie. Plaats de verdoofde muis op de verwarmingsplaat en bedek de ogen met zalf om hoornvliesschade te voorkomen. Asses de diepte van anesthesie door zachtjes knijpen de achtervoet van de muis met chirurgische tang.OPMERKING: Afwezigheid van beweging duidt op diepe narcosis. Elke vorm van beweging vereist meer tijd voor het bereiken van de gewenste verdovende diepte of een extra dosis verdovingsmiddelen. Chirurgische ingreep Vorm een huidplooi door de nek van de muis te knijpen en injecteer de microchip subcutaan met de applicator (Zie stap 9 voor programmeerdetails) Scheer indien nodig de flanken van de muis (NMRInu/nu muizen hoeven niet te worden geschaafd), breng povidone-jodium aan met een wattenstaafje en gebruik chirurgisch doek om een steriel veld te creëren. Til de huid van de flank op met chirurgische tang, maak een kleine incisie van ongeveer 4 mm en vorm een kleine onderhuidse zak door stompe voorbereiding met een schaar. Stop één tumorstuk in elke zak en plaats het aan de achterkant. Knip het uiteinde van een pipettip van 100 μL en aspirateer de resterende Matrigel uit de Petrischaal en breng deze gelijkmatig aan in elke huidzak. Sluit de wonden met eenvoudige onderbroken hechtingen en breng spuitverband aan. Scan de microchip en controleer de validiteit van muis- en tumor-ID. Bereid een nieuwe kooi voor met vers beddengoed en nestmateriaal, evenals een knaagstok. Vouw een “kussen” uit papieren handdoeken en leg de muis neer met een verhoogde kop onder een infrarood warmtelamp. Meng 0,25 ml trimethoprim/sulfamethoxazol (400 mg/80 mg) met 100 ml drinkwater en dien het toe via de drinkfles. Houd er rekening mee dat één muis dagelijks ongeveer 150 ml per kg lichaamsgewicht verbruikt.OPMERKING: Aangezien het subcutane PDX-model niet geassocieerd is met postoperatieve pijn, noch tijdens het wondgenezingsproces, noch tijdens de uitgroei van de tumor, is postoperatieve analgesie niet vereist. Houd er rekening mee dat de richtlijnen voor dierenwelzijn van uw instelling/autoriteit kunnen verschillen. Monitoring van proefdieren Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood. Dit kan worden gedelegeerd aan gekwalificeerde dierenverzorgers. Houd de postoperatieve antibioticabehandeling met de bovengenoemde dosering gedurende 4 weken. Vervang het antibioticummengsel twee keer per week. Meet de tumorgrootte minstens één keer per week, idealiter dagelijks, met een remklauw (tumorvolume = 0,52 x lengte x breedte x hoogte [mm3]) en noteer in de database. 8. PDX oogsten en verwerken Oogst en verwerk de PDX tumor, wanneer:De tumorgrootte bereikt het doelvolume van 1.500 mm3.Het tumordragende dier vertoont tekenen van nood en/of ziekte en de behandeling is zinloos.De tumor wordt zwerend of dringt de huid van de muis binnen. Lees de microchip uit om de juiste PDX te identificeren. Euthanaseer de muis volgens een wettelijke methode (afhankelijkvan de nationale richtlijnen) zoals bijvoorbeeld CO 2-asphyxatie of ketamine/xylazine-injectie gevolgd door cervicale dislocatie. Til de huid op met chirurgische tangen aan de flanken en inciseer met een metzenbaum schaar een paar millimeter ver van de tumor. Maak de huid boven de tumor los door middel van een stompe voorbereiding, pak de tumor vervolgens voorzichtig vast met anatomische tang en maak de tumor los van de oppervlakkige fascia van het lichaam. Spoel de tumor af met DPBS, doe deze in een Petrischaal en verwijder aangrenzend bindweefsel. Voer op dit moment een van de volgende stellingen uit: Snijd 30 mm3 kubussen en maak nieuwe PDX (Ga verder met protocol in punt 7.7.4). Snijd de tumor in plakjes, die vervolgens worden overgebracht naar histologiecassettes en bewaard in 4% formaldehyde voor latere paraffine-inbedding. Behoud de tumor in een buis met weefselopslagoplossing om deze toe te voegen aan de biobank (Ga verder met het protocol in stap 3.) en/of maak PDX-afgeleide cellijnen (Ga verder met het protocol in stap 4.) 9. Biobank en datamanagement Wijs een interne ID toe aan elke tumorgeval volgens tabel 1. Laboratoriumlocatie/naam kanker entiteit aaneengesloten zaaknummer Specificatie opeenvolgend nummer C=colorectaal _Met=Uitzaaiingen P=pancreas _Tu=Tumor Voorbeeld: HROC389_Met2 = Rostock, colorectale kanker, geval 389, tweede uitzaaiingen Tabel 1: Definitie van de voorbeeld-ID. Bewaar de toestemming van de patiënt in elektronische en papieren vorm samen met de tumor-ID. Verzamel zoveel mogelijk klinische gegevens en sla ze geanonimiseerd en afzonderlijk op. Gebruik een datamanagementsoftware (bijv. Freezerworks) of andere en maak een interface met een labelprintsoftware om temperatuurbestendige, zelfklevende streepjescodelabels te genereren. Voeg een nieuw monster toe door de gegevensbeheersoftware te openen, definieer het monstertype en noteer de volgende informatie: tumor-ID, weefseltype, bevriezingsmethode, datum, verantwoordelijke werknemer, passagenummer, muis-ID en muisstam. Wijs de monsters toe aan specifieke posities in de opslagtank. Tracing en monitoring van PDX (Geldt voor stap 7-8) Gebruik een MS Access-databank (of een vergelijkbaar systeem) op een draagbaar, Bluetooth-apparaat (laptop of tablet) om tumor-ID, datum van implantatie, datum van euthanasie, muisleeftijd en -stam en tumorgroei in de loop van de tijd vast te leggen. Sluit de microchiplezer aan op het apparaat en lees de microchip uit voordat u deze implanteert. Wijs een specifieke ID toe aan elke muis; we gebruiken de volgende regeling: (zie tabel 2 hieronder) Noteer na implantatie de ID samen met de muiskenmerken in de database. Lees de microchip opnieuw en controleer of de specificaties van de microchip, de databank en het cryotube-label consistent zijn. Maak dienovereenkomstig een label voor elke muizenkooi.OPMERKING: Om een fysieke back-up te maken, plakt u de cryotube-labels met de bijbehorende microchiplabels in een boekje en noteer datum en muisspanning. Om de tumorgroei van de individuele PDX te volgen, scant u de microchip van de muis met de lezer verbonden met het databaseapparaat voor identificatie en registreert u elke week de tumorgrootte gemeten per remklauw. Plan het ideale tijdspunt van PDX-oogst door de groeicurve van de tumor te analyseren. Tumor-ID Voorafgaande opslag in N2 (=f) Passagenummer (=T) opeenvolgende muisnummer (=M) Voorbeeld: HROP12 fT0 M1 = Rostock, alvleesklierkanker, geval 12, gegenereerd uit bevroren primair weefsel, eerste passage, muis 1. Tabel 2: Definitie van de PDX-ID.