살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법
Summary
다음 작업에서는 대장암과 췌장암의 대형 바이오뱅크 설립에 필요한 연속적인 단계를 설명합니다.
Abstract
암의 개별 적인 속성 및 이질성에 관하여 증가하는 지식의 관점에서, 개인화한 약의 신흥 필드는 전임상 연구를 위한 발판이 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 우리는 1 차종양 조직, 정상 조직, 세라, 고립 된 말초 혈액 림프구 (PBL), 환자 유래 제노 이식 (PDX), 뿐만 아니라 1 차 및 이차 암 세포주로 구성된 대장암 및 췌장암의 바이오 뱅크를 설립했습니다. 원래 종양 조직이 제한되어 있고 1차 암 세포주의 확립속도가 여전히 상대적으로 낮기 때문에, PDX는 바이오뱅크의 보존 및 확장뿐만 아니라 이차암 세포주의 생성을 허용한다. 또한 PDX 모델은 전임상 약물 검사를 위한 이상적인 생체 내 모델로 입증되었습니다. 그러나 바이오뱅킹은 신중한 준비, 엄격한 지침 및 잘 조율된 인프라가 필요합니다. 콜절제술, 십이지장 생성 절제술 또는 절제된 전이 표본은 절제 직후 수집되어 병리학 부서로 옮겨질 수 있습니다. 해부를 수행하는 출석 병리학자의 재량에 따라 편견없는 조직 병리학 보고서의 우선 순위를 존중하는 것은 작은 종양 조각 및 비 종양 조직을 수확합니다.
괴사 부품은 버려지고 나머지 종양 조직은 작고 동일한 큐브로 절단되고 나중에 사용하기 위해 냉동 보존됩니다. 추가적으로, 종양의 작은 부분은 1 차적인 암 세포 배양을 위해 다진 및 긴장됩니다. 추가적으로, 수술 전 및 수술 후 환자에게서 뽑아낸 혈액 샘플은 혈청 및 PBL을 얻기 위하여 처리됩니다. PDX 이식의 경우, 냉동 보존 된 표본은 면역 결핍 마우스의 측면으로 해동되고 이식됩니다. 결과 PDX는 “기증자” 종양의 역사학을 밀접하게 재구성하고 후속 xenografting 또는 나중에 사용하기 위해 냉동 보존에 사용될 수 있습니다. 다음 작업에서, 우리는 대장암과 췌장암의 큰 바이오 뱅크의 생성, 유지 보수 및 관리의 개별 단계를 설명합니다. 또한 바이오뱅킹과 관련된 중요한 세부 사항과 주의 사항을 강조합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 암의 형태학, 임상 및 유전 적 특성에 대한 축적 된 지식은 이질성, 개별 질환으로 암의 개념으로 이어졌습니다. 결과적으로, 신생물의 돌연변이 특성화는 임상 및 병리학적 특징 외에도 임상 의사 결정에 중요성을 얻고 있으며 다양한 분자 변경을 위해 많은 표적 치료법이 개발되었습니다. 예를 들어, 대장암 치료에서 세툭시맙의 효능은 KRAS 및 PIK3CA 돌연변이 상태1의분석에 의해 예측될 수 있다. 정밀 의학은 각 환자에서 가장 높은 치료 반응을 제공하고 불부한 치료법2의독성을 피하기 위해 맞춤형 접근 방식을 목표로합니다. 바이오뱅크에는 임상 데이터와 연결된 암 환자의 조직, 혈액 및 기타 생물학적 물질이 포함되어 있어 번역암 연구를 위한 훌륭한 도구입니다. 많은 수의 임상 샘플로 인해 바이오뱅크는 희귀하지만 잠재적으로 약물이 가능한 돌연변이의 검출을 가능하게 하며, 이는 개별 환자에게 새로운 치료 기회를제공한다 3.
가능한 한 광범위하게 종양학 연구 스펙트럼을 커버하기 위해, 우리는 단독으로 견본 수확에 우리의 활동을 억제하지 않았습니다, 그러나 환자 유래암 세포주 및 xenografts (PDX)의 설치에 집중했습니다. 전통적인 2D 세포주 체외 연구의 코너 돌 남아 있으며 대규모 약물스크리닝4,5에대한 최고의 선택이다. 또한, 세포주 분석은 종종 더 쉽고 저렴하며 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 환자 유래 말초 혈액 림프구(PBL)가 가능하기 때문에 종양 면역학도 시험관 6에서연구될 수 있다. 그러나, 시험관 내 또는 생체 내 실험에 기반한 세포에서 유망한 전임상 효과성을 가진 새로 개발된 약물의 대다수는 임상 시험7에서실망스러운 결과를 보였다. 대조적으로, 생체 내 PDX에 기초한 전임상 연구는 훨씬 더 충실하게 항신성형제의 임상 활성을 반영하였다8. PDX 조직은 기증자 종양의 조직학적 및 분자 특성을 밀접하게 반영하기 때문에 PDX 모델은 바이오 뱅크의 무결성을 유지하고 연구 그룹과 기관 간의 샘플 교환을 허용하기 위해 종종 매우 제한된 양의 실행 가능한 종양 조직을 전파하는 좋은 방법입니다. 더욱이, PDX 조직에서 유래된 암 세포주9보다 훨씬 쉽게 확립될 수있다. 최근 몇 년 동안, 우리의 워킹 그룹은 문제의 모든 생물학적 샘플에 대한 작업 흐름을 단계별 표준화 및 최적화하여 포괄적 인 통합 대장암 및 췌장암 바이오 뱅크를 설립했습니다(그림 1).
그림 1: 바이오뱅크의 워크플로우 및 조직은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
살아있는 바이오 뱅크의 세대는 개인 정보 보호, 의료법 및 동물 복지, 좋은 인프라 및 잘 조정 된 팀의 법적 규정을 준수하는 것 외에도 전제됩니다. 조직 기증을 위해 개별 환자의 적합성을 아주 잘 평가할 수 있기 때문에 연구 절차에 있는 외과 직원의 일부를 직접 관련시키는 것이 유리하다는 것을 입증했습니다. 더욱이, 환자는 그들의 서면 승인이 외과 통보 동의 토론의 과정 내에서 얻어지는 때, biobanking와 더 자주 동의하는 경향이 있습니다. 시간과 자원을 절약하기 위해, 아마도 종양 조직의 부족한 양을 산출 할 경우는 바이오 뱅킹을 위해 선택해서는 안됩니다. 표본 획득에 관해서, 격언 “통신은 핵심입니다”간단하지만 종종 간과 진실이다. 그것은 단지 평소와 같이 진행하고 절제술 견본에 포름알데히드를 추가하여 처음부터 바로 표본을 망치기 위하여 단 하나 통보되지 않은 극장 간호원 또는 외과 동료를 취합니다. 따라서 관련 직원의 모든 구성원이 바이오 뱅킹을 위한 SOP에 익숙해지는 것이 절대적으로 중요합니다. 외과 의사는 예정된 조직 수집에 대한 절차의 시작 전날과 바로 눈치 채야한다. 또한 바이오뱅킹에 선정된 경우는 전자 또는 계획에서 강조표시되어야 합니다. 외과 표본에서 조직 수확은 병리학자에 의해 수행되어야한다. 첫째, 이것은 조직 수확이 최종 병리학 적인 보고를 방해하지 않는다는 것을 보장할 것입니다. 둘째, 이것은 실행 가능한 암 조직의 적당한 양으로 조직을 수신의 확률을 증가시킵니다. 특히 뚜렷한 담수화 반응과 빈번한 괴사 부위를 가진 췌장암에서는, 실행 가능한 부분은 훈련되지 않은 눈을 위해 매크로를 식별하기 어렵다. 이 규칙에 예외로, 큰 간 또는 폐 전이에서 조직 블록, 외과 마진이 매크로로 정의 될 수있는 경우, 외과 의사에 의해 때때로 “백 테이블”을 절제 할 수있다. 총 중각 절제술(TME)에 의해 제분된 직장암은 파라핀 포함 이전에 절제된 표본에서 채취된 조직 수확이 TME 품질 평가를 방해할 수 있기 때문에 바이오뱅킹에 적합하지 않을 수 있다. 대안적으로, 바이오뱅킹을 위한 조직은 직장암의 트랜스아날 생검에 의해 취득될 수 있다.
본래 종양으로부터 유래된 1차 세포 배양을 위한 확립비율은 일반적으로 낮다. PDX 유래, 이차 세포 배양은 더 성공적으로 설치될 수 있다. 각 경우에 대해 다른 매체를 테스트하고 수확 된 조직이 거의 멸균되지 않으므로 오염을 최소한으로 줄이기 위해 첫 번째 통로에 대한 항생제 보충제를 사용하는 것이 좋습니다. 성공적인 전파 후, 각 개별 세포주 FACS 분석에 의해 암 세포주로 확인 하 고 정기적으로 마이코 플라즈마 오염에 대 한 테스트 해야 합니다. 교차 오염을 제외하려면 정기적인 STR 분석이 좋습니다. 1차 세포주 및 이차 세포주를 위한 설립 프로토콜이 지속적으로 최적화를 받는다는 점에 유의해야 한다. 단일 미디어의 구성 및 성공률에 대한 세부 사항은 이 작품의 범위를 분명히 벗어나 별도로 게시될 것입니다.
PDX 이식의 경우 종양 조직은 10% DMSO 또는 유사한 동결 매체를 통해 태아 종아리 혈청에서 절제 후 직접 이식하거나 냉동 보존될 수 있다. 종양 조직 수확 시 즉시 이식하면 물류 및 실험실 직원에게 부담을 주며, 냉동 보존 후 xenografting 결과는 10전혀열등하지 않습니다. 더욱이, 종양 이식 전에 마트리겔에서 조직의 배양, 크게 이식 속도 증가12. 명확한 병리학적 발견과 잘못 수집된 조직 표본의 즉각적인 폐기에 따라 이식이 지연되는 것이 좋습니다. 수령 마우스의 면역 결핍으로 1 차 생생의 성공률이 증가하기 때문에, 우리는 최초의 PDX 통로에 NSG 마우스를 사용하는 경향이 있습니다. 첫 번째 성공적인 PDX 이식 후, NMRInu/nu 마우스는 후속 통로 및 조직 확장을 위해 사용될 수 있고 사용해야 합니다. 이 균주는 NSG 또는 유사한 면역 결핍 균주에 비해 더 강력하고 저렴하며 번식하기 쉽지만 여전히 합리적인 이식 속도를 보여줍니다. 또한, 그것의 누드 이식 및 종양 성장 모니터링을 촉진. 후속 구절에서 이식 속도를 높이기 위해, 우리는 특히 느린 성장 PDX및 낮은 기본 이식 성공률을 가진 경우에 대 한, 가능한 한 마우스를 호스트 하는 갓 수확 PDX 조직의 직접 전송 하는 것이 좋습니다. 콜린스와 랭은 최근 대장 PDX 설립의 14 연구를 검토하고 68 %의 중간 PDX 설립 비율로 14에서 100 %의 다양한 접목 비율을보고, 후자는 우리의 연구 결과와 일치되고13. 문헌에 따라, 우리는 대장암 PDX14에비해 췌장의 낮은 설립 비율을 관찰했다. 숙주 마우스 균주 및 종양 실체에 관계없이, 이식 측에서 인간, 엡스타인-바 바이러스(EBV)-연관된 B세포 림프종 및 뮤린 림프종의 아웃성장은 중요한 함정15,16을제기한다. 인식되지 않는 경우, 이러한 종양은 후속 구절을 “오염”할 수 있으므로 연속 결과를 혼동 할 수 있습니다. 특이한 빠른 PDX 성장과 자궁 경부의 붓기, axillar 및 inguinal 림프절은 뮤린 림프종 성장의 강한 지표이지만 PDX의 정기적 인 조직학적 검사는 그럼에도 불구하고 권장됩니다. 더욱이, PDX와 해당 기증자 환자 사이의 유전 적 일치는 STR 분석에 의해 정기적으로 테스트되어야한다. 이상적으로, 바이오뱅크는 환자 특성(일반 정보, 생존, 재발 자유로운 생존, 치료, 이차 신화증 등)을 포함하는 임상 데이터베이스에 연결되어야 한다. 개인 정보 보호의 법적 규정과 이러한 익명화된 데이터 기반의 부족으로 인해 당사의 임상 데이터 세트는 협력 의사가 정기적으로 관리하고 수동으로 업데이트합니다.
기존의 바이오뱅크는 천문대 연구로 제한되어 있지만, 살아있는 바이오뱅크는 체외 및 생체 내정간섭의 기회를 제공합니다. 환자 유래 세포주근본적인 연구, 고처리량 약물 스크리닝 및 새로운 제약에이전트4의평가를 위한 중요한 도구이다. 그러나 상응하는 PDX 모델은 원래 종양17,18의 공증을 면밀히 재구성하고19,20의여러 구절에 걸쳐 높은 유전적 안정성을 나타내기 때문에 중요성이 커지고 있다. 우리의 PDX 바이오 뱅크는 전임상 및 기초 연구를위한 우수한 플랫폼으로입증6,21. 더욱이, 대형 PDX 수집은 환자 집단의 개별 간 이질성을 적절히 반영하기 때문에, PDX 임상시험(PCT) 접근법(치료당 모델당 1마리)은 신약 및조합요법에대한 임상반응의 충실한 예측을 허용하기 때문에 약물 개발에 대한 중요성을 얻고 있다. 우리는 또한 현재 작은 PCT 예심에 있는 새로운 실험적인 약을 평가하고 있습니다.
이러한 유망한 결과에도 불구하고, 12.2개월의 중간 설립 기간은 PDX 모델의 임상 적용가능성을 항암 치료 옵션 테스트용 “아바타 마우스”로 방해하며, 적어도 즉각적인 보조 또는 신아드주반트 치료가 필요한환자(22)를대상으로 한다. 표준 PDX 모델의 추가 단점은 숙주 마우스의 면역 결핍으로 인한 면역 요법 테스트용 유용성이 부족하다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 여러 “인간화”마우스 균주가 개발되었습니다. 이들 마우스는 면역장애가 심하지만, PDX 에 이어 다양한 유형의 인간 골수유래 세포 또는 CD34+조혈줄기세포로 재구성될 수있으며,림프구 매개 세포독성 및 면역체크포인트 억제제 치료에 대한 치료 반응의 평가를 허용한다.
최근 몇 년 동안, 환자 유래 오르가노이드 (PDO)는 PDX와 경쟁하는 중요한 암 모델로 부상했습니다. 그대로 종양 조각에서 파생되고 세포외 매트릭스 스캐폴드에서 배양된 이 3차원 구조는 원래 종양의 조직학적 및 유전적 특성을 밀접하게 반영한다. 장기 확장 및 냉동 보존의 가능성은 PDO살아있는 바이오 뱅크26,27의이상적인 보충을 렌더링합니다. 비교적 높은 확립률 외에도, 여러 종양개체(28)의PDO에 대해 신뢰할 수 있는 약물 반응 예측이 보고되었다. 더욱이, PdOs는 종양 세포를 순환시키고 또한 대응하는 건강한 조직에서 organoids의 동시 설치가 가능하여 환자-개인 기준29,30에대한 치료 관련 독성의 평가를허용함으로써발생하였다. 그러나, 종래의 2D 세포 배양에 비해, 오르가노이드 배양은 시간과 자원이 소모되고 인공 세포외 매트릭스 화합물은 특정 분석절차(31)를방해할 수 있다. 더욱이, 암 오르가노이드는 건강한 상피(30)에서파생된 더 빠른 성장, 비 악성 오르가노이드에 의해 과성장에 취약하다. 기질, 혈관 및 면역 세포의 부족으로 인해, PdOs는 항 혈관 신생 면역 치료제의 테스트에 주로 적용되지 않습니다. 그러나 새로운 배양 방법은 시험관내종양 미세 환경을 모델링할 수 있게 하여 PDX모델(32)에대한 PDOs의 진정한 경쟁자가 되었다. 가까운 장래에 차세대 염기서열분석과 같은 강력한 유전 적 도구와 결합 된 환자 개인 종양 모델은 진정한 정밀 의학 및 맞춤형 치료 접근법으로가는 길을 열어 줄 것입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오의 녹음 및 편집에 대한 제니 버마이스터, 우리의 그래픽 조수를 인정합니다. 또한, 우리는 오랜 협력에 대한 외과 및 병리학 부서의 동료에게 감사드립니다. 또한 로스토크 대학교 IT 미디어 센터의 프로덕션 매니저인 마커스 뮐러(Marcus Müller)에게 오디오 녹음 장비를 제공하고 음질을 개선해 주신 것에 대해 감사드립니다.
자금 조달: 독일 암 원조 재단 (DKH e.V.), 교부금 번호 108446, 주 메클렌 부르크 – Vorpommern에서 번호 TBI-V-1-241-VBW-084를 부여 부분적으로이 연구에 자금을 지원.
Materials
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | — | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | — | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | — | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | — | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | — | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | — | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | — | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | — | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | — | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | — | label printer |
References
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