Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf DNA-Halo-Präparaten zur Aufdeckung ganzer Chromosomen, Telomere und Genorte
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences,Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences,University of Hertfordshire
Summary
Die Kombination von DNA-Halo-Präparationen mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ermöglicht eine hochauflösende Analyse genomischer Interaktionen mit dem Nukleoskelett. Das angehängte Genom führt zu hybridisierten Fluoreszenzsignalen, die sich in den verbleibenden extrahierten Kernen befinden, während sich das nicht angehängte Genom im Halo der DNA befindet, der die verbleibenden Kerne umgibt.
Abstract
Das Genom ist mit mehreren Strukturen im Zellkern verbunden, um seine Aktivität zu regulieren und an bestimmten Stellen zu verankern. Diese Strukturen werden zusammen als Nukleoskelett bezeichnet und umfassen die Kernlamina, die Nukleolen und die Kernkörper. Obwohl es viele Varianten der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) gibt, um das Genom und seine Organisation zu untersuchen, sind diese oft durch die Auflösung begrenzt und liefern nur unzureichende Informationen über die Assoziation des Genoms mit Kernstrukturen. Die DNA-Halo-Methode verwendet hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergenzien, um DNA-Schleifen zu erzeugen, die durch Bindungsregionen innerhalb des Genoms an Strukturen innerhalb von Zellkernen verankert bleiben. Hier werden lösliche Kernproteine wie Histone, Lipide und DNA, die nicht fest an die Kernmatrix gebunden sind, extrahiert. Dies führt zur Bildung eines Halos aus ungebundener DNA, der einen Restkern umgibt, der selbst DNA enthält, die eng mit internen Kernstrukturen und extraktionsresistenten Proteinen verbunden ist. Diese ausgedehnten DNA-Stränge ermöglichen eine höhere Auflösung und können die physikalische Kartierung erleichtern. In Kombination mit FISH hat diese Methode den zusätzlichen Vorteil, dass genomische Interaktionen mit allen Strukturen, durch die das Genom verankert ist, untersucht werden können. Diese Technik, die als HALO-FISH bezeichnet wird, ist sehr vielseitig, wobei DNA-Halos mit Nukleinsäuresonden gekoppelt werden können, um Genloci, ganze Chromosomen, Alpha-Satelliten, Telomere und sogar RNA aufzudecken. Diese Technik gibt Aufschluss über die Organisation und Funktion des Kerns in normalen Zellen und in den Krankheitsverlauf wie z.B. bei Krebs.
Introduction
Die “Kernmatrix” wurde erstmals 1974 von Berezney und Coffey beschrieben1. Nach Extraktionen mit hohen Salzmolaritäten und Nukleasebehandlung an Leberkernen von Ratten identifizierten sie ein proteinartiges Strukturgerüst. Das DNA-Halo-Verfahren wurde später von dieser Methode adaptiert und beinhaltet die Entfernung löslicher Proteine, so dass nur die Kernmatrix (NM) und NM-assoziierte Proteine und Chromosomen übrig bleiben. DNA-Bindungsregionen befinden sich an der Basis von DNA-Schleifen und werden als Matrix Attached Regions (MARs) oder Scaffold Attachment Regions (SARs) bezeichnet, die gegen Extraktion mit hohen Salzkonzentrationen bzw. ionisches Detergens Lithium-3,5-diiodosalicylat (LIS) resistent sind. Bei DNA-Halos ist die DNA, die mit MARs/SARs assoziiert ist, im Restkern gebunden, während sich die DNA-Schleifen von diesen Stellen weg erstrecken und den DNA-Halo bilden. Wir wissen heute, dass das Genom über Lamina-assoziierte Domänen (LADs) in der Kernlamina und durch nukleoläre assoziierte Regionen (NADs) und möglicherweise durch andere Kernstrukturen wie bestimmte Kernkörper verankert ist.
Die DNA-Halo-Methode kann für die physikalische Kartierung von DNA, Genen und Chromosomenregionen verwendet werden, da die erweiterte DNA und das Chromatin eine höhere Auflösung bieten, da das Chromatin von Histonen befreit und die DNA gedehnt wird 2,3,4,5,6. Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung von DNA-Halos für diese Anwendung. Zum Beispiel kann DNA, die eng mit Restkernen von DNA-Halos assoziiert ist, für Sonden unzugänglich sein, so dass sie von der Analyse und physikalischen Kartierung ausgeschlossenist 6. Andere Techniken wie fiber-FISH 2,4,5,7 und molekulares Kämmen8 ermöglichen ebenfalls eine physikalische Kartierung und haben den Vorteil, dass sie relativ schnell und einfach durchzuführen sind. Beide werden bevorzugt für die DNA-Kartierung von Genen über DNA-Halos verwendet. Bei diesen Methoden werden Chromatinfasern durch die Verwendung von Lösungsmittel- oder Salzextraktionen aus dem Zellkern extrahiert, wobei das molekulare Kämmen tendenziell eine bessere Reproduzierbarkeit aufweist 8,9.
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass das Nukleoskelett eine Rolle bei der Unterstützung wichtiger Kernprozesse spielt, wie z. B. Anheftungsstellen für DNA, Chromatinumbau, DNA-Transkription, DNA-Reparatur und DNA-Replikation11,12. Daher wurde die DNA-Halo-Technik entwickelt, um die Wechselwirkungen zwischen dem Nukleoskelett und dem Genom während dieser zellulären Aktivitäten zu untersuchen, und wurde routinemäßig in der Forschung eingesetzt und berichtet. Diese Technik wurde auch verwendet, um Wechselwirkungen zwischen dem Genom und dem Nukleoskelett in Bezug auf das Fortschreiten der Krankheit zu untersuchen, wobei malignitätsassoziierte Veränderungen in der Kernstruktur identifiziert wurden11.
Die DNA-Halo-Technik wurde auch verwendet, um die Beziehung zwischen dem Genom und dem Nukleoskelett während der Entwicklung und Differenzierung zu untersuchen12. In einer Reihe von Studien wurde eine Variation der DNA-Halo-Technik verwendet, die als Halosperm13 oder SpermHalo-FISH bekannt ist, wenn sie mit FISH14 gekoppelt ist. Das Chromatin der Spermien ist eng an Proteine gebunden, die als Protamine bekannt sind, und diese Technik wurde entwickelt, um den Zugang zur Spermien-DNA zu verbessern. Halosperm wurde verwendet, um die Integrität der DNA der Spermien zu untersuchen und festzustellen, ob DNA-Schäden vorhanden sind. Spermien mit weniger DNA-Schäden korrelieren mit einer größeren DNA-Halo-Größe, während Spermien mit einem erhöhten Anteil an fragmentierter und beschädigter DNA entweder kleine oder gar keine Halos hatten. Somit kann Halosperm als potenzieller prognostischer Marker für die Qualität des Embryos und eine erfolgreiche Schwangerschaft mit IVFverwendet werden 13. Dieses Beispiel verdeutlicht die potenziellen klinischen Anwendungen dieser Technik. In unserer Arbeit haben wir HALO-FISH verwendet, um Veränderungen im Genomverhalten und die Wirkung spezifischer medikamentöser Behandlungen bei der vorzeitigen Alterung des Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndroms (HGPS) zu untersuchen15.
Zusammen verdeutlichen diese und andere Studien die Bandbreite der Prozesse/Anwendungen, die mit der DNA-Halo-Technik untersucht werden können, und den Nutzen der Technik.
Protocol
1. Objektträgerpräparation, Sterilisation und Zellkultur Bereiten Sie 500 ml 10% HCl (v/v) vor und gießen Sie sie in ein großes Becherglas. Lassen Sie die Objektträger einzeln in die Säure fallen und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur auf einem auf 2 x g eingestellten Shaker.ACHTUNG: HCl ist ätzend und reizend. Es kann zu schweren Hautverbrennungen und Augenschäden und Reizungen der Haut, der Augen und der Atemwege führen. Stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Nitrilhandschuhe, Augenschutz und eines Laborkittels. Säure aus dem Becherglas umfüllen und die Objektträger zehnmal in Leitungswasser und dann weitere zehn Mal in deionisiertem Wasser waschen. Objektträger zweimal in Methanol spülen und bis zur Sterilisation durch Abflammen in Methanol aufbewahren.ACHTUNG: Methanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und giftig, wenn es verschluckt, mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Darüber hinaus kann Methanol Organe schädigen, ist ätzend und reizend. Halten Sie sich an die Expositionsgrenzwerte am Arbeitsplatz und stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Butylgummihandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel. Wenn möglich, in einem Abzug mit lokaler Abluft (LEV) behandeln. Nehmen Sie mit einer Metallzange oder einer langen Pinzette einen Objektträger aus dem Becherglas mit Methanol. Zum Sterilisieren über einem Bunsenbrenner flammen und in ein rechteckiges Zellkulturgefäß mit vier Fächern für Objektträger überführen, das sich in der Nähe des Bunsenbrenners befindet.VORSICHT: Das Abflammen ermöglicht die sofortige Sterilisation von Objektträgern vor der Verwendung; Diese Methode birgt jedoch auch Gefahren. Da Methanol leicht entzündlich ist, ist es wichtig, dass das Becherglas mit den Objektträgern vom Bunsenbrenner entfernt positioniert wird. Es sollte eine lange Zange oder Pinzette verwendet werden, die die Objektträger fest umklammert. Der Methanolstand im Becherglas sollte nur die Objektträger abdecken, um sowohl die Menge des verwendeten Methanols zu minimieren als auch nur die Enden der Pinzette/Zange mit dem Methanol in Kontakt zu bringen. Vergewissern Sie sich immer, dass das Methanol nach Gebrauch aus der Pinzette oder Zange verdunstet ist und diese abgekühlt sind, bevor Sie es wieder in das Becherglas mit den Objektträgern und dem Methanol geben. Das Becherglas sollte mit einem Stück Alufolie abgedeckt werden, um den Sauerstoff auszuhungern, falls das Methanol Feuer fängt. Niemals Flammengleiter in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II, in der die Luft zirkuliert. Alternativ können Sie die Schritte 1.1 bis 1.4 ausführen, aber anstatt die Objektträger nach dem Inkubieren mit Methanol zu entflammen, legen Sie die Objektträger zum Trocknen an der Luft auf ein fusselfreies Papier. Nach dem Trocknen in Alufolie einwickeln und in einen Sterilisatorofen oder Autoklaven geben. Zellen im entsprechenden Medium mit Serum für mindestens 48 h bei 37 °C in 5% CO2 kultivieren, bis eine Konfluenz von 60-70% erreicht ist. Dieses Protokoll wurde an einer frühen Passage von humanen dermalen Fibroblasten (HDFs) und an klassischen Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom (HGPS)-Fibroblasten (AG06297) und atypischen Typ 2 HGPS-Fibroblasten (AG08466) durchgeführt. Ernten Sie jeden Zelltyp und zählen Sie ihn mit einem Hämozytometer, um die Zelldichte zu bestimmen. Samen: 1 x 105 Zellen in 10 ml Medium pro Objektträger.HINWEIS: Die Zelldichte ist wichtig, da DNA-Schleifen aus verschiedenen Kernen konvergieren können, wenn die Zellen zu konfluent werden. Je nach verwendetem Zelltyp müssen die Seeding-Dichten möglicherweise optimiert werden, da sich transformierte Zellen schneller vermehren können, während spätere Zellkulturen länger brauchen können, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen. Wenn die Zellen in G0 arretiert werden müssen, um in Ruhe zu kommen, säen Sie 1 x 105 Zellen ( in 10 ml Medium) pro Objektträger aus und lassen Sie sie 24 Stunden lang wachsen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium und inkubieren Sie 7 Tage lang in einem Standardmedium, das eine niedrigere Serumkonzentration von 0,5 % enthält (Neugeborenen-Kälberserum, NCS; oder fetales Kälberserum, FBS). Wenn der proliferative Status der Zellen für den DNA-Halo-Assay erforderlich ist, werden Zellen, die die S-Phase durchlaufen haben, durch den Einbau von 5-Brom-2′-desoxy-uridin (BrdU) in die DNA während der Replikation bestimmt.Samenzellen wie gewohnt und wachsen 24 Stunden lang. Entfernen Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch ein Medium, das BrdU und 5-Fluor-2′-Desoxyuridin (3 μg/μl) enthält. Nach weiteren 24 h entnehmen Sie das Medium, waschen die Zellen einmal mit Medium (10 % NCS) und füttern es dann erneut mit frischem Medium (10 % NCS). Inkubieren Sie weitere 24 Stunden und bereiten Sie dann die Objektträger für den DNA-Halo-Assay vor. 2. Vorbereitung der Sonde Chromosomen-Ganz- und Arm-Painting-SondenStellen Sie Chromosomensonden aus der Amplifikation von flusssortierten oder mikrodissektierten Chromosomen durch degenerierte Oligonukleotid-geprimte Polymerase-Kettenreaktion (DOP-PCR) unter Verwendung der Methode von Telenius et al.16 her. Verwenden Sie die DOP-PCR, um Chromosomensonden entweder mit Biotin-16-dUTP oder Digoxigenin-11-dUTP zu markieren, wie in Tabelle 1 gezeigt. Bitte überprüfen Sie die Anweisungen des Herstellers für das Amplifikationsprofil, die für dieses Experiment verwendeten Bedingungen sind jedoch in Tabelle 2 aufgeführt. Bereiten Sie eine Arm- oder Ganzchromosomensonde vor, indem Sie 8 μl markiertes PCR-Produkt, 7 μl Cot-1-DNA, 3 μl Heringssperma, 1/20Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,4) und 2 Volumina 100%iges Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie die Sondenlösung mindestens 30 Minuten lang bei -80 °C.HINWEIS: Diese Methode kann verwendet werden, um einzelne Chromosomensonden oder mehrere Chromosomensonden zu erstellen, wenn für jedes Chromosom von Interesse unterschiedliche Markierungen (d. h. Biotin-16-UTP und Digoxigenin-11-dUTP) verwendet werden.VORSICHT: Ethanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und Dampf und kann schwere Augenreizungen verursachen. Von Hitze, heißen Oberflächen und Zündquellen fernhalten. Halten Sie sich an die Expositionsgrenzwerte am Arbeitsplatz und stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Butylgummihandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel. Griff nach Möglichkeit in einem LEV-Abzug. Sondenlösung bei 13.700 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend mit 70%igem Ethanol waschen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang und entsorgen Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten müssen, das DNA-Pellet nicht zu stören oder zu verlieren. Lassen Sie das DNA-Pellet trocknen. Fügen Sie dem DNA-Pellet 12 μl Hybridisierungspuffer (50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 10 % 20x salzhaltiges Natriumcitrat (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat; pH 7,0), 1 % (v/v) Polyoxyethylensorbinalmonolaurat (Tween-20)) hinzu. Mindestens 2 h bei 37 °C stehen lassen, damit sich das DNA-Pellet im Hybridisierungspuffer auflösen kann.VORSICHT: Formamid ist krebserregend und teratogen und kann daher ein ungeborenes Kind ernsthaft schädigen. Wenn eine Frau schwanger ist oder den Verdacht hat, schwanger zu sein, sollte sie die Arbeit mit Formamid vermeiden. Formamid sollte in einem LEV-Abzug verwendet werden. Halten Sie sich an die Expositionsgrenzwerte am Arbeitsplatz und stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Butylgummihandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel. DNA-Isolierung aus bakteriellen künstlichen Chromosomen (BACs)Streichen Sie einen kleinen Teil des Glycerinbestands aus dem BAC-Klon auf eine Luria-Bertani (LB)-Agarplatte (1 % (W/V) NaCl; 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 1,5 % (w/v) Agar Technical, 12,5 μg/ml (w/v) Chloramphenicol). Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte aus und beimpfen Sie 10 ml LB-Bouillon (1 % (w/v) NaCl, 1 % (w/v) Baktotrypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 12,5 μg/ml (w/v) Chloramphenicol). Lassen Sie die Lösung über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelbrutkasten stehen.ACHTUNG: Chloramphenicol steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Mit Vorsicht behandeln und die Exposition reduzieren. Kultur bei 1.700 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 300 μl P1-Lösung (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A) hinzu. Wirbeln Sie kräftig vor und übertragen Sie die Zellen in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 300 μl P2-Lösung (0,2 M NaOH, 1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) tropfenweise in die Zellen geben. Drehen Sie das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen 5 Mal um und lassen Sie es maximal 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen.VORSICHT: Natriumhydroxid ist ätzend und kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Es kann korrosiv für Metalle sein. Mit Vorsicht behandeln und die Exposition reduzieren. Halten Sie sich an die Expositionsgrenzwerte am Arbeitsplatz und stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Nitrilgummihandschuhe, Augenschutz und Laborkittel. Griff nach Möglichkeit in einem LEV-Abzug.VORSICHT: Natriumdodecylsulfat ist ein brennbarer Feststoff, der beim Verschlucken schädlich ist und Haut- und Atemwegsreizungen verursachen kann. Es kann auch zu schweren Augenschäden kommen. Stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Nitrilgummihandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel. Griff nach Möglichkeit in einem LEV-Abzug. 300 μl P3 (3 M Kaliumacetat) langsam zu den Zellen geben und vorsichtig mischen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen für 10 Minuten auf Eis. Bei 8.100 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand in ein Röhrchen mit 800 μl eiskaltem Isopropanol überführen. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um und inkubieren Sie es über Nacht bei -20 °C.VORSICHT: Isopropanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und Dampf und kann schwere Augenreizungen, Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen. Von Hitze, heißen Oberflächen und Zündquellen fernhalten. Halten Sie sich an die Expositionsgrenzwerte am Arbeitsplatz und stellen Sie sicher, dass ein angemessener persönlicher Schutz getragen wird, einschließlich Nitrilgummihandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel. Wenn möglich, in einem LEV)Abzug behandeln. Bei 8.100 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein anderes Röhrchen um. Fügen Sie 500 μl eiskaltes 70%iges Ethanol hinzu. Röhrchen mehrmals umdrehen und bei 8.100 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Sobald das Pellet trocken ist, wird es in 40 μl mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser (DEPC-behandelt) erneut suspendiert und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Nach der vollständigen Resuspension entfernen Sie 5 μl der Lösung und laden Sie ein 1%iges Agarosegel auf, um das Vorhandensein von DNA zu überprüfen. Einzelgensondenpräparation von BACs mittels Nick-TranslationVerwenden Sie handelsübliche Beschriftungssätze für die Nick-Übersetzung. Alternativ können Sie auch das folgende Protokoll verwenden. Siehe Tabelle 3 für Bestandteile und Volumen. Die Bestandteile aus Tabelle 3 zusammen in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und zuletzt die DNA-Polymerase I hinzufügen, vorsichtig mischen und einige Sekunden kurz zentrifugieren. Die Lösung wird bei 15 °C für 2 h inkubiert. Um die Fragmentgröße zu überprüfen, laden Sie 5 μl der Lösung auf ein 2%iges Agarosegel. Der Größenbereich der DNA-Fragmente sollte zwischen 200 und 600 bp liegen. Wenn die DNA-Fragmentgrößen größer sind, inkubieren Sie die Lösung weitere 15 Minuten bei 15 °C und lassen Sie die Produkte auf 2%igem Agarosegel laufen. Stoppen Sie die Nick-Translationsreaktion durch Zugabe von 10 mM EDTA, 0,1 % SDS (2,5 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0 in 100 μl und 1 μl 10 % SDS in 100 μl). Erhitzen Sie die Lösung bei 65 °C für 5 min. Um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen, legen Sie eine BAC-Sonde auf eine Spinsäule auf. Kommerzielle Spin-Säulen können gekauft oder mit einer Spritze wie folgt hergestellt werden: Fügen Sie 30 g Sephadex G-50 auf 500 ml Säulenpuffer (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) hinzu. Autoklavieren Sie die Mischung. Stellen Sie außerdem 500 ml Säulenpuffer (ohne Sephadex G-50) her und autoklavieren. Stellen Sie Spin-Säulen her, indem Sie autoklavierte Glaswolle auf den Boden einer 1-ml-Spritze geben. Füllen Sie die 1-ml-Spritze mit Sephadex G-50 im Säulenpuffer. Legen Sie 1 ml Spritze in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das ein Mikrozentrifugenröhrchen ohne Deckel am Boden hat. Bei 1.600 x g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie die Spritze und entsorgen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen an der Unterseite. Geben Sie ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen wieder in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Säulenpuffer (ohne Sephadex G-50) in die 1-ml-Spritze geben und wieder in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen einsetzen. Bei 1.600 x g für 5 min zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Nehmen Sie die Spritze heraus und führen Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen ein, das ein neues, sauberes Mikrozentrifugenröhrchen enthält. Setzen Sie die Sonde auf die Spritze und sammeln Sie die Sonde im Mikrozentrifugenröhrchen. Um die DNA-Sonde auszufällen, werden der DNA-Lösung 5 μl Heringsspermien-DNA (10 mg/ml), 10 μl Natriumacetat und 2,25 Volumen 100%iges Ethanol hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und inkubieren Sie sie bei -80 °C für mindestens 1 h. Bei 13.700 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 200 μl eiskaltem 70 %igem Ethanol 15 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen das Pellet in 20 μl DEPC-behandeltem Wasser bei Raumtemperatur für mehrere Stunden oder über Nacht bei 4 °C erneut suspendieren. Die Sonde ist nun einsatzbereit oder kann bei -20 °C gelagert werden. Mischen Sie für jeden Objektträger 5 μl Sonden-DNA mit 5 μl Cot-1-DNA und trocknen Sie sie mit einem Speed Vac-Vakuumkonzentrator. Sobald das Pellet getrocknet ist, resuspendieren Sie es in 12 μl Hybridisierungsmischung. 3. DNA-Halo-Präparation Nehmen Sie die quadratische Kulturschale mit den Objektträgern und den daran befestigten Zellen aus dem Inkubator. Verwerfen Sie das Medium, beschriften Sie die Objektträger mit einem Bleistift und legen Sie sie in ein Coplin-Glas mit 50 ml eiskaltem Zytoskelettpuffer (CSK): 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M Saccharose, 10 mM 1, 4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES; pH 7,8), 0,5 % (v/v) Triton X-100 in deionisiertem Wasser. 15 min auf Eis oder bei 4 °C inkubieren.VORSICHT: Triton X-100 kann Hautreizungen und schwere Augenschäden verursachen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Nitrilhandschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Verwerfen Sie den CSK-Puffer und spülen Sie die Objektträger dreimal schnell in 50 mL 1x DNA-Halo-Puffer (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mMKH2PO 4; pH 7,4) aus, d. h. tauchen Sie den Objektträger dreimal in ein Coplin-Glas mit DHB und entfernen Sie ihn. Übertragen Sie Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 ml Extraktionspuffer: 2 M NaCl, 10 mM PIPES (pH 6,8), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 % (w/v) Digitonin, 0,05 mM (v/v) Spermin, 0,125 mM (v/v) Spermidin. 4 min bei Raumtemperatur inkubieren.ACHTUNG: Digitonin ist giftig, wenn es verschluckt wird oder mit der Haut in Berührung kommt, und ist tödlich, wenn es eingeatmet wird. Stellen Sie sicher, dass Digitonin in einem LEV-Abzug gehandhabt wird, und tragen Sie einen Laborkittel, Nitrilhandschuhe (doppelt behandschuht), eine Schutzbrille und eine Maske. Sowohl Spermin als auch Spermidin können schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen, während EDTA schwere Augenreizungen verursacht, daher sollten Sie jede Chemikalie mit Vorsicht behandeln.Anmerkungen: Bereiten Sie Digitonin separat zu, indem Sie das Pulver in Wasser bei einer Temperatur von 60-70 °C auflösen. Fügen Sie gelöstes Digitonin nach dem Abkühlen dem Extraktionspuffer hinzu. Zuletzt werden Spermin, Spermidin und Digitonin in den Extraktionspuffer gegeben, um die biologische Aktivität zu erhalten. Objektträger werden nacheinander in 50 mL 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO4, 150 mMKH2PO4; PH7.4), 5x, 2x und 1x DHB für jeweils 1 min. Tauchgleiter (Straight-In und Straight-Out) durch eine sequenzielle 50-ml-Ethanolserie von 10 %, 30 %, 70 % und 95 % (v/v) Ethanol. Objektträger an der Luft trocknen und bei -80 °C lagern, bis eine zweidimensionale Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (2D-FISH) durchgeführt wird. 4. Zweidimensionale Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Machen Sie 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat, pH 7,0. Dieser Puffer kann autoklaviert, bei Raumtemperatur gelagert und nach Bedarf verdünnt werden. 70% (v/v) Formamid herstellen, 2x SSC pH 7,0 und im Wasserbad auf 70 °C erhitzen. Inkubieren Sie Objektträger jeweils 5 Minuten lang durch eine sequenzielle 50-ml-Ethanolreihe von 70, 90 und 100 % Ethanol. Auf einer Warmhalteplatte lufttrocknen lassen und bei 70 °C 5 min backen. Denaturierung der Objektträger durch Einlegen in die 70%ige Formamid, 2x SSC-Lösung für 2 min bei 70 °C.Anmerkungen: Die Temperatur und das Timing sind für Schritt 4.5 entscheidend. Wenn die Temperatur ist, wird die DNA nicht denaturieren und die Sonden werden nicht hybridisieren, und es wird kein Signal von DNA-Halo-FISH erhalten. Legen Sie den denaturierten Objektträger 5 Minuten lang in 50 ml eiskaltes 70%iges Ethanol und nehmen Sie ihn jeweils 5 min lang bei Raumtemperatur durch eine Ethanolreihe von 90 %, 95 % und 100 %. Auf einem Warmhalteteller an der Luft trocknen lassen Behandeln Sie direkt beschriftete menschliche Chromosomensonden gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für diese Experimente verwendeten wir die menschlichen Ganzchromosomenfarben 1, 13, 15, 17 und 18. Zusätzlich wurden in diesem Experiment CCND1- und CTNNA1-Gensonden verwendet. HINWEIS: Sowohl die gesamten Chromosomensonden als auch die BAC-Gen-spezifischen Sonden wurden mit Biotin-11-dUTP markiert und durch Streptavidin, das an Cyanin 3 (Cy3) konjugiert ist, nachgewiesen. Für die mittels (DOP-PCR) hergestellten Chromosomen-Färbungssonden und durch Nick-Translation markierte BAC-DNA werden diese ab diesem Zeitpunkt im Protokoll als DNA-Sonden bezeichnet und wie folgt behandelt. Denaturieren Sie die DNA-Sonde (Vollchromosomenfarbe oder genspezifische Sonde) bei 75 °C für 10 min in einem Hot-Block- oder Wasserbad. Erwärmen Sie DNA-Sonden 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Hot-Block- oder Wasserbad, bevor Sie 10 μl auf den entsprechenden Objektträger pipettieren.HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um sich wiederholende Chromosomensequenzen zu blockieren. Andernfalls können unspezifische Signale im DNA-Halo-FISH erzeugt werden. Sonde mit einem Deckglas von 21 mm x 21 mm überlagern und mit Gummizement versiegeln. Objektträger werden mindestens 18 h bei 37 °C in einer befeuchteten Hybridisierungskammer inkubiert.HINWEIS: Befeuchtete Hybridisierungskammern können aus Sandwichboxen hergestellt werden, die mehrere Schichten angefeuchtetes Gewebe und eine erhöhte Plattform aus geschnittenen 10-ml-Kunststoffpipetten enthalten, auf der die Objektträger ruhen. Diese ist mit Alufolie abgedeckt, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Entfernen Sie den Gummizement vorsichtig mit einer Pinzette. Inkubation der Objektträger in 50 ml 50%igem (v/v) Formamid, 2x SSC, pH 7,0-Lösung, die auf 45 °C vorgewärmt wurde, für drei 5-minütige Inkubationen.Anmerkungen: Lassen Sie das Deckglas in der ersten Inkubation in 50% (v/v) Formamid, 2x SSC, pH 7,0-Lösung vom Objektträger fallen. Dadurch wird eine Beschädigung des DNA-Halo-Präparats verhindert, die durch das “Wegziehen” des Deckglases verursacht werden könnte. Die Objektträger können im Puffer durch Greifen mit einer Pinzette bewegt werden, um das Deckglas zu lösen. Als nächstes legen Sie die Objektträger in 50 ml 0,1x SSC, pH 7,0-Lösung, die auf 60 °C vorgewärmt, aber in ein 45 °C-Wasserbad gestellt wurde. Inkubieren Sie 5 Minuten lang und ersetzen Sie den Puffer zwei weitere Male durch 5-minütige Inkubationen. Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 ml 4x SSC, pH 7,0-Lösung bei Raumtemperatur geben und 15 Minuten lang mit drei Pufferwechseln inkubieren. Tragen Sie 100 μl 4%ige BSA, 4x SSC-Lösung auf jeden Objektträger auf und überziehen Sie ihn mit einem Stück Paraffinfilm. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Dadurch wird eine unspezifische Bindung des Antikörpers verhindert. Um die markierte Sonde (Biotin-16-dUTP) nachzuweisen, wird mit 100 μL eines 1:200 (hergestellt in 1% BSA, 4x SSC) Streptavidin-Cy3 für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers bei der Verdünnung der Antikörper und der Testverdünnung vor dem Experiment, um sicherzustellen, dass ein gutes Signal erzeugt wird Die Objektträger in ein Coplin-Glas mit 50 ml 4x SSC (0,5 % Tween-20) pH 7,0-Lösung bei Raumtemperatur geben und 15 Minuten lang mit drei Pufferwechseln inkubieren. Objektträger können in diesem Stadium montiert werden, wie in Schritt 4.21 gezeigt, wenn keine Immunfluoreszenz erforderlich ist. Wenn der proliferative Status von Zellen, die zu DNA-Halos gemacht wurden, erforderlich ist, färben Sie nach den FISH-Schritten vor dem Einbetten mit Anti-pKi67-Antikörpern oder färben Sie sie für eingebautes BrdU.Objektträger 3 Mal für jeweils 5 min in 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, gefolgt von Blockierung mit 4% NCS in PBS für 1 h bei Raumtemperatur. Tragen Sie 200 μL des erforderlichen Primärantikörpers (rabbit anti-human pKi67; mouse anti-BrdU) auf den Objektträger auf, überlagern Sie ihn mit einem Streifen Paraffinfilm und inkubieren Sie ihn 1 h lang bei Raumtemperatur. Objektträger 3 mal für 5 min in 1x PBS waschen und bei Raumtemperatur 1 h in 200 μL Fluorochrom-konjugiertem Sekundärantikörper inkubieren (pKi67: Schweine-Anti-Kaninchen-TRITC; BrdU: Esel Anti-Maus Cy3). Führen Sie 3 weitere 5-minütige Wäschen mit PBS durch. Alle Verdünnungen müssen mit 1 % (v/v) NCS in PBS im vom Hersteller empfohlenen Verdünnungsbereich durchgeführt werden. Objektträger in 20 μl DAPI-haltigem Eindeckmittel einlegen und mit einem 22 mm x 50 mm Deckglas überziehen. 5. Telomer-PNA-FISCH Um Telomere zu erkennen, verwenden Sie das Telomer-PNA-FISH-Kit – FITC; Führen Sie den Vorgang gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Das Verfahren sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Tauchen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in trisgepufferte Kochsalzlösung (TBS, pH 7,5) und legen Sie sie dann genau 2 Minuten lang in 3,7%iges Formaldehyd (in TBS; v/v).ACHTUNG: TBS-Lösung enthält 10-30% Trometamol und 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diolhydrochlorid. Dies kann zu schweren Augen- und Hautreizungen führen, tragen Sie daher Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz. In einem gut belüfteten Bereich verwenden. Waschen Sie die Objektträger in einem Coplin-Glas zweimal mit TBS für jeweils 5 Minuten. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in die Vorbehandlungslösung und waschen Sie sie dann zweimal mit TBS für 5 Minuten pro Waschgang. Als nächstes führen Sie die Objektträger 2 Minuten lang pro Konzentration durch eine eiskalte Ethanolserie, die aus 50 ml 70 %, 85 % und 95 % (v/v) Ethanol besteht. Lassen Sie die Objektträger anschließend an der Luft trocknen. Tragen Sie 10 μl Telomer-PNA-Sonde/FITC (oder Cy3) auf, je nach Wahl der Fluoreszenz-Tag-Färbung auf jeden Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Im vorgeheizten Backofen bei 80 °C 5 min inkubieren und dann für ca. 1 h dunkel stellen.VORSICHT: Telomer-PNA-Sonde/FITC enthält 6-100% Formamid, das schwere Augenreizungen verursacht und teratogen ist, so dass es einem ungeborenen Kind ernsthafte Schäden zufügen kann. Wenn eine Frau schwanger ist oder den Verdacht hat, schwanger zu sein, sollte sie die Arbeit mit Formamid vermeiden. Formamid sollte in einem LEV-Abzug verwendet werden und ein geeigneter Augen- oder Gesichtsschutz sollte getragen werden. Um die Deckgläser zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger 1 Minute lang in “Spüllösung” und legen Sie sie dann für 5 Minuten bei 65 °C in die “Waschlösung”.ACHTUNG: Waschlösung enthält 1-5% Polyoxyethylenoctylphenylether und 1-5% Natriumchlorid. Dies ist ätzend und kann schwere Augenschäden verursachen. Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit der Waschlösung eine Schutzbrille oder ein Gesichtsschutz getragen wird. Inkubieren Sie Objektträger durch eine 50-ml-eiskalte Ethanolreihe (70 %, 85 % und 95 % (v/v)) für 2 Minuten pro Konzentration und trocknen Sie sie dann an der Luft. Nach dem Trocknen den Objektträger mit DAPI-haltigem Eindeckmittel einlagern und mit einem Deckglas überziehen. 6. Bilderfassung und -analyse Um DNA-Halos und Chromosomenterritorien sichtbar zu machen, verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop (z. B. Leica DM4000 Mikroskop), das Bilder mit einem HC PL FLUOTAR 100X/1.30 Ölobjektiv und einer DFC365FX-Kamera aufnimmt. Nehmen Sie Graustufenbilder auf und definieren Sie die Farbe für jeden aufgenommenen Kanal, um die Pseudofärbung von Bildern zu ermöglichen. In diesem Experiment wurde eine kommerzielle Software verwendet (z. B. LAS AF Version 4.5.0). Die einzelnen Farbkanäle wurden als TIFFs exportiert. Analysieren Sie Bilder mit dem Java-Bildverarbeitungsprogramm Fiji ImageJ. Laden Sie das Bild hoch, indem Sie auf Datei und Öffnen klicken. Laden Sie separate Bildkanäle oder teilen Sie ein zusammengesetztes Bild in separate Graustufenkanäle auf, indem Sie auf Bild | Farbe | Geteilte Kanäle. Wählen Sie einen Bildkanal aus und klicken Sie auf Bild | Passen Sie an , und wählen Sie dann Helligkeit & Kontrast aus. Ändern Sie den Vorgang entsprechend und wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Kanälen. Erstellen Sie eine Maske des Restkerns, indem Sie den DAPI-gefärbten Kanal auswählen, der den Kern darstellt. Klicken Sie auf Bild | Passen Sie an , und wählen Sie dann Schwellenwert aus. Es erscheint ein Dialogfeld, in dem der Schwellenwert geändert werden kann, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Dunkler Hintergrund . Ändern Sie, bis der Restkern frei ist, und klicken Sie auf Anwenden und schließen Sie das Dialogfeld.HINWEIS: Dadurch wird eine binäre Maske basierend auf der Pixelintensität erstellt, wobei weiße Pixel Interessenbereiche und schwarze Pixel den Hintergrund anzeigen. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang auf dem Sondenkanal. Verwenden Sie die Freihandauswahl, um die Peripherie des Restkerns zu umreißen, und klicken Sie dann auf “Bearbeiten und außen löschen”. Überlagern Sie den Sondenkanal mit dem Restkern. Dies kann durch Drücken von Bild| Farbe | Kanäle zusammenführen. Um den Messmaßstab in ImageJ festzulegen, zeichnen Sie eine Linie auf der Maßstabsleiste oder zwischen den Punkten zweier bekannter Entfernungen. Gehen Sie zu Analysieren und drücken Sie Skalierung festlegen. Fügen Sie im Dialogfeld die Entfernungslänge hinzu und klicken Sie auf OK. Um Entfernungen zu messen, ziehen Sie eine Linie zwischen den zu messenden Punkten, und klicken Sie auf Analysieren | Messen. Dadurch werden die Entfernungswerte in ein Datenfenster übertragen. Messen Sie die hellste DAPI-Intensität, da diese mit dem Zentrum des Kerns übereinstimmt. Daraus ergibt sich die Distanz vom Kernzentrum bis zum am weitesten entfernten Chromosomenterritoriumsrand (CTE). Messen Sie den Abstand des Kernzentrums zum Kernrand (NE). Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse als CTE/NE-Verhältnis dargestellt werden. Dabei wird der Abstand vom Kernzentrum zu jedem am weitesten entfernten Chromosomenterritoriumsrand (CTE) durch den Abstand vom Kernzentrum zum jeweiligen Kernrand (NE) geteilt. Dies sollte an mindestens 50 Kernen durchgeführt werden. Dies kann als Balken- oder Boxdiagramm dargestellt werden. Analysieren Sie für die Analyse der Telomere mindestens 30 Kerne pro Datensatz. Die Bilder können mit Fiji ImageJ oder manuell analysiert werden, um die Anzahl der Telomere im Restkern und im DNA-Halo zu zählen. BrdU oder pKi67 ermöglichten die Differenzierung von proliferierenden (BrdU/piK67+) und seneszenten/ruhenden (BrdU/pKi67-) Kernen. Die Daten können in Balkendiagrammen mit Fehlerbalken dargestellt werden, die dem Standardfehler des Mittelwerts (SEM) entsprechen. Verwenden Sie den Schüler-t-Test (ungepaart), um die Ergebnisse statistisch zu vergleichen, wobei p> 0,05 als signifikant angesehen wird.
Representative Results
Diese Methode der DNA-Halo-Präparation hat uns bei unseren Bemühungen geholfen, Unterschiede im Genomverhalten innerhalb junger und alter Zellen zu bestimmen, aber auch in Zellen, die von vorzeitigen Alterungskrankheiten mit aberranten Nukleoskelettproteinen stammen15. Abbildung 1 zeigt Beispiele für DNA-Halos, bei denen es möglich ist, den Rand eines Restkerns, die im Restkern verbleibende DNA und die nicht gebundene DNA, die in die Umgebung gespult wurde, zu sehen, wodurch ein DNA-Halo entsteht. Es zeigt auch die Analyse, die zeigt, wie der Restkern gewonnen wird, sowie die NE- und CTE-Messungen. Es ist möglich, zwischen proliferierenden und nicht-proliferierenden Zellen zu unterscheiden, indem man entweder ein markiertes Nukleotid wie BrdU einbaut, wenn sich Zellen in der S-Phase befinden, oder indem man den diagnostischen Proliferationsmarker anti-pKi67 verwendet, der Nukleolen und Regionen von Heterochromatin in G1-Zellen aufdeckt17,18. Primärzellen, die in hohem Serumgehalt gezüchtet wurden, ohne Konfluenz zu erreichen, die negativ für die Proliferationsmarker sind, werden als seneszent angenommen. Primärzellen, die in niedrigem Serum gezüchtet wurden oder konfluent geworden sind, d.h. kontakthemmend sind und negativ für die Proliferationsmarker sind, gelten als ruhend und wären in der Lage, bei den richtigen Nährstoffen und der richtigen Situation wieder in den proliferativen Zellzyklus einzutreten. Die Fähigkeit, zwischen Ki67-positiven und -negativen Zellen zu unterscheiden, hat es uns ermöglicht, Unterschiede zwischen proliferierenden, ruhenden und seneszenten humanen dermalen Fibroblasten zu bestimmen. Abbildung 2 zeigt DNA-Halos von proliferierenden humanen dermalen Fibroblasten, die aus Zellen gebildet wurden, in die BrdU während der DNA-Replikation eingebaut wurde, ein Mechanismus, der in nicht-proliferierenden Zellen nicht auftritt, und anschließend mit Anti-BrdU-Antikörpern gefärbt wurden. Die Färbung mit dem proliferativen Marker anti-pKi67-Antikörper ist ebenfalls in Abbildung 2 zu sehen. Dies ist ein robustes Antigen und überlebt das FISH-Protokoll und kann daher für die Post-FISH- und Pre-Mount gefärbt werden. So sind proliferierende Zellen positiv (rot) für BrdU und anti-pKi67 (rot) in der linken Spalte und nicht-proliferierende Zellen, tatsächlich seneszente Zellen in Abbildung 2, in der rechten Spalte. Bei den grünen Signalen handelt es sich um einzelne Telomere, die mit einem Telomer-PNA-FISH/FITC-Kit aufgedeckt werden. Die Kombination von Immunfluoreszenz mit DNA-Halos ermöglicht die Analyse in verschiedenen Zellzuständen, wie in Abbildung 2 bei der Untersuchung von proliferierenden, ruhenden und seneszenten Zellen gezeigt. Je nach gewähltem Antikörper können weitere Bedingungen untersucht werden, wie z.B. Differenzierung, DNA-Schädigung durch Bestrahlung etc. Chromosomenterritorien können auch innerhalb von DNA-Halos mit FISH sichtbar gemacht werden. Aufgrund des Präparats, das das Ausspulen von DNA aus den Zellkernen ermöglicht, kann die Form des Chromosomenterritoriums gestört sein, wobei kleinere oder größere Mengen des Chromosoms im DNA-Halo gefunden werden, abhängig von der Verankerung des Genoms im Restkern und seinen Strukturen. Abbildung 3 zeigt eine Tafel von DNA-Halos, wobei einzelne Chromosomen mit spezifischen Ganzarmchromosomen-Farbsonden (rot) für die Chromosomen 1, 13, 17 und 18 aufgedeckt wurden. Anti-pKi67 (grün) wurde verwendet, um proliferierende Zellen und ihr Fehlen innerhalb derselben Kultur auf demselben Objektträger zu markieren, die seneszente Zellen kennzeichnen. Aus den Bildern und den Daten, die als CTE/NE dargestellt werden, geht hervor, dass es sich bei dem kleinen genarmen Chromosom 18 um ein Chromosom handelt, das nur wenige Anhänge aufweist und weiter in den DNA-Halo hinein von den Restkernen entfernt ist und deutlich weiter von der Mitte der Restkerne entfernt ist als die anderen Chromosomen. Dies gilt aber auch für Chromosom 1. Mit Hilfe des proliferativen Markers anti-pKi67 war es auch möglich, proliferierende Zellen mit seneszenten Zellen innerhalb derselben Kultur und auf demselben Objektträger zu vergleichen, und diese Analyse hat gezeigt, dass sich die Chromosomen innerhalb dieser beiden sehr unterschiedlichen Zellzustände in Bezug auf die Bindung an die verbleibenden Kernstrukturen nicht signifikant voneinander unterscheiden. Interessanterweise zeigen Gene auch statistisch signifikante Unterschiede zwischen proliferierenden und seneszenten Zellen in Bezug auf den Verbleib in einem Restkern oder die Lokalisation im DNA-Halo. Abbildung 4 zeigt dies anhand von Genloci, die durch markierte BAC-Sonden in Rot und Anti-Ki67 in Grün abgegrenzt sind. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Genorten in den proliferierenden und den seneszenten Zellen nach einer DNA-Halo-Präparation. Allerdings gibt es im DNA-Halo deutlich mehr Catenin-alpha-1-CTNNA1-Loci als Cyclin-D1-CNDD1-Loci, wo es nur sehr wenige gibt. Abbildung 5 zeigt DNA-Halo-Präparationen mit Telomeren in Grün. Der Hintergrund ist bewusst hoch belassen, damit Telomersignale innerhalb des DNA-Halos sichtbar gemacht werden können. In diesem Datensatz wurden ruhende Zellen, d.h. Zellen, die 7 Tage lang im Serum ausgehungert waren, eingeschlossen, und interessanterweise gibt es in ruhenden Zellen signifikant mehr Telomere, die nicht angeheftet sind und sich innerhalb der DNA-Halos befinden, als bei proliferierenden und seneszenten Zellen. In Abbildung 5a ist der Anteil der Telomere im DNA-Halo zu sehen, insbesondere für das Bild ‘Experiment 2’. Dies korrespondiert mit Abbildung 5b, wo der durchschnittliche Prozentsatz der Telomere im DNA-Halo in ruhenden Zellen etwa 17 % beträgt. Es gibt Hinweise darauf, dass nicht alle Telomere in seneszenten Zellen gesehen werden können, da einige von ihnen möglicherweise sehr kurz sind. Diese Methode des DNA-Halos hat sich für uns als erfolgreich erwiesen, um Veränderungen der Genominteraktion innerhalb von Zellkernen in erkrankten Zellen zu untersuchen15. Abbildung 6 zeigt Unterschiede in der Chromosomenbindung in primären Kontrollfibroblasten und in erkrankten Zellen mit typischem (Lamin-A-Mutation) und atypischem Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom, die eine andere SUN1-Isoform und keine Lamin-A-Mutation exprimieren19. Die Chromosomen 1 und 13 zeigen statistisch signifikante Unterschiede in ihrer Anheftung innerhalb der Restkerne im Vergleich zu Kontroll-DNA-Halos. Abbildung 6b korreliert die Position des gesamten Chromosomenterritoriums mit dem Restkern und dem DNA-Halo. Werte von 1 oder weniger zeigen an, dass sich das Chromosom innerhalb des Restkerns befindet, und Werte über 1 zeigen Chromosomen oder Chromosomenabschnitte innerhalb des DNA-Halos an. Insgesamt unterstreicht dies den Nutzen von HALO-FISH bei der Untersuchung genomischer Interaktionen ganzer Chromosomen, spezifischer Gene und Telomere unter einer Vielzahl von Bedingungen, die den Zellzyklus beeinflussen (Proliferation, Ruhe und Seneszenz) oder innerhalb von Krankheitszellen, z. B. Progerie- und Krebszelllinien. Tatsächlich deuten die Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen diesen Zuständen darauf hin, dass das Nukleoskelett eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Schlüsselprozessen innerhalb des Kerns spielt. Abbildung 1: HDF-extrahierter Zellkern mit dem Restkern und dem DNA-Halo sowie einem Überblick über die Analysemethode. (a) Ein HDF-Kern, der mittels DNA-Halo-Assay präpariert und mit DAPI gegengefärbt wurde. Der hell gefärbte Restkern zeigt DNA, die im Nukleoskelett verankert ist und von der nicht gebundenen DNA umgeben ist, die einen DNA-Halo bildet. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. (b) Der blaue Kanal erfasst den DAPI-gefärbten Zellkern und die umgebende DNA. Der Restkern wird mit ImageJ selektiert und entfernt. Der Pfeil zeigt den Abstand vom Kernzentrum zur verbleibenden Kernkante (NE). (c) Der rote Kanal zeigt das Sondensignal an. (d) Das mit “Ergebnis” bezeichnete Bild ist das Ergebnis der Überlagerung des roten Kanals mit dem blauen Kanalbild; dies ermöglicht die Entfernung vom Kernzentrum bis zum äußersten Chromosomenterritoriumsrand (CTE). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: DNA-Halo-Präparation mit Telomer-PNA-FISH auf proliferierenden und seneszenten HDFs. Telomer-PNA-FISCH auf HDFs, die einem DNA-Halo-Assay unterzogen wurden. Telomersignale werden grün dargestellt (FITC), Rest- und Halo-DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt und proliferierende Zellkerne wurden entweder mit Anti-BrdU- oder Anti-pKi67-Antikörpern mittels indirekter Immunfluoreszenz in Rot (TRITC) detektiert. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Nukleoskelett-Chromosomen-Interaktionen und Analyse mittels DNA-Halo-Assay. (a) 2D-FISH mit Sonden, die spezifisch für die Chromosomen 1, 13, 15, 17 und 18 sind, wurde an HDFs durchgeführt, die einer DNA-Halo-Präparation unterzogen wurden. Ganze Chromosomen wurden rot gefärbt (Cy3) und die Zellkerne wurden mit pKi67 untersucht, um festzustellen, ob sie proliferieren oder seneszent sind. Proliferierende Zellen (pKi67+) wurden grün abgegrenzt (FITC), während seneszente Zellen ungefärbt blieben (pKi67-), d.h. es konnte kein grünes Signal detektiert werden. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. (b) Chromosomenverankerung durch das Nukleoskelett in proliferierenden und seneszenten HDFs, die HALO-FISH durchlaufen hatten. Messungen zeigen das Verhältnis der am weitesten entfernten Chromosomenterritoriumskante (CTE) zur jeweiligen Kernkante (NE) für die Chromosomen 1, 13, 15, 17 und 18 in proliferierenden (pKi67+) und seneszenten (pKi67-) Zellen. Fehlerbalken stellen ± REM dar. (c) Modifizierte Boxplot-Darstellung der Chromosomenterritoriumskante (CTE) zur jeweiligen Kernkante (NE) spezifischer Chromosomen in pKi67+- und pKi67-Kernen. Q1 = unteres Quartil; Min = niedrigster aufgezeichneter Wert; Med = Median; Max = aufgezeichneter Maximalwert; Q3 = oberes Quartil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Genspezifische Interaktionen in HDFs mit HALO-FISH. (a) DNA-Halo-extrahierte Kerne wurden mit genspezifischen Sonden (CCND1 und CTNNA1) untersucht, um ihre Verankerung am NM auf proliferierenden und seneszenten Zellen zu untersuchen. Die Gensignale sind rot dargestellt (Cy3) und anti-pKi67 zeigt proliferierende Zellen und das Signal ist grün dargestellt (FITC). Für das proliferierende CCND1-Bild ist der Restkern in den weißen Kreis eingeschlossen, und der Raum zwischen dem weißen und dem grünen Kreis zeigt den DNA-Halo. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. (b) Genspezifische Signale für CCND1 und CTNNA1 werden zwischen dem Restzellkern und dem DNA-Halo sowie zwischen proliferierenden und seneszenten Zellen verglichen. Fehlerbalken stellen ± SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: DNA-Halo-Assay an ruhenden HDFs, die mit Telomer-PNA-FISH untersucht wurden. (a) Die Ruhephase der HDFs wurde durch Kultur in niedrigem Serummedium für 7 Tage induziert. Der DNA-Halo-Assay wurde durchgeführt, und PNA-FISH ermöglichte die Visualisierung der Telomere durch das FITC-Signal (grün) und der Restkern und der umgebende DNA-Halo wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Die Zellen wurden auch mit Anti-pKi67-Antikörpern gefärbt, um sicherzustellen, dass die Zellkerne nicht proliferierten. Dies wiederholte sich bei zwei verschiedenen Gelegenheiten. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. (b) Vergleich des mittleren Prozentsatzes der im DNA-Halo lokalisierten Telomere in proliferierenden, seneszenten und ruhenden HDF-Zellen. Fehlerbalken stellen ± SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Untersuchung der Verankerung des gesamten Chromosoms am Nukleoskelett in HGPS-Zellen mit HALO-FISH26. (a) Kontrollkerne von HDF (2DD), klassischem HGPS (AG06297) und atypischem Typ 2 HGPS (AG08466) wurden einer DNA-Halo-Präparation und anschließend 2D-FISH unter Verwendung von Ganzchromosomenfarben für die Chromosomen 1, 13, 15 und 17 unterzogen. Ganze Chromosomen sind grün dargestellt (FITC) und die DNA wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Vergrößerung = x 100; Maßstabsbalken 10 μm. (b) Die Positionierung der Chromosomen innerhalb der extrahierten Zellkerne wurde durch Messung des Verhältnisses des mittleren Chromosomenterritoriums (CTE) zum Kernrand (NE) bestimmt. Ein Verhältnis über 1 zeigt, dass der am weitesten entfernte CTE außerhalb des entsprechenden NE innerhalb des DNA-Halos liegt, während ein Verhältnis unter 1 bedeutet, dass der am weitesten entfernte CTE innerhalb des NE innerhalb des Restkerns liegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Bestandteile Volumen (μL) 5XDOP-PCR-Puffer 10 dNTPmix(ohnedTTP)(2mM) 5 dTTP(2mM) 2 Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP 10 DOPprimer (20μM) 5 TaqDNAPolymerase (1U/μL) 1 Wasser in PCRgrade-Qualität 12 Schablone 5 Tabelle 1: Tabelle mit den DOP-PCR-Komponenten und -Volumina für eine 1x-Reaktion Schritt Zyklen Temperatur (Grad Celsius) Zeit Anfängliche Denaturierung 1 95 3 Minuten Denaturierung 34 98 20 s Primer-Glühen 62 1 min Erweiterung 72 30 s Endgültige Verlängerung 1 72 5 Minuten Kühlung 4 Halten Tabelle 2: Tabelle mit dem DOP-PCR-Zyklus, der Temperatur und dem Zeitprofil. Bestandteil Volumen (μL) 10x NT-Puffer (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA) 5 0,1 M Beta-Mercaptoethanol 5 10-facher Nukleotidbestand (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml Biotin-16-dUTP) 5 Dnase I (1 ng/ml) 2 DNApolymerase I 5U pro μg DNA DNA-Vorlage (1 μg) 1 DEPC-behandeltes Wasser Bis 50 μL Tabelle 3: Tabelle mit den Nick-Übersetzungskomponenten und -volumina für eine einzelne Sonde.
Discussion
Die DNA-Halo-Methode ist eine ausgezeichnete Methode der Wahl bei der Analyse der Wechselwirkungen zwischen dem Nukleoskelett und dem Genom, es gibt jedoch auch einige kritische Schritte, die eingehalten werden müssen. Einer der wichtigsten Parameter ist die Optimierung der Zellkeimdichte. Wenn Zellen überkonfluieren, überlappen sich die DNA-Halos mit benachbarten Zellen, so dass die Analyse nicht durchgeführt werden kann. Der CSK und die Extraktionspuffer müssen am Tag der Anwendung immer frisch gemacht werden, wobei am Ende des Zubereitungsprozesses Spermin, Spermidin und Digitonin in den Extraktionspuffer gegeben werden, um ihre biologische Aktivität zu erhalten. Bei der Durchführung von Halo-FISH ist es äußerst wichtig, die richtige Denaturierungstemperatur der DNA-Halos zu verwenden, damit die Sonde oder Farbe anschließend hybridisieren kann.
Elektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Kernmatrix sichtbar zu machen, wobei filamentöse Strukturen identifiziert wurden20. Die Elektronenmikroskopie ist jedoch begrenzt, da Matrixassoziationen mit Chromatin nicht ohne weiteres abgeleitet werden können. Tatsächlich ist die DNA-Halo-Methode im Vergleich zur Elektronenmikroskopie vielseitiger, da bestimmte Gene, Chromosomen und Zellzustände untersucht werden können. Des Weiteren wird die proteomische Analyse von Kernmatrixproteinen untersucht21,22. Diese Methode eignet sich gut für den Vergleich von Kernmatrixkomponenten, insbesondere beim Vergleich kranker Zellen, bietet jedoch nicht die räumliche Verteilung und die Anhaftungen, die von der Standard-DNA-Halo-Technik hervorgehoben werden.
DNA-Halo-Assays haben ihre Grenzen. Erstens, da die Matrix extrahiert wird, kann dies nur an fixierten Zellen durchgeführt werden, so dass eine Live-Bildgebung nicht möglich ist. Obwohl die DNA-Halo-Methode relativ schnell und einfach durchzuführen ist, kann der Gesamtprozess zeitaufwändig sein, wenn Zellkultur, Sondengenerierung, Halo-FISH und Analyse berücksichtigt werden.
Die Bildaufnahme von DNA-Halos und HALO-FISH mittels hochauflösender Mikroskopie würde die Auflösung von DNA-spezifischen Sonden und Antikörpern erheblich verbessern. Da Fluorochrome leichter spektral aufgelöst werden können, könnte es außerdem möglich sein, eine Reihe von DNA-Sonden in einem einzigen Experiment zu verwenden, was noch mehr Informationen liefert. Verbesserungen in molekularbiologischen Techniken wie dem Chromosomen-Conformation Capture (3C) wurden verwendet, um die Wechselwirkungen von Genorten zu bestimmen und die räumliche Organisation des Chromatins in der Zelle zu analysieren. DNA-Halo-Assays und 3C können kombiniert werden, ein Begriff, der als M3C23 bekannt ist, was wiederum die Anpassungsfähigkeit der DNA-Halo-Technik demonstriert.
Die hier vorgestellten Originaldaten sollen die Möglichkeiten der Abfrage des Genomverhaltens und die Darstellung dieser Daten demonstrieren. Mit diesen Daten haben wir gezeigt, dass es möglich ist, signifikante Unterschiede in der Genombindung zu bestimmen, indem wir (1) Chromosomen-Malsonden verwenden, wobei in dieser Studie gezeigt wurde, dass Chromosom 18 das am wenigsten gebundene Chromosom der analysierten Chromosomen ist (Abbildung 3); (2) Genorte mit signifikanten Unterschieden zwischen zwei Genorten und (Abbildung 4) (3) Telomere, die in ruhenden Zellen im Vergleich zu proliferierenden und seneszenten Zellen weniger stark gebunden sind (Abbildung 5). Wir sind in der Lage, zwischen proliferierenden und nicht-proliferierenden Zellen zu unterscheiden, indem wir das Proliferationsmarker-Ki67-Antigen verwenden, das ein unlösliches Protein ist, das also in den verbleibenden Kernen verbleibt, oder indem wir den Einbau von Nukleotiden verwenden, um Zellen hervorzuheben, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums die S-Phase durchlaufen haben (Abbildung 2). Diese Technik hat es uns auch ermöglicht, das Genomverhalten in Zellen zu analysieren, die in ihren Nukleoskeletten, d.h. Laminopathiezellen, beeinträchtigt sind, und hier und in Bikkul et al., 2018 zeigen wir, dass das Genom im Vergleich zu Kontrollzellen weniger fest gebunden sein kann und wiederhergestellt werden kann, wenn mit spezifischen Medikamenten behandelt wird, die die Wirkung der Lamin-A-Mutation in klassischen HGPS-Zellen verbessern15. Wir zeigen hier jedoch neue Daten für die atypischen HGPS-AGO8466-Zellen, denen eine Lamin-A-Mutation fehlt, die aber eine ungewöhnliche Form des LINC-Komplexproteins SUN1 19 enthalten, in dem Chromosom13 weniger fest gebunden ist (Abbildung 6).
HALO-FISH ist eine einzigartige Methode, die die Untersuchung genomischer Interaktionen mit dem Nukleoskelett in Kombination mit indirekter Immunfluoreszenz ermöglicht, um Proteine aufzulösen, die nicht aus dem Extraktionsverfahren entfernt wurden. Es wurde gezeigt, dass das Nukleoskelett bei verschiedenen Erkrankungen wie bestimmten Krebsartenmodifiziert ist 19 und die Bedeutung einiger Nukleoskelett-assoziierter Proteine als diagnostische Biomarker24,25. Somit spielt diese Technik eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Wirkung des Nukleoskeletts auf die Organisation/Desorganisation des Chromatins bei der Krankheit 15,24,25,27 und ist nicht auf menschliche Zellen beschränkt, mit chromosomalen Malsonden von anderen Tieren könnte das gleiche DNA-Halo-Protokoll verwendet werden28.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Prof. Michael Bittner für die freundliche Schenkung von Chromosomenarm-Lackierungssonden. LG wurde durch das EU-finanzierte Projekt EURO-Laminopathies und den Brunel Progeria Research Fund unterstützt.
Materials
| 10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
| 5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
| Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
| Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
| Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
| Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
| Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
| Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
| Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
| DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
| Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
| Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
| Ethanol | Component of extraction buffer | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
| Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
| Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
| HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
| KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
| Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
| Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
| Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
| Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
| Nick translation kit | Invitrogen | ||
| PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
| PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
| Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
| QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
| Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
| Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
| Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
| Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
| Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
| SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
| Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
| TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
| Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
| Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |
References
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Cite This Article
Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).