Yaşayan Bir Biyobankanın Oluşturulması ve Bakımı - Nasıl Yaparız

Aşağıdaki çalışma Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 ve A 2019-0222). Ayrıca, tüm veterinerlik ilgili prosedürler Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern tarafından LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 ve 7221.3-1-007/19 kayıt numaraları altında onaylanmıştır. 1. Deneysel Önkoşullar Biyobanka kurmak ve sürdürmek için birkaç önemli çerçeve koşulu karşılar. İyi donanımlı bir laboratuvar ve yeterli akademik personel ile birlikte cerrahi bölüme ve yeterli sayıda onkolojik reeksiyona sahip bir klinik kullanın. İyi bir altyapı ve işbirliği yapan bir patoloji bölümüyle sıkı bir irtibat daha önkoşuldur. In vivo araştırma için, immün yetmezliği olan farelere uygun barınma koşullarına sahip bir hayvan tesisi kullanın. Bir sağlık etik komitesinden hasta kaynaklı materyallerle ilgili herhangi bir araştırma için yetki alın. Yerel yasal düzenlemelere göre yetkili makamdan herhangi bir in vivo araştırma için onay alın. 2. Örnek toplama Ameliyattan bir gün önce. Rezeke edilebilir kolorektal veya pankreas kanseri olan tüm hastaları ve/veya ilgili metastazları biyobankalama uygunluğu için değerlendirin. Neoadjuvan ön tedavi, çok küçük tümörler, belirsiz haysiyetli tümörler veya daha önce kısmen endoskopik olarak reseksiyon edilmiş lezyonları içeren vakaları dahil etmekten kaçının. Cerrahi prosedür hakkında bilgilendirilmiş onam tartışması sırasında hastadan katılım için yazılı onay alın. İlgili tüm cerrahları, laboratuvar ekibini ve patologları zamanında bilgilendirin. Örnek alma Cerrahi işlem başlamadan hemen önce ameliyat odasındaki (AMELIYATHANE) tüm görevlileri biyobanka için doku toplanması hakkında bilgilendirin.NOT: Dokunun formalin ile sabitlenmemesi çok önemlidir. Doku formalin içine batırılmışsa, entegre biyobankalama için uygun olmaz. Anestezik indüksiyondan hemen sonra 40 mL heparinize kan (2 x 20 mL şırıng) ve standart bir 7,5 mL serum tüpü çekin ve PBL izolasyonu ve serum işleme için laboratuvara hızlı bir şekilde aktarın (bkz. adım 3-4). Resected numuneyi doğrudan ameliyat masasından alın, uygun bir kaba yerleştirin ve patoloji bölümüne götürün. Sirkülasyondan, rezeksiyondan ve patolojiye varıştan kopma zaman noktasını yazın.NOT: Numunenin biyo bankacılığa uygunluğu, bir dilim tümör ve kötü huylu olmayan dokuyu parçalayan işbirliği yapan patolog tarafından değerlendirilmelidir. Numunenin sonraki patolojik raporu tehlikeye atabilecek herhangi bir bölümünü kendiniz çıkarmayın. Her iki doku parçasını da 10 ila 30 mL doku depolama çözeltisi (veya DPBS) ile ayrı bir 15 ila 50 mL polipropilen tüpe buz üzerine yerleştirin. Makbuz saatini yazın ve örnekleri hemen laboratuvara aktarın.NOT: Aşağıdaki protokol adımları 3-6, laminer akış kabininde katı steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm sıvıları oda sıcaklığında kullanın. 3. Serum işleme 7,5 mL serum tüpünü önceden soğutulmuş bir santrifüjde 1128 x g ve 4 °C’de 15 dakika santrifüj. Önceden etiketlenmiş kriyotüplerde tüp başına aliquot 1 mL serum ve sıvı nitrojende dondurun. 4. PBL’nin yoğunluk gradyan santrifüjleme ile izolasyonu NOT: İki 20 mL şırınnanın her biriyle paralel çalışın. 20 mL heparinize kanı 50 mL polipropilen tüpe doldurun ve 15 mL DPBS ekleyin. Serolojik pipet ile 15 mL Pancoll alın, pipetleri polipropilen tüpün dibine kadar dikkatlice yerleştirin ve kan / DBPS sütununun altında bir tabaka oluşturmak için Pancoll’u çok yavaşça serbest bırakın. Frensiz 15 dakika boyunca 375 x g’da santrifüj. Her iki numunenin orta ve üst sütunu arasındaki opak ara tabakayı taze bir 50 mL Polipropilen tüpe epire edin ve aktarın ve DPBS ile 50 mL’ye doldurun. Frenli 15 dakika boyunca 270 x g’da santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve atın, hücre peletini 4,5 mL dondurucu ortamına yeniden atın. Kriyotube başına süspansiyonun 1,5 mL’si aliquot, tüpleri sıkıca kapatın ve yavaş dondurma için uygun bir dondurma kabına yerleştirin ve -80 ° C’de saklayın. 5. Doku işleme NOT: Nükleik asitlerin bütünlüğünü korumak için donmuş tümör ve sağlıklı doku örneklerinin üretilmesiyle başlayın. Tümör dokusu örneği Tümör örneğini polipropilen tüpten bir Petri kabına birkaç mL doku depolama çözeltisi ile aktarın. Gerekirse DPBS ile durulayın. Örneğe dokunmaktan kaçının ve dokuyu işlemek için iki steril neşter kullanın. Herhangi bir zamanda tahliyeden kaçının. Tümör örneğini ayrı bir tabakta uygun ölçekte tartın ve doku ağırlığını not edin. Kesmeden önce tümör dokusunun boyut, şekil ve doku kalitesini değerlendirin. Çıtçıt dondurma için bir iğne ucu büyüklüğünde en az bir parça ve hayati kriyoprezervasyon için her biri yaklaşık30 mm 3 (kenar uzunluğu 3 x 3x 3 mm) olan dört küp elde etmeyi hedefleyin. Mümkün olduğunca dörtlü olarak30 mm 3 küp üretin ve 5 dörtlük başına çıtçıt dondurma için tek parça oluşturun. Ayrıca, küplerin sadece hayati dokudan oluşması için nekrotik kısımların kesilmesi gerektiğini de dikkate alın. 3 mm kalınlığında dilimler oluşturun. Jel benzeri veya sıvı kütle olarak ayırt edilebilen nekrotik kısımları kesin ve dilimleri istenen iki boyutta küpler halinde kesin.NOT: Bu noktada herhangi bir doku atmayın. Dondurmayı tuttur Cryotube’ları buna göre etiketle (bkz. adım 7.7). Önceden etiketlenmiş kriyotüs başına küçük bir doku parçası yerleştirin. Numuneleri hemen birkaç dakika sıvı nitrojene batırın ve daha sonra -80 °C’de saklayın. Hayati dokunun kriyoprezervasyonu Cryotube’ları buna göre etiketle (bkz. adım 7.7) ve her birini 1,5 mL dondurucu ortamı ile doldurun. Dondurucu kabı tezgahın yanına yerleştirin.NOT: Sonraki adımları mümkün olduğunca çabuk izleyin. Dondurucu ortamındaki DMSO sitotoksik özelliklere sahip olduğundan, dokunun uygun soğutma olmadan dondurucu ortamına batırılma süresi 2 dakikayı geçmemelidir. 30 mm3 küpleri dörtlü olarak düzenleyin. Nekrotik dokuyu ve diğer kalıntıları yemeğin kenarına itin, ancak onları atmayın. Neşter bıçağı ile küpleri kepçeleyin ve kriyotüp başına 4 küp aktarın. Tümör parçalarının tamamen dondurucu ortama batırıldığından emin olun. Tüpleri sıkıca kapatın ve yavaş dondurmaya uygun bir dondurma kabına yerleştirin ve -80 °C’lik bir dondurucuda saklayın. Kriyotütleri -140 °C veya daha düşük bir hızda uzun süreli depolama için uygun bir depolama sistemine aktarın. Laboratuvar envanter yönetim sisteminde dokümantasyon zorunludur. Sağlıklı doku örneği: 5.1.1 adımlarını tekrarlayın. sağlıklı doku örneği için 5.1.6.4’e kadar. 6. Birincil hücre kültürü Nekrotik hurda da dahil olmak üzere tümör dokusunun kalıntılarını Petri kabında neşterlerle mümkün olduğunca küçük parçalara ayırın. 50 mL polipropilen tüpün üzerine steril bir hücre süzgeci (100 μm gözenek boyutu) yerleştirin. Petri kabına 5-10 mL DPBS eklemek için serolojik bir pipet kullanın, doku kalıntılarını yüzdürün ve bir süspansiyon oluşturmak için pipet yukarı ve aşağı. Süspansiyonu pipetle hücre süzgecine aktarın. Tüm doku kalıntıları Petri kabından çözülene kadar 6.3-6.4 adımlarını tekrarlayın. Hücre ve doku süspansiyonunu hücre süzgecinden geçirmek için 20 mL’lik tek yönlü şırınnanın pistonunu kullanın. 5-10 mL taze DPBS ile durulayın, hücre süzgecini atın ve tüpü düzgün bir şekilde kapatın. Süspansiyonu 180 x g’da 5-10 dakika santrifüjleyin. Bir kollajen hazırlayın-I, kuyu başına 1,5 mL orta ile ön kaplamalı 6 kuyu plakası. Aspirat ve üstnatant atmak. Peletin 3 mL DPBS veya orta olarak yeniden ıslatır ve her kuyuya 500 μL süspansiyon ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin (0 nem, %5 CO2, 37 °C) Hücre büyümesi ve kirlenmesi için plakayı günlük olarak izleyin.NOT: Kalıcı bir hücre hattının kurulması noktasına kadar daha fazla hücre kültleşmesi burada açıklanmaz. 7. PDX Üretimi in vivo deneylerini yalnızca yetki alanınızın yetkili makamının gereksinimlerini karşılayan uygun nitelikli kişiler tarafından gerçekleştirin. İmmün yetmezlikli fareleri, kullanılan fare suşunun taleplerini karşılayan spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırın. Hijyenik önlemler arasında ayrı ayrı havalandırılan kafesler, otoklavlı yiyecekler, su ve yuva malzemesinin yanı sıra bir güvenlik hava kilidi ve kişisel, koruyucu ekipmanların giyilmesi yer almaktadır. Tüm aletleri önceden otoklavlayın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için her tümör vakası için sadece bir cihaz seti kullanın. Tümör dokusunu mümkün olduğunca aseptik olarak ele alın. Aşağıda adı geçen tüm plastik eşyalar steril, tek kullanımlık olmalı ve her ameliyattan sonra atılmalıdır.NOT: Kriyotüt başına dört tümör dokusu parçasını dondurma yöntemiyle belirlenen PDX üretimi, örnek başına her zaman iki fare gerektirir ve ideal olarak dört PDX tümörü ile sonuçlanır. Laboratuvar envanter yönetim sistemi üzerinden engraftment için istenen primer tümörü seçin ve numuneyi (hayati derecede korunmuş tümör dokusu) ana depolama tankından taşınabilir bir sıvı azot kabına aktarın (Kuru buz üzerinde -80 °C’de orta depolama da uygundur). SPF bölümüne girmeden önce kişisel koruyucu ekipman takın (önlükler, takunyalar, önlük, saç örtüsü, cerrahi maske ve overshoes), ellerinizi ve tüm ekipmanlarınızı dezenfekte edin. Matrigel ıslatma Kriyotüt formunu sıvı nitrojen kabından çıkarın ve numunenin çözülmesini bekliyoruz. 50 mL polipropilen boruyu etiketle ve 35 mL DPBS ile doldur. Kriyotülü yukarı ve aşağı eğin ve doku-orta-çamur kaydırılır kaydırılmaz içeriği hemen polipropilen tüpüne aktarın. Tümör doku parçalarını hafifçe durulayın, ana hacmi tüpten ayrı bir kapta atın, kapağı kapatın ve tüpü yukarı-aşağı koyun, böylece dört doku parçası kapakta toplanır. Soğutma akümülatörüne bir Petri kabı koyun ve ortaya tek bir damlacık olarak 100 μL Matrigel yerleştirin. Tümör parçalarını Matrigel’e aktarmak için anatomik toparlayıcı kullanın. Her parçanın tamamen Matrigel ile kaplı olduğundan emin olun. 4 °C’de 10 dakika kuluçkaya yaslanın. Fare anestezisi (örnek başına 2 fare, paralel çalışır) 3:1- ketamin (100 mg/mL) ve ksilazin (20 mg/mL) anestezik çözelti stoğu hazırlayın. Önerilen doz 90/6 mg/kg vücut ağırlığıdır. Fareyi tartın ve gerekli anestezik çözeltiyi tek kullanımlık bir insülin şırıngına çekin. Fareyi kafesin ızgarasına yerleştirin, kuyruğunu bir elinizle hafifçe çekerek ileriye doğru bir hareket çalıştırın ve aynı anda boynu diğer elin bir tutam tutuşu ile yengeçleyin. Izgaranın faresini kaldırın ve tutma elini çevirin, böylece hayvanın sırtı avucunuza dayanır. Arka ayaklardan birini serçe parmağınızla hareketsiz hale edin ve narkotikleri intraperitoneal olarak enjekte edin. Fareyi kafesine geri koyun ve narkotik indüksiyonu bekliyoruz. Anestezi edilmiş fareyi ısıtma plakasına yerleştirin ve korneanın zarar görmemesi için gözleri merhemle kapatın. Farenin arka ayağını cerrahi tokmalarla hafifçe sıkıştırarak anestezinin derinliğini siler.NOT: Hareket yokluğu derin narkozu gösterir. Her türlü hareket ya istenen narkotik derinliğe ulaşmak için daha fazla zaman ya da ek bir anestezi dozu gerektirir. Cerrahi prosedür Farenin boynunu sıkıştırarak bir cilt kıvrımı oluşturun ve mikroçipi aplikatörle deri altı olarak enjekte edin (Programlama ayrıntıları için 9. adıma bakın) Gerekirse farenin kanatlarını tıraş edin (NMRInu/ nu fareleri tıraş gerektirmez), pamuklu çubukla povidone-iyot uygulayın ve steril bir alan oluşturmak için cerrahi örtü kullanın. Cerrahi forseps ile kanadın derisini kaldırın, yaklaşık 4 mm’lik küçük bir kesi yapın ve makasla künt bir hazırlık yaparak küçük bir deri altı cebi oluşturur. Her cebe bir tümör parçası koyun ve arka uca yerleştirin. 100 μL pipet ucunun ucunu kırpın ve kalan Matrigel’i Petri kabından epire edin ve her cilt cebine eşit olarak uygulayın. Yaraları basit kesilmiş dikişlerle kapatın ve sprey pansuman uygulayın. Mikroçipi tarayın ve fare ve tümör-id’nin geçerliliğini kontrol edin. Taze yatak takımı ve yuva malzemesinin yanı sıra kemiren bir çubukla yeni bir kafes hazırlayın. Kağıt havlulardan bir “yastık” katlayın ve fareyi kızılötesi bir ısı lambasının altına yükseltilmiş kafa ile bırakın. 0.25 mL trimethoprim/sulfamethoxazole (400 mg/80 mg) 100 mL içme suyu ile karıştırın ve içme şişesi ile idare edin. Bir farenin günlük kg vücut ağırlığı başına yaklaşık 150 mL tükettiği düşünülmektedir.NOT: Subkutan PDX modeli postoperatif ağrı ile ilişkili olmadığından, ne yara iyileşme sürecinde, ne de tümör büyümesi sırasında postoperatif analjezi gerekli değildir. Kurumunuzun/otoritenizin hayvan refahı yönergelerinin farklı olabileceğini lütfen unutmayın. Deney hayvanlarının izlenmesi Fareleri her gün sıkıntı belirtileri için izleyin. Bu, nitelikli hayvan bakıcılarına devredilebilir. Ameliyat sonrası antibiyotik tedavisini yukarıda belirtilen dozajla 4 hafta boyunca sürdürin. Antibiyotik karışımını haftada iki kez değiştirin. Tümör boyutunu haftada en az bir kez, ideal olarak günlük, kaliperle ölçün (tümör hacmi = 0,52 x uzunluk x genişlik x yükseklik [mm3]) ve veritabanına kaydedin. 8. PDX hasat ve işleme PDX tümörlerini hasat edin ve işleyin, ne zaman:Tümör büyüklüğü 1.500 mm3hedef hacme ulaşır.Hayvan taşıyan tümör sıkıntı ve/veya hastalık belirtileri gösterir ve tedavi beyhudedir.Tümör ülser olur veya farenin cildine nüfuz eder. Doğru PDX’i tanımlamak için mikroçipi okuyun. Fareyi yasal bir yöntemle (ulusal yönergelere bağlı olarak) CO2-asfiksasyon veya ketamin/ksilazin enjeksiyonu ve ardından servikal çıkık olarak ötenazi edin. Deriyi yanlarda cerrahi dikps ile kaldırın ve metzenbaum makası ile tümörden birkaç milimetre uzakta inzivaya alın. Tümörün üzerindeki cildi künt hazırlıkla ayırın, ardından anatomik kümeslerle tümörü dikkatlice kavrayın ve tümörü vücudun yüzeysel fasyasından ayırın. Tümörü DPBS ile durulayın, bir Petri kabına koyun ve bitişik bağ dokusunu çıkarın. Bu noktada, aşağıdakilerden birini gerçekleştirin: 30 mm3 küp kesin ve yeni PDX oluşturun (7.7.4 noktasında protokolle devam edin). Tümörü dilimler halinde kesin, daha sonra histoloji kasetlerine aktarılır ve daha sonra parafin gömülmesi için% 4 formaldehitte korunur. Tümörü biyobankaya eklemek için doku depolama çözeltisi ile bir tüpte koruyun (Adım 3.’de protokolle devam edin) ve/veya PDX türevi hücre hatları oluşturun (Adım 4’te protokolle devam edin.) 9. Biyobanka ve veri yönetimi Tablo 1’egöre her tümör vakasına bir iç kimlik atayın. Laboratuvar yeri/adı kanser varlığı ardışık servis talebi numarası Belirtimi ardışık sayı C=kolorektal _Met=Metastaz P=pankreas _Tu=Tümör Örnek: HROC389_Met2 = Rostock, kolorektal kanser, vaka 389, ikinci metastaz Tablo 1: Örnek kimliğin tanımı. Hasta rızasını tümör-kimlik ile birlikte elektronik ve kağıt formunda saklayın. Mümkün olduğunca çok klinik veri toplayın ve bunları anonim ve ayrı ayrı saklayın. Bir veri yönetimi yazılımı (örneğin, Freezerworks) veya başka bir yazılım kullanın ve sıcaklığa dayanıklı, kendinden yapışan barkod etiketleri oluşturmak için etiket yazdırma yazılımıyla bir arayüz oluşturun. Veri yönetimi yazılımını açarak yeni bir örnek ekleyin, numune türünü tanımlayın ve aşağıdaki bilgileri kaydedin: tümör kimliği, doku tipi, dondurma yöntemi, tarih, sorumlu çalışan, geçiş numarası, fare kimliği ve fare zorlanması. Numuneleri depolama tankındaki belirli konumlara atayın. PDX’in izlenmesi ve izlenmesi (7-8. adım için geçerlidir) Tümör kimliği, implantasyon tarihi, ötanazi tarihi, fare yaşı ve zorlanmasının yanı sıra zaman içinde tümör büyümesini kaydetmek için taşınabilir, Bluetooth özellikli bir cihazda (dizüstü bilgisayar veya tablet) bir MS Access veri tabanı (veya benzer bir sistem) kullanın. Mikroçip okuyucuyu cihaza bağlayın ve implantasyondan önce mikroçipi okuyun. Her fareye belirli bir kimlik atayın; aşağıdaki şemayı kullanıyoruz: (aşağıdaki Tablo 2’ye bakın) İmplantasyondan sonra, kimliği veri tabanındaki fare özellikleriyle birlikte kaydedin. Mikroçipi yeniden okuyun ve mikroçip, veri tabanı ve kriyotüp etiketinin özellikleri tutarlı olup olmadığını kontrol edin. Her fare kafesi için buna göre bir etiket oluşturun.NOT: Fiziksel bir yedekleme oluşturmak için, ilgili mikroçip etiketleriyle birlikte kriyotüp etiketlerini bir kitapçık ve not tarihi ve fare zorlanması içine yapıştırın. Bireysel PDX’in tümör büyümesini izlemek için, farenin mikroçipini kimlik tespiti için veri tabanı cihazına bağlı okuyucu ile tarayın ve her hafta kaliperle ölçülen tümör boyutunu kaydedin. Tümörün büyüme eğrisini analiz ederek PDX hasadının ideal zaman noktasını planlayın. Tümör Kimliği N2’de önceki depolama (=f) Geçiş (=T) numarası ardışık fare (=M) numarası Örnek: HROP12 fT0 M1 = Rostock, pankreas kanseri, vaka 12, dondurulmuş birincil dokudan oluşturulan, ilk pasaj, fare 1. Tablo 2: PDX Kimliği’nin tanımı.