全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

1.スライドの準備、滅菌、細胞培養 500 mLの10%HCl(v / v)を準備し、大きなビーカーに注ぎます。 顕微鏡スライドを個別に酸に落とし、2 x gに設定したシェーカーで室温で1時間インキュベートします。注意: HClは腐食性で刺激性があります。重度の皮膚のやけどや目の損傷、皮膚、目、呼吸器系の刺激を引き起こす可能性があります。ニトリル手袋、目の保護具、白衣など、適切な個人用保護具を着用してください。 ビーカーから酸をデカントし、水道水で10回、次に脱イオン水でさらに10回スライドします。 スライドをメタノールで2回すすぎ、炎上滅菌するまでメタノールに保ちます。注意: メタノールは非常に可燃性の液体であり、飲み込んだり、皮膚に接触したり、吸入したりすると有毒です。.さらに、メタノールは臓器に損傷を与える可能性があり、腐食性および刺激性です。職場の暴露制限を遵守し、ブチルゴム手袋、目の保護具、白衣などの適切な個人用保護具が着用されていることを確認してください。可能であれば、局所排気換気(LEV)ヒューム戸棚で取り扱ってください。 金属製のトングまたは長い鉗子を使用して、メタノールを含むビーカーから顕微鏡スライドを取り外します。ブンゼンバーナーで炎上して滅菌し、ブンゼンバーナーの近くにあるスライド用の4つのコンパートメントを含む長方形の細胞培養容器に移します。注意: 炎上により、使用前に顕微鏡スライドを即座に滅菌できます。ただし、この方法には関連する危険があります。メタノールは可燃性が高いため、スライドを含むビーカーをブンゼンバーナーから離して配置することが重要です。スライドをしっかりと握る長いトングまたは鉗子を使用する必要があります。ビーカー内のメタノールレベルは、使用されるメタノールの量を最小限に抑え、鉗子/トングの端のみがメタノールと接触するように、スライドを覆う必要があります。使用後は、鉗子またはトングからメタノールが蒸発し、これらが冷えていることを確認してから、スライドとメタノールを含むビーカーに戻してください。ビーカーは、メタノールが発火した場合に酸素を飢えさせるために、アルミホイルで覆う必要があります。空気が循環しているクラスII層流フード内で炎が滑ることはありません。 または、手順1.1〜1.4を実行しますが、メタノールでインキュベートした後にスライドを炎上させるのではなく、糸くずの出ないティッシュにスライドを置いて風乾させます。乾いたら、アルミホイルで包み、滅菌オーブンまたはオートクレーブに入れます。 60〜70%のコンフルエントに達するまで、5%CO2 中で37°Cで少なくとも48時間血清を含む適切な培地で細胞を増殖させる。このプロトコルは、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)の早期通過、および古典的なハッチンソン-ギルフォード早老症症候群(HGPS)線維芽細胞(AG06297)および非定型2型HGPS線維芽細胞(AG08466)に対して実施されました。各細胞タイプを採取し、血球計算盤を使用してカウントし、細胞密度を決定します。スライドごとに10 mL培地に1 x 105 細胞を播種します。注:細胞がコンフルエントになりすぎると、異なる核からのDNAループが収束する可能性があるため、細胞密度は重要です。形質転換細胞はより迅速に増殖する可能性があるため、使用する細胞の種類に応じて播種密度を最適化する必要がありますが、後の継代細胞培養では、目的のコンフルエントに到達するまでに時間がかかる場合があります。 静止するために細胞をG0 で停止させる必要がある場合は、スライドごとに1 x 105 細胞(10 mL培地中)を播種し、24時間増殖させます。無血清培地で細胞を2回洗浄し、0.5%の低濃度の血清を含む標準培地(新生ウシ血清、NCS、またはウシ胎児血清、FBS)で7日間インキュベートします。 DNA Haloアッセイに細胞の増殖状態が必要な場合は、複製中に5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)をDNAに取り込むことによってS期を通過した細胞を特定します。通常どおり細胞に播種し、24時間増殖させる。培養液を取り出し、BrdUと5-フルオロ-2′-デオキシウリジン(3 μg/μL)を含む培地と交換します。さらに24時間後、培地を取り出し、細胞を培地(10%NCS)で1回洗浄してから、新しい培地(10%NCS)を再供給します。さらに24時間インキュベートしてから、DNAハローアッセイ用のスライドを準備します。 2. プローブの準備 染色体全体およびアームペインティングプローブTeleniusらの方法を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプライミングポリメラーゼ連鎖反応(DOP-PCR)によってフローソーティングまたはマイクロダイセクションされた染色体の増幅から染色体プローブを作成します16。 表1に示すように、DOP-PCRを使用して、染色体プローブをビオチン-16-dUTPまたはジゴキシゲニン-11-dUTPのいずれかで標識します。増幅プロファイルについてはメーカーの説明書をご確認くださいが、この実験に使用した条件を 表2に示します。 標識PCR産物8 μL、Cot-1 DNA7 μL、ニシン精子3 μL、3 M酢酸ナトリウム(pH 5.4)の1/20容量、および2倍量の100%エタノールを一緒に添加して、アームまたは染色体全体プローブを調製します。プローブ溶液を-80°Cで最低30分間インキュベートします。注:この方法は、単一の染色体プローブ、または目的の染色体ごとに異なる標識(ビオチン-16-UTPとジゴキシゲニン-11-dUTP)が使用されている場合は複数の染色体プローブを作成するために使用できます。注意: エタノールは非常に可燃性の液体および蒸気であり、深刻な目の炎症を引き起こす可能性があります。熱、高温の表面、発火源から遠ざけてください。職場の暴露制限を遵守し、ブチルゴム手袋、目の保護具、白衣などの適切な個人用保護具が着用されていることを確認してください。可能な場合は、LEVヒューム食器棚でハンドルを取り付けます。 プローブ溶液を13,700 x g で4°Cで15分間遠心分離し、70%エタノールで洗浄します。遠心分離手順を繰り返し、DNAペレットを乱したり紛失したりしないように注意しながら、上清を廃棄します。DNAペレットを乾燥させます。 12 μLのハイブリダイゼーションバッファー(50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸塩、10x生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC;3 M NaCl、0.3 Mクエン酸三ナトリウム、pH 7.0)、1%(v/v)ポリオキシエチレンソルビナールモノラウレート(Tween-20))をDNAペレットに加えます。DNAペレットがハイブリダイゼーションバッファーに溶解するまで、37°Cで少なくとも2時間放置します。注意: ホルムアミドは発がん性および催奇形性であるため、胎児に深刻な害を及ぼす可能性があります。.女性が妊娠している場合、または妊娠が疑われる場合は、ホルムアミドの使用を避ける必要があります。ホルムアミドはLEVヒュームフードで使用する必要があります。職場の暴露制限を遵守し、ブチルゴム手袋、目の保護具、白衣などの適切な個人用保護具が着用されていることを確認してください。 細菌人工染色体(BAC)からのDNA単離BACクローンのグリセロールストックのごく一部をLuria-Bertani(LB)寒天プレートにストリークします(1%(W / V)NaCl、1%(w / v)トリプトン、0.5%(w / v)酵母エキス、1.5%(w / v)寒天テクニカル、12.5 μg / mL(w / v)クロラムフェニコール)。37°Cで一晩インキュベートします。 プレートから単一のコロニーを選択し、10 mLのLBブロス(1%(w / v)NaCl、1%(w / v)バクトトリプトン、0.5%(w / v)酵母エキス、12.5 μg / mL(w / v)クロラムフェニコール)を接種します。溶液を振とうインキュベーターに37°Cで一晩放置します。注意:クロラムフェニコールは癌を引き起こす疑いがあります。取り扱いには注意し、露出を減らしてください。 室温で1,700 x g で10分間遠心分離培養します。 上清を捨て、300 μLのP1溶液(15 mM Tris(pH 8)、10 mM EDTA、100 μg/mL RNase A)をペレットに加えます。激しくボルテックスし、細胞を2 mLの微量遠心チューブに移します。 300 μLのP2溶液(0.2 M NaOH、1%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))を細胞に滴下します。閉じた微小遠心チューブを5回反転させ、室温で最大5分間放置します。注意: 水酸化ナトリウムは腐食性であり、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。金属に対して腐食性がある場合があります。取り扱いには注意し、露出を減らしてください。職場の暴露制限を遵守し、ニトリルゴム手袋、目の保護具、白衣などの適切な個人用保護具が着用されていることを確認してください。可能な場合は、LEVヒューム食器棚でハンドルを取り付けます。注意: ドデシル硫酸ナトリウムは可燃性の固体であり、飲み込むと有害であり、皮膚や呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。.また、深刻な目の損傷を引き起こす可能性があります。ニトリルゴム手袋、目の保護具、白衣など、適切な個人用保護具を着用してください。可能な場合は、LEVヒューム食器棚でハンドルを取り付けます。 300 μLのP3(3 M酢酸カリウム)を細胞にゆっくりと加え、穏やかに混合します。微量遠心チューブを氷上に10分間置きます。 8,100 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を800 μLの氷冷イソプロパノールを含むチューブに移します。チューブを数回反転させ、-20°Cで一晩インキュベートします。注意: イソプロパノールは非常に可燃性の液体および蒸気であり、深刻な目の炎症、眠気、またはめまいを引き起こす可能性があります。.熱、高温の表面、発火源から遠ざけてください。職場の暴露制限を遵守し、ニトリルゴム手袋、目の保護具、白衣などの適切な個人用保護具が着用されていることを確認してください。可能な場合は、LEV)ヒューム食器棚でハンドルを取り付けてください。 8,100 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を取り除き、別のチューブに移します。氷冷した70%エタノール500μLを加えます。チューブを数回反転させ、8,100 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、ペレットを室温で風乾する。ペレットが乾いたら、40 μLのジエチルピロカーボネート処理水(DEPC処理)に再懸濁し、4°Cで一晩放置します。完全に再懸濁したら、5 μLの溶液を除去し、1%アガロースゲルにロードしてDNAの存在を確認します。 ニック翻訳によるBACの単一遺伝子プローブ調製市販のニック翻訳ラベリングキットを使用してください。または、次のプロトコルを使用します。構成成分と体積については 表3 を参照してください。 最後にDNAポリメラーゼIを加えて微量遠心チューブに 表3 の構成成分を一緒に加え、穏やかに混合し、数秒間短時間遠心分離します。溶液を15°Cで2時間インキュベートします。 フラグメントサイズを確認するには、5 μLの溶液を2%アガロースゲルにロードします。DNAフラグメントサイズの範囲は200〜600 bpである必要があります。DNAフラグメントのサイズが大きい場合は、溶液を15°Cでさらに15分間インキュベートし続け、2%アガロースゲルで製品を実行します。 10 mM EDTA、0.1% SDS(0.5 M EDTA2.5 μL、100 μL中のpH 8.0、100 μL中の10%SDS)を添加して、ニック翻訳反応を停止します。溶液を65°Cで5分間加熱します。 取り込まれていないヌクレオチドを除去するには、BACプローブをスピンカラムに適用します。市販のスピンカラムを購入することも、シリンジを使用して次のように作成することもできます。 30 gのセファデックスG-50を500 mLのカラムバッファー(10 mM Tris-HCl(pH8)、1 mM EDTA、0.1% SDS)に加えます。混合物をオートクレーブする。また、500 mLのカラムバッファー(セファデックスG-50なし)とオートクレーブを作ります。 1 mLシリンジの底にオートクレーブ滅菌したグラスウールを加えてスピンカラムを作ります。1 mLシリンジにセファデックスG-50をカラムバッファーで充填します。底に蓋のない微小遠心チューブを備えた15 mLの遠心分離管に1 mLシリンジを入れます。1,600 x g で5分間遠心分離します。 シリンジを取り外し、下部にある微量遠心チューブを廃棄します。新しい微量遠心チューブを15 mLの遠沈管に戻します。カラムバッファー(Sephadex G-50なし)を1 mLシリンジに加え、15 mL遠沈管に再挿入します。1,600 x g で5分間遠心分離します。この手順をもう一度 2 回繰り返します。 シリンジを取り外し、新しい清潔なマイクロ遠心チューブを含む15mLの遠心分離チューブに挿入します。プローブをシリンジに塗布し、微量遠心チューブにプローブを収集します。 DNAプローブを沈殿させるには、5 μLのニシン精子DNA(10 mg / mL)、10 μLの酢酸ナトリウム、および2.25容量の100%エタノールをDNA溶液に加えます。溶液を穏やかに混合し、-80°Cで最低1時間インキュベートします。13,700 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを200 μLの氷冷70%エタノールで4°Cで15分間洗浄します。 上澄み液を取り除き、風乾します。ペレットを20 μLのDECC処理水に室温で数時間、または4°Cで一晩乾燥して再懸濁します。 これでプローブを使用する準備が整い、-20°Cで保存することもできます。 各スライドについて、5 μLプローブDNAと5 μLのCot-1 DNAを混合し、Speed Vac真空濃縮器を使用して乾燥させます。ペレットが乾燥したら、12 μLのハイブリダイゼーションミックスに再懸濁します。 3.DNAハローの準備 スライドと付着した細胞が入っている正方形の培養皿をインキュベーターから取り出します。培地を廃棄し、鉛筆を使用してスライドにラベルを付け、50 mLの氷冷細胞骨格(CSK)バッファー(100 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.3 Mスクロース、10 mM 1、4-ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES;pH 7.8)、0.5%(v / v)トリトンX-100を脱イオン水で構成したコプリンジャーに入れます。氷上または4°Cで15分間インキュベートします。注意: Triton X-100は、皮膚の炎症や深刻な目の損傷を引き起こす可能性があります。ニトリル手袋、ゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具を使用して取り扱ってください。 CSKバッファーを廃棄し、50 mLの1x DNAハローバッファー(DHB;140 mM NaCl、27 mM KCl、110 mM NaHPO4、15 mM KH2PO4;pH7.4)でスライドを3回、すなわちDHBを含むコプリンジャーに浸して取り出します。 50 mLの抽出バッファー(2 M NaCl、10 mM PIPES(pH 6.8)、10 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.1%(w / v)ジギトニン、0.05 mM(v / v)スペルミン、0.125 mM(v / v)スペルミジンを含むCoplinジャーにスライドを移します。室温で4分間インキュベートします。注意: ジギトニンは、飲み込んだり皮膚に接触したりすると有毒であり、吸入すると致命的です。.ジギトニンがLEVヒューム戸棚で取り扱われていることを確認し、白衣、ニトリル手袋(二重手袋)、安全メガネ、マスクを着用してください。スペルミンとスペルミジンはどちらも重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性がありますが、EDTAは深刻な目の炎症を引き起こすため、各化学物質の取り扱いには注意してください。注:粉末を60〜70°Cの温度で水に溶かして、ジギトニンを個別に調製します。 冷却したら、溶解したジギトニンを抽出バッファーに加えます。生物学的活性を維持するために、最後にスペルミン、スペルミジン、ジギトニンを抽出バッファーに加えます。 スライドを50 mLの10x DHB(1.4 M NaCl、270 mM KCl、1.1 M NaHPO 4、150 mM KH2PO4;PH7.4)、5x、2x、および1x DHBをそれぞれ1分間。 10%、30%、70%、95%(v/v)エタノールの50 mLシーケンシャルエタノールシリーズを通してスライド(ストレートインおよびストレートアウト)をディップします。 空気乾燥スライドし、2次元蛍光in situハイブリダイゼーション(2D FISH)が行われるまで-80°Cで保存します。 4. 二次元蛍光in situハイブリダイゼーション 20x SSCを作る:3 M NaCl、0.3 Mクエン酸三ナトリウム、pH 7.0。このバッファーはオートクレーブ滅菌し、室温で保存し、必要に応じて希釈することができます。 70%(v/v)ホルムアミド、2x SSC pH 7.0を作り、水浴中で70°Cに加熱する。 スライドを、70、90、および100%エタノールの連続した50 mLエタノールシリーズを通して、それぞれ5分間インキュベートします。 保温プレート上で風乾スライドし、70°Cのオーブンで5分間焼きます。 70%ホルムアミド、2x SSC溶液に70°Cで2分間入れてスライドを変性させます。メモ: 温度とタイミングは、手順4.5にとって重要です。温度が DNAは変性せず、プローブはハイブリダイズせず、DNAハローフィッシュからシグナルは得られません。 変性スライドを50 mLの氷冷70%エタノールに5分間入れ、90%、95%、100%のエタノールシリーズを室温でそれぞれ5分間通過させます。 保温プレートで風乾 直接標識された全ヒト染色体プローブは、製造元の指示に従って取り扱ってください。これらの実験には、ヒト全染色体塗料1、13、15、17、18を使用しました。また、本実験では、 CCND1 および CTNNA1 遺伝子プローブを用いた。注:染色体プローブ全体とBAC遺伝子特異的プローブの両方をビオチン-11-dUTPで標識し、シアニン3(Cy3)に結合させたストレプトアビジンによって検出しました。染色体ペインティングプローブ(DOP-PCR)およびニックトランスレーションによって標識されたBAC DNAについては、これらをプロトコルにおいてこの時点からDNAプローブと呼び、以下のように扱う。 DNAプローブ(全染色体ペイントまたは遺伝子特異的プローブ)を75°Cでホットブロックまたはウォーターバス中で10分間変性させます。 DNAプローブをホットブロックまたはウォーターバスで37°Cで30分間温めてから、10 μLを適切なスライドにピペッティングします。注:この手順は、繰り返しの染色体配列をブロックするために重要です。非特異的シグナルを行わない場合は、DNA Halo FISHに産生され得る。 21 mm x 21 mmのカバーガラスとゴムセメントを使用したシールを備えたオーバーレイプローブ。 スライドを加湿ハイブリダイゼーションチャンバーで37°Cで最低18時間インキュベートします。注:加湿ハイブリダイゼーションチャンバーは、湿らせた組織の数層と、スライドを置くためにカットされた10mLプラスチックピペットから構築された隆起したプラットフォームを含むサンドイッチボックスから作ることができます。これは、光への露出を最小限に抑えるためにアルミホイルで覆われています。 鉗子を使用してゴムセメントを慎重に取り除きます。 スライドを50 mL 50%(v/v)ホルムアミド、2x SSC、pH 7.0溶液でインキュベートし、45°Cに予め加温して5分間3回インキュベートします。注意: 50%(v / v)ホルムアミド、2x SSC、pH 7.0溶液での最初のインキュベーションで、カバーガラスをスライドから離します。これにより、カバーガラスを「引きずり込む」ことによって引き起こされる可能性のあるDNA Halo調製物の損傷を防ぎます。スライドは、カバーガラスを取り外すのを助けるために鉗子によるグリップを介してバッファー内で攪拌することができます。 次に、スライドを60°Cに予熱したが45°Cの水浴に入れた0.1x SSC、pH 7.0溶液の50mLに入れます。5分間インキュベートし、バッファーをさらに2回5分間インキュベーションします。 室温で50 mLの4x SSC、pH 7.0溶液を含むCoplinジャーにスライドを入れ、バッファーを3回交換して15分間インキュベートします。 100 μLの4%BSA、4x SSC溶液を各スライドに塗布し、パラフィンフィルムをオーバーレイします。室温で10分間インキュベートします。これにより、抗体の非特異的結合が防止されます。 標識プローブ(ビオチン-16-dUTP)を検出するには、100 μLの1:200(1% BSA製、4x SSC)ストレプトアビジン-Cy3と室温で1時間インキュベートします。注:実験前に抗体の希釈とテスト希釈で製造元の指示に従って、良好なシグナルが生成されていることを確認してください 室温で50 mLの4x SSC(0.5%Tween-20)pH 7.0溶液を含むCoplinジャーにスライドを入れ、バッファーを3回交換して15分間インキュベートします。スライドは、免疫蛍光が必要ない場合は、ステップ4.21に示すようにこの段階で取り付けることができます。 DNAハローに作られた細胞の増殖状態が必要な場合は、FISHステップの後、組み込みBrdUについてマウントまたは染色する前に抗pKi67抗体で染色する。スライドを50 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ3回5分間洗浄し、続いてPBS中の4%NCSで室温で1時間ブロッキングします。 必要な一次抗体(ウサギ抗ヒトpKi67;マウス抗BrdU)200 μLをスライドに塗布し、パラフィンフィルムのストリップでオーバーレイし、室温で1時間インキュベートします。 スライドを1x PBSで5分間3回洗浄し、室温で200 μLの蛍光色素結合二次抗体(pKi67:ブタ抗ウサギTRITC;BrdU:ロバアンチマウスCy3)。PBSでさらに3回5分間洗浄します。すべての希釈は、メーカーの推奨希釈率の範囲でPBS中の1%(v / v)NCSを使用して行われます。 DAPIを含む20 μLのマウンタントにスライドをマウントし、22 mm x 50 mmのカバーガラスでオーバーレイします。 5.テロメアPNAフィッシュ テロメアを検出するには、テロメアPNA FISHキット-FITCを使用します。製造元の指示に従って手順を実行してください。手順は、特に明記されていない限り、室温で実行する必要があります。 スライドをトリス緩衝生理食塩水(TBS、pH 7.5)に2分間浸した後、3.7%ホルムアルデヒド(TBS中、v/v)に正確に2分間入れます。注意:TBS溶液には、10〜30%のトロメタモールと10〜30%の2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール塩酸塩が含まれています。.これは深刻な目や皮膚の炎症を引き起こす可能性があるため、保護手袋とゴーグル/顔面保護具を着用してください。換気の良い場所で使用してください。 コプリンジャーでスライドをTBSで2回ずつ5分間洗浄します。 スライドを前処理液に10分間浸した後、TBSで2回洗浄し、1回の洗浄で5分間洗浄します。 次に、70%、85%、95%(v/v)エタノール50mLからなる氷冷エタノールシリーズを濃度あたり2分間スライドします。その後、スライドを風乾させます。 蛍光タグの色の選択に応じて、10 μLのテロメアPNAプローブ/FITC(またはCy3)を各スライドに適用し、カバーガラスでオーバーレイします。80°Cに設定した予熱オーブンで5分間インキュベートし、暗所に約1時間置きます。注意: テロメアPNAプローブ/ FITCには6〜100%ホルムアミドが含まれているため、深刻な目の炎症を引き起こし、催奇形性であるため、胎児に深刻な害を及ぼす可能性があります。女性が妊娠している場合、または妊娠が疑われる場合は、ホルムアミドの使用を避ける必要があります。ホルムアミドはLEVヒュームフードで使用し、適切な目または顔の保護具を着用する必要があります。. カバーガラスを取り除くには、スライドを「リンス溶液」に1分間浸してから、「洗浄溶液」に65°Cで5分間入れます。注意: 洗浄液には、1〜5%のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルと1〜5%の塩化ナトリウムが含まれています。これは腐食性であり、深刻な目の損傷を引き起こす可能性があります。洗浄液を取り扱うときは、ゴーグルまたは顔面保護具を着用していることを確認してください。 スライドを50 mLの氷冷エタノールシリーズ(70%、85%、95%(v/v))に通して濃度あたり2分間インキュベートし、風乾します。DAPIを含むマウンタントでドライマウントスライドし、カバーガラスでオーバーレイします。 6.画像のキャプチャと分析 DNAハローと染色体領域を視覚化するには、落射蛍光顕微鏡(ライカDM4000顕微鏡など)を使用して、HC PL FLUOTAR 100X/1.30オイル対物レンズとDFC365FXカメラを使用して画像をキャプチャします。 グレースケール画像をキャプチャし、キャプチャされた各チャンネルの色を定義して、画像の疑似カラーリングを有効にします。この実験では、商用ソフトウェア(LAS AFバージョン4.5.0ソフトウェアなど)を使用しました。個々のカラーチャンネルはTIFFとしてエクスポートされました。 Java画像処理プログラムフィジーImageJを使用して画像を分析します。 [ファイル ]を押して画像をアップロードし 、[開く]をクリックします。 個別の画像チャンネルを読み込むか、合成画像を個別のグレースケールチャンネルに分割するには、 Image |カラー |チャンネルを分割します。画像チャンネルを選択し、[ 画像 |調整 し、[ 明るさとコントラスト]を選択します。それに応じて変更し、他のチャネルで繰り返します。 核を描いたDAPI染色チャンネルを選択して、残留核のマスクを作成します。[ 画像] |調整 し、[ しきい値] を選択します。しきい値を変更できるダイアログボックスが表示されたら、[ 暗い背景 ]チェックボックスをオンにします。残留核が透明になるまで変更し、[ 適用 ]を押してダイアログボックスを閉じます。注: これにより、ピクセル強度に基づいてバイナリマスクが作成され、白いピクセルは関心領域を示し、黒いピクセルは背景を示します。プローブチャネルで同じ手順を繰り返します。 フリーハンド選択を使用して残余核の周辺をアウトライン化し、[ 編集 ]をクリックして [外側をクリア]をクリックします。プローブチャネルを残留核にオーバーレイします。これは、 画像|カラー |チャンネルをマージします。 ImageJ で計測スケールを設定するには、スケールバー上または 2 つの既知の距離の点間に線を引きます。 [分析 ]に移動し 、[スケールの設定]を押します。ダイアログボックスで距離の長さを追加し、[ OK]をクリックします。距離を計測するには、計測対象のポイント間にラインを描画し、[ 解析 |測定します。これにより、距離値がデータウィンドウに転送されます。 これは核の中心と一致するので、最も明るいDAPI強度を測定します。この測定から、核中心から最も遠い染色体領域の端(CTE)までの距離を測定します。核中心から核端(NE)までの距離を測定します。 結果が CTE/NE 比として表示されることを確認します。ここで、核中心から各最遠端の染色体領域縁までの距離(CTE)を、核中心から各各核縁までの距離(NE)で除算する。これは最低50核で実行する必要があります。これは、棒グラフまたはボックス チャートとして表すことができます。 テロメアの分析では、データセットごとに最低30個の核を分析します。画像は、Fiji ImageJを使用して分析するか、手動で分析して、残留核内およびDNAハロー内のテロメアの数をカウントできます。BrdUまたはpKi67は、増殖核(BrdU/piK67+)および老化/静止核(BrdU/pKi67-)の分化を可能にした。データは、平均の標準誤差(SEM)に対応する誤差バーを持つ棒グラフで表すことができます。 スチューデントのt検定(対応なし)を使用して、有意と見なされるp>0.05と結果を統計的に比較します。