Hybridation in situ par fluorescence sur des préparations de halo d’ADN pour révéler des chromosomes entiers, des télomères et des loci de gènes

1. Préparation des lames, stérilisation et culture cellulaire Préparer 500 mL de HCl à 10 % (v/v) et verser dans un grand bécher. Déposer les lames de microscope individuellement dans l’acide et incuber pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur réglé à 2 x g.ATTENTION : Le HCl est corrosif et irritant. Il peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires et une irritation de la peau, des yeux et du système respiratoire. Assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en nitrile, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. L’acide décanté du bécher et des lames de lavage dix fois dans l’eau du robinet, puis dix fois de plus dans l’eau désionisée. Rincer deux fois les lames de méthanol et les conserver jusqu’à stérilisation par flambage.MISE EN GARDE : Le méthanol est un liquide hautement inflammable et toxique en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou d’inhalation. En outre, le méthanol peut causer des dommages aux organes, est corrosif et irritant. Respectez les limites d’exposition en milieu de travail et assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc butyle, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Dans la mesure du possible, manipuler dans une hotte de ventilation par aspiration locale (LEV). À l’aide de pinces métalliques ou de longues pinces, retirez une lame de microscope du bécher contenant du méthanol. Flamme au-dessus d’un brûleur Bunsen pour stériliser et transférer dans un récipient de culture cellulaire rectangulaire contenant quatre compartiments pour lames, situé près du brûleur Bunsen.ATTENTION : Le flambage permet la stérilisation immédiate des lames de microscope avant utilisation; Cependant, cette méthode comporte des dangers. Comme le méthanol est hautement inflammable, il est important que le bécher contenant les lames soit placé loin du brûleur Bunsen. Il faut utiliser de longues pinces ou des pinces qui serrent fermement les glissières. Le niveau de méthanol dans le bécher doit simplement couvrir les lames, à la fois pour minimiser la quantité de méthanol utilisée et pour que seules les extrémités des pinces / pinces soient en contact avec le méthanol. Assurez-vous toujours que le méthanol s’est évaporé des pinces ou des pinces après utilisation et que celles-ci ont refroidi avant de le remettre dans le bécher contenant les lames et le méthanol. Le bécher doit être recouvert d’un morceau de papier d’aluminium pour affamer l’oxygène si le méthanol prend feu. Ne jamais glisser de flamme à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire de classe II où l’air circule. Vous pouvez également effectuer les étapes 1.1 à 1.4, mais plutôt que de brûler les lames après l’incubation avec du méthanol, placez les lames sur un tissu non pelucheux pour les sécher à l’air. Une fois sec, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et placez-le dans un four stérilisateur ou un autoclave. Cultiver des cellules dans le milieu approprié avec du sérum pendant au moins 48 h à 37 °C dans 5 % de CO2 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 60-70 %. Ce protocole a été réalisé sur un passage précoce de fibroblastes dermiques humains (HDF) et sur des fibroblastes classiques du syndrome de Hutchinson-Gilford progeria (HGPS) (AG06297) et des fibroblastes HGPS atypiques de type 2 (AG08466). Récoltez chaque type de cellule et comptez à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire. Ensemencer 1 x 105 cellules dans un milieu de 10 ml par lame.REMARQUE: La densité cellulaire est importante car les boucles d’ADN de différents noyaux peuvent converger si les cellules deviennent trop confluentes. Les densités d’ensemencement peuvent devoir être optimisées en fonction du type de cellule utilisé, car les cellules transformées peuvent proliférer plus rapidement, tandis que les cultures cellulaires de passage ultérieur peuvent prendre plus de temps pour atteindre la confluence souhaitée. Si les cellules doivent être arrêtées dans G0 pour devenir quiescentes, alors ensemencer 1 x 105 cellules (dans un milieu de 10 ml) par lame et laisser pousser pendant 24 h. Laver les cellules deux fois avec un milieu sans sérum et incuber dans un milieu standard contenant une concentration plus faible de sérum à 0,5% (sérum de veau nouveau-né, NCS; ou sérum bovin fœtal, FBS) pendant 7 jours. Si l’état prolifératif des cellules est requis pour le test du halo d’ADN, déterminez les cellules qui sont passées par la phase S par incorporation de 5-bromo-2′-désoxy-uridine (BrdU) dans l’ADN pendant la réplication.Cellules de graines comme d’habitude et se développent pendant 24 h. Retirer le milieu de culture et le remplacer par un milieu contenant du BrdU et de la 5-fluoro-2′-désoxyuridine (3 μg/μL). Après 24 heures supplémentaires, retirez le milieu, lavez les cellules une fois avec du milieu (10% NCS), puis réalimentez-les avec du milieu frais (10% NCS). Incuber pendant 24 heures supplémentaires, puis préparer les lames pour le test du halo d’ADN. 2. Préparation de la sonde Sondes de peinture chromosomique entière et brasFabriquer des sondes chromosomiques à partir de l’amplification de chromosomes triés ou microdisséqués par réaction en chaîne par polymérase amorcée par oligonucléotide dégénéré (DOP-PCR) en utilisant la méthode de Telenius et al.16. Utilisez la DOP-PCR pour marquer les sondes chromosomiques avec de la biotine-16-dUTP ou de la digoxigénine-11-dUTP, comme indiqué dans le tableau 1. Veuillez vérifier les instructions du fabricant pour le profil d’amplification, cependant, les conditions utilisées pour cette expérience sont indiquées dans le tableau 2. Préparer le bras ou la sonde chromosomique entière en additionnant 8 μL de produit PCR marqué, 7 μL d’ADN Cot-1, 3 μL de sperme de hareng, 1/20evolume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,4) et 2 volumes d’éthanol à 100 %. Incuber la solution de sonde pendant au moins 30 min à -80 °C.REMARQUE: Cette méthode peut être utilisée pour créer des sondes chromosomiques uniques ou plusieurs sondes chromosomiques si différentes étiquettes (c.-à-d. Biotine-16-UTP et Digoxigénine-11-dUTP) sont utilisées pour chaque chromosome d’intérêt.ATTENTION : L’éthanol est un liquide et une vapeur hautement inflammables et peut causer une irritation oculaire grave. Tenir à l’écart de la chaleur, des surfaces chaudes et des sources d’inflammation. Respectez les limites d’exposition en milieu de travail et assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc butyle, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Dans la mesure du possible, manipuler dans une hotte LEV. Solution de sonde centrifugeuse à 13 700 x g pendant 15 min à 4 °C, puis laver à l’éthanol à 70%. Répétez la procédure de centrifugation et jetez le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber ou perdre la pastille d’ADN. Laissez sécher la pastille d’ADN. Ajouter 12 μL de tampon d’hybridation (50 % de formamide, 10 % de sulfate de dextrane, 10 % de citrate de sodium salin 20x (SSC; NaCl 3 M, citrate trisodique 0,3 M; pH 7,0), 1 % (v/v) de monolaurate de polyoxyéthylène sorbinal (Tween-20)) à la pastille d’ADN. Laisser à 37 °C pendant au moins 2 h pour que la pastille d’ADN se dissolve dans le tampon d’hybridation.MISE EN GARDE : Le formamide est cancérogène et tératogène et peut donc causer de graves dommages à l’enfant à naître. Si une femme est enceinte ou soupçonne qu’elle est enceinte, elle devrait éviter de travailler avec du formamide. Le formamide doit être utilisé dans une hotte LEV. Respectez les limites d’exposition en milieu de travail et assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc butyle, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Isolement de l’ADN à partir de chromosomes artificiels bactériens (BAC)Étaler une petite partie du stock de glycérol du clone BAC sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) (1% (P / V) NaCl; 1% (p / v) tryptone, 0,5% (p / v) extrait de levure, 1,5% (p / v) Agar Technical, 12,5 μg / mL (p / v) chloramphénicol). Incuber pendant une nuit à 37 °C. Choisir une seule colonie dans la plaque et inoculer 10 mL de bouillon LB (NaCl à 1 % (p/v), 1 % (p/v) bactotryptone, extrait de levure à 0,5 % (p/v), 12,5 μg/mL (p/v) de chloramphénicol). Laisser la solution dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 37 °C.ATTENTION : Le chloramphénicol est soupçonné de causer le cancer. Manipuler avec précaution et réduire l’exposition. Culture par centrifugation à 1 700 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et ajouter 300 μL de solution P1 (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/mL RNase A) à la pastille. Vortex vigoureusement et transférer les cellules dans un tube microcentrifuge de 2 mL. Ajouter 300 μL de solution de P2 (0,2 M NaOH, 1 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) goutte à goutte aux cellules. Retourner le tube de microcentrifugation fermé 5 fois et laisser à température ambiante pendant 5 min maximum.ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est corrosif et peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Il peut être corrosif pour les métaux. Manipuler avec précaution et réduire l’exposition. Respectez les limites d’exposition en milieu de travail et assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc nitrile, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Dans la mesure du possible, manipuler dans une hotte LEV.ATTENTION : Le dodécylsulfate de sodium est un solide inflammable, nocif en cas d’ingestion et pouvant causer une irritation cutanée et respiratoire. Il peut également causer de graves lésions oculaires. Assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc nitrile, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Dans la mesure du possible, manipuler dans une hotte LEV. Ajouter 300 μL de P3 (acétate de potassium 3 M) lentement aux cellules et mélanger doucement. Placer le tube de microcentrifugeuse sur de la glace pendant 10 min. Centrifuger à 8 100 x g pendant 10 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un tube contenant 800 μL d’isopropanol glacé. Retourner le tube plusieurs fois et incuber à -20 °C pendant une nuit.ATTENTION: L’isopropanol est un liquide et une vapeur hautement inflammables et peut causer une irritation oculaire grave, de la somnolence ou des étourdissements. Tenir à l’écart de la chaleur, des surfaces chaudes et des sources d’inflammation. Respectez les limites d’exposition en milieu de travail et assurez-vous que la protection individuelle appropriée est portée, y compris des gants en caoutchouc nitrile, une protection oculaire et une blouse de laboratoire. Dans la mesure du possible, manipuler dans une armoire à fumée LEV. Centrifuger à 8 100 x g pendant 15 min à 4 °C. Retirer le surnageant et transférer dans un autre tube. Ajouter 500 μL d’éthanol glacé à 70 %. Inverser le tube plusieurs fois et centrifuger à 8 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et sécher à l’air libre le granulé à température ambiante. Une fois la pastille sèche, remettez en suspension dans 40 μL d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (traitée DEPC) et laissez reposer à 4 °C pendant la nuit. Une fois complètement remis en suspension, prélever 5 μL de solution et charger sur un gel d’agarose à 1% pour vérifier la présence d’ADN. Préparation par sonde monogénique des BAC par traduction de nickUtilisez des kits d’étiquetage de traduction de pseudo disponibles dans le commerce. Vous pouvez également utiliser le protocole suivant. Voir le tableau 3 pour les constituants et les volumes. Ajouter les constituants du tableau 3 ensemble dans un tube microcentrifuge en ajoutant l’ADN polymérase I en dernier, mélanger doucement et centrifuger brièvement pendant quelques secondes. Incuber la solution à 15 °C pendant 2 h. Pour vérifier la taille des fragments, chargez 5 μL de la solution sur un gel d’agarose à 2%. La plage de taille des fragments d’ADN doit être comprise entre 200 et 600 pb. Si la taille des fragments d’ADN est plus grande, continuez à incuber la solution pendant 15 minutes supplémentaires à 15 °C et faites couler les produits sur du gel d’agarose à 2%. Arrêtez la réaction de traduction en ajoutant 10 mM d’EDTA, 0,1% de SDS (2,5 μL de 0,5 M EDTA, pH 8,0 dans 100 μL et 1 μL de 10% SDS dans 100 μL). Chauffer la solution à 65 °C pendant 5 min. Pour éliminer les nucléotides non incorporés, appliquez une sonde BAC sur une colonne de spin. Les colonnes de spin commerciales peuvent être achetées, ou elles peuvent être créées à l’aide d’une seringue comme suit: Ajouter 30 g de Sephadex G-50 à 500 mL de tampon colonne (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Autoclaver le mélange. Préparez également 500 ml de tampon colonne (sans Sephadex G-50) et d’autoclave. Faites tourner les colonnes en ajoutant de la laine de verre autoclavée au fond d’une seringue de 1 mL. Remplissez la seringue de 1 ml avec Sephadex G-50 dans un tampon colonne. Placer une seringue de 1 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL muni d’un tube microcentrifuge sans couvercle au fond. Centrifuger à 1 600 x g pendant 5 min. Retirer la seringue et jeter le tube de microcentrifugation au fond. Ajoutez un nouveau tube de microcentrifugation dans le tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter le tampon colonne (sans Sephadex G-50) à la seringue de 1 mL et réinsérer dans le tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 1 600 x g pendant 5 min. Répétez cette étape deux fois. Retirer la seringue et l’insérer dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant un nouveau tube microcentrifuge propre. Appliquer la sonde sur la seringue et recueillir la sonde dans le tube de microcentrifugeuse. Pour précipiter la sonde à ADN, ajoutez 5 μL d’ADN de spermatozoïdes de hareng (10 mg/mL), 10 μL d’acétate de sodium et 2,25 volumes d’éthanol à 100 % à la solution d’ADN. Mélanger délicatement la solution et incuber à -80 °C pendant 1 h minimum. Centrifuger à 13 700 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le surnageant et laver la pastille avec 200 μL d’éthanol à 70 % glacé pendant 15 minutes à 4 °C. Retirer le surnageant et sécher à l’air. Une fois sec, remettre en suspension les granulés dans 20 μL d’eau traitée DEPC à température ambiante pendant plusieurs heures ou toute la nuit à 4 °C. La sonde est maintenant prête à être utilisée ou peut être stockée à -20 °C. Pour chaque lame, mélanger 5 μL d’ADN de sonde avec 5 μL d’ADN Cot-1 et sécher à l’aide d’un concentrateur sous vide Speed Vac. Une fois la pastille séchée, re-suspendre dans 12 μL de mélange d’hybridation. 3. Préparation du halo d’ADN Retirez la boîte de culture carrée contenant les lames et les cellules attachées de l’incubateur. Jeter le milieu, étiqueter les lames à l’aide d’un crayon et les placer dans un pot Coplin contenant 50 mL de tampon de cytosquelette glacé (CSK) : 100 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2, 0,3 M de saccharose, 10 mM d’acide 1 ,4-pipérazine dipéthanesulfonique (PIPES; pH 7,8), 0,5 % (v/v) de Triton X-100 composé dans de l’eau désionisée. Incuber pendant 15 min sur glace ou à 4 °C.ATTENTION : Le Triton X-100 peut provoquer une irritation de la peau et de graves lésions oculaires. Manipuler à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire. Jeter le tampon CSK et rincer rapidement les lames dans 50 mL de 1x tampon de halo d’ADN (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) trois fois, c’est-à-dire tremper la glissière dans un pot Coplin contenant DHB et retirer. Transvaser les lames dans un pot Coplin contenant 50 mL de tampon d’extraction : 2 M de NaCl, 10 mM de TUYAUX (pH 6,8), 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,1 % (p/v) de digitonine, 0,05 mM (v/v) de spermine, 0,125 mM (v/v) de spermidine. Incuber pendant 4 min à température ambiante.ATTENTION : La digitonine est toxique en cas d’ingestion ou de contact cutané et mortelle en cas d’inhalation. Assurez-vous que la digitonine est manipulée dans une armoire à fumée LEV et portez une blouse de laboratoire, des gants en nitrile (double gant), des lunettes de sécurité et un masque. La spermine et la spermidine peuvent causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires, tandis que l’EDTA provoque une irritation oculaire grave, alors manipulez chaque produit chimique avec soin.NOTE: Préparer la digitonine séparément en dissolvant la poudre dans de l’eau à une température de 60-70 °C. Ajouter la digitonine dissoute au tampon d’extraction une fois refroidi. Ajouter la spermine, la spermidine et la digitonine en dernier au tampon d’extraction pour préserver l’activité biologique. Incuber des lames consécutivement dans 50 mL de 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x et 1x DHB pendant 1 min chacun. Trempez les glissements (droit et droit) à travers une série séquentielle d’éthanol de 50 ml d’éthanol à 10 %, 30 %, 70 % et 95 % (v/v). Sécher à l’air libre les lames et stocker à -80 °C jusqu’à ce qu’une hybridation in situ par fluorescence bidimensionnelle (2D FISH) soit effectuée. 4. Hybridation in situ par fluorescence bidimensionnelle Faire 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M citrate trisodique, pH 7,0. Ce tampon peut être autoclavé, stocké à température ambiante et dilué au besoin. Faire 70 % (v/v) de formamide, 2x SSC pH 7,0 et chauffer à 70 °C dans un bain-marie. Incuber les lames, pendant 5 minutes chacune, à travers une série séquentielle d’éthanol de 50 ml d’éthanol à 70, 90 et 100 %. Sécher à l’air libre sur une plaque chauffante et cuire au four à 70 °C pendant 5 min. Dénaturer les lames en plaçant dans la solution de formamide à 70 % de 2x SSC pendant 2 min à 70 °C.REMARQUE: La température et le moment sont critiques pour l’étape 4.5. Si la température est l’ADN ne se dénaturera pas et les sondes ne s’hybrideront pas, et aucun signal ne sera obtenu à partir du halo d’ADN FISH. Placer la lame dénaturée dans 50 mL d’éthanol glacé à 70 % pendant 5 minutes et prendre à travers une série d’éthanol de 90 %, 95 % et 100 % à température ambiante pendant 5 minutes chacune. Sécher à l’air libre sur une plaque chauffante Manipulez directement les sondes chromosomiques humaines totales étiquetées conformément aux instructions du fabricant. Pour ces expériences, nous avons utilisé les peintures chromosomiques entières humaines 1, 13, 15, 17 et 18. De plus, dans cette expérience, des sondes de gènes CCND1 et CTNNA1 ont été utilisées.REMARQUE: Les sondes chromosomiques entières et les sondes spécifiques au gène BAC ont été marquées avec de la biotine-11-dUTP et détectées par la streptavidine conjuguée à la cyanine 3 (Cy3). Pour les sondes de peinture chromosomique fabriquées par (DOP-PCR) et l’ADN BAC marqués par traduction de nick, ceux-ci seront appelés sondes ADN à partir de ce moment dans le protocole et traités comme suit. Sonde ADN dénaturée (peinture chromosomique entière ou sonde spécifique au gène) à 75 °C pendant 10 min dans un bloc chaud ou un bain-marie. Sondes d’ADN chaudes à 37 °C pendant 30 minutes dans un bloc chaud ou un bain-marie avant de pipeter 10 μL sur la lame appropriée.REMARQUE: Cette étape est importante pour bloquer les séquences chromosomiques répétitives. S’ils ne sont pas effectués, des signaux non spécifiques peuvent être produits dans le DNA Halo FISH. Sonde de recouvrement avec glissement de couverture de 21 mm x 21 mm et joint à l’aide de ciment en caoutchouc. Incuber les lames pendant au moins 18 h à 37 °C dans une chambre d’hybridation humidifiée.REMARQUE : Les chambres d’hybridation humidifiées peuvent être fabriquées à partir de boîtes sandwich contenant plusieurs couches de tissu humidifié et d’une plate-forme surélevée construite à partir de pipettes en plastique coupées de 10 ml sur lesquelles reposer les lames. Ceci est recouvert de papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière. Retirez soigneusement le ciment en caoutchouc à l’aide d’une pince. Incuber les lames dans 50 ml de formamide à 50 % (v/v), 2x SSC, solution de pH 7,0 qui a été préchauffée à 45 °C pendant trois incubations de 5 minutes.REMARQUE: Laisser tomber la lamelle de couverture de la lame lors de la première incubation dans 50% (v/v) formamide, 2x SSC, solution de pH 7,0. Cela évite d’endommager la préparation DNA Halo qui pourrait être causé par le fait de « glisser » la lamelle de couverture. Les glissières peuvent être agitées dans le tampon via une pince pour aider à détacher le couvercle. Ensuite, placez les lames dans 50 ml de solution 0,1x SSC, pH 7,0 qui a été préchauffée à 60 °C mais placée dans un bain-marie à 45 °C. Incuber pendant 5 min et remplacer le tampon deux fois de plus par 5 min d’incubation. Placer les lames dans un pot Coplin contenant 50 ml de 4x SSC, solution de pH 7,0 à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon. Appliquer 100 μL de BSA à 4 %, 4x solution SSC sur chaque lame et superposer avec un morceau de film de paraffine. Incuber à température ambiante pendant 10 min. Cela empêche la liaison non spécifique de l’anticorps. Pour détecter la sonde marquée (biotine-16-dUTP), incuber avec 100 μL d’un streptavidine-Cy3 1:200 (fabriqué dans 1% BSA, 4x SSC) pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE : Suivre les instructions du fabricant avec les dilutions d’anticorps et la dilution d’essai avant l’expérience pour s’assurer qu’un bon signal est produit. Placer les lames dans un pot Coplin contenant 50 ml de 4x SSC (0,5% Tween-20) solution pH 7,0 à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon. Les lames peuvent être montées à ce stade, comme indiqué à l’étape 4.21, si l’immunofluorescence n’est pas nécessaire. Si l’état prolifératif des cellules transformées en halos d’ADN est requis, colorer avec des anticorps anti-pKi67 après les étapes FISH, avant le montage ou la coloration pour BrdU incorporé.Laver les lames 3 fois pendant 5 minutes chacune dans 50 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis bloquer avec 4% de NCS dans PBS pendant 1 h à température ambiante. Appliquer 200 μL de l’anticorps primaire nécessaire (lapin anti-humain pKi67; souris anti-BrdU) sur la lame, recouvrir d’une bande de film de paraffine et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver les lames 3 fois pendant 5 min dans 1x PBS et incuber à température ambiante pendant 1 h dans 200 μL d’anticorps secondaire conjugué au fluorochrome (pKi67 : TRITC anti-lapin porcin ; BrdU : âne anti-souris Cy3). Effectuez 3 lavages supplémentaires de 5 minutes avec PBS. Toutes les dilutions doivent être effectuées en utilisant 1 % (v/v) de NCS dans du PBS dans la gamme de dilutions suggérées par le fabricant. Montez des glissières dans 20 μL de support contenant DAPI et une superposition avec une glissière de couverture de 22 mm x 50 mm. 5. Télomère PNA POISSON Pour détecter les télomères, utilisez le kit télomère PNA FISH – FITC; Effectuez la procédure avec les instructions du fabricant. La procédure doit être exécutée à température ambiante, sauf indication contraire. Immerger les lames dans une solution saline tamponnée au tris (TBS, pH 7,5) pendant 2 min, puis placer dans du formaldéhyde à 3,7% (dans TBS; v / v) pendant exactement 2 min.ATTENTION : La solution TBS contient 10-30% de trométamol et 10-30% de chlorhydrate de 2-amino-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol. Cela peut causer une grave irritation des yeux et de la peau, alors portez des gants de protection et des lunettes de protection / protection du visage. Utiliser dans un endroit bien ventilé. Lavez les lames dans un pot Coplin deux fois avec TBS pendant 5 minutes chacune. Immerger les lames dans la solution de prétraitement pendant 10 minutes, puis laver deux fois avec TBS pendant 5 minutes par lavage. Ensuite, prenez les lames à travers une série d’éthanol glacé comprenant 50 ml d’éthanol à 70%, 85% et 95% (v/v) pendant 2 minutes par concentration. Ensuite, laissez les toboggans sécher à l’air. Appliquer 10 μL de Telomere PNA Probe/FITC (ou Cy3) selon le choix de la coloration du marqueur fluorescent, sur chaque lame et couvrir la couche avec une lame. Incuber dans un four préchauffé réglé à 80 °C pendant 5 min, puis placer à l’obscurité pendant environ 1 h.ATTENTION : Telomere PNA Probe/FITC contient 6-100% de formamide, qui provoque une irritation oculaire grave et est tératogène et peut donc causer de graves dommages à un enfant à naître. Si une femme est enceinte ou soupçonne qu’elle est enceinte, elle devrait éviter de travailler avec du formamide. Le formamide doit être utilisé dans une hotte anti-fumée LEV et une protection appropriée des yeux ou du visage doit être portée. Pour retirer les lames de couverture, immerger les lames dans la « Solution de rinçage » pendant 1 min, puis placer dans la « Solution de lavage » pendant 5 min à 65 °C.ATTENTION : La solution de lavage contient 1 à 5 % de polyoxyéthylène octyl phényléther et 1 à 5 % de chlorure de sodium. Ceci est corrosif et peut causer de graves lésions oculaires. Assurez-vous que des lunettes de protection ou un protecteur facial sont portés lors de la manipulation de la solution de lavage. Incuber des lames à travers une série de 50 ml d’éthanol glacé (70 %, 85 % et 95 % (v/v)) pendant 2 minutes par concentration, puis sécher à l’air. Une fois sec, glissière de montage avec support contenant DAPI et superposition avec un couvercle. 6. Capture et analyse d’images Pour visualiser les halos d’ADN et les territoires chromosomiques, utilisez un microscope à épifluorescence (par exemple, le microscope Leica DM4000) pour capturer des images à l’aide d’un objectif d’huile HC PL FLUOTAR 100X / 1.30 et d’une caméra DFC365FX. Capturez des images en niveaux de gris et définissez la couleur de chaque couche capturée pour activer la pseudocoloration des images. Un logiciel commercial a été utilisé dans cette expérience (p. ex., le logiciel LAS AF version 4.5.0). Les canaux de couleur individuels ont été exportés au format TIFF. Analysez des images à l’aide du programme de traitement d’images Java Fiji ImageJ. Téléchargez l’image en appuyant sur Fichier et ouvrir. Chargez des couches d’image distinctes ou divisez une image composite en couches de niveaux de gris distinctes en cliquant sur Image | Couleur | Fractionner les canaux. Sélectionnez un canal d’image et cliquez sur Image | Ajustez , puis sélectionnez Luminosité et contraste. Modifiez en conséquence et répétez avec d’autres canaux. Créez un masque du noyau résiduel en sélectionnant le canal coloré DAPI représentant le noyau. Cliquez sur Image | Ajustez , puis sélectionnez Seuil. Une boîte de dialogue apparaîtra où le seuil peut être modifié, cochez la case Arrière-plan sombre . Modifiez jusqu’à ce que le noyau résiduel soit clair et appuyez sur Appliquer et fermez la boîte de dialogue.REMARQUE: Cela crée un masque binaire basé sur l’intensité des pixels, avec des pixels blancs montrant les régions d’intérêt et des pixels noirs montrant l’arrière-plan. Répétez la même procédure sur le canal de sonde. Utilisez la sélection à main levée pour délimiter la périphérie du noyau résiduel, puis cliquez sur Modifier et effacer l’extérieur. Superposez le canal de la sonde sur le noyau résiduel. Cela peut être fait en appuyant sur Image| Couleur | Fusionner les canaux. Pour définir l’échelle de mesure dans ImageJ, tracez une ligne sur la barre d’échelle ou entre les points de deux distances connues. Accédez à Analyser et appuyez sur Définir l’échelle. Dans la boîte de dialogue, ajoutez la longueur de distance et cliquez sur OK. Pour mesurer les distances, tracez une ligne entre les points mesurés et cliquez sur Analyser | Mesurer. Cela transférera les valeurs de distance vers une fenêtre de données. Mesurez l’intensité DAPI la plus brillante car elle coïncide avec le centre du noyau. À partir de là, mesurez la distance entre le centre nucléaire et le bord du territoire chromosomique (CTE) le plus éloigné. Mesurer la distance entre le centre nucléaire et le bord nucléaire (NE). S’assurer que les résultats sont présentés sous la forme d’un rapport CTE/EN. Ici, la distance entre le centre nucléaire et chaque bord du territoire chromosomique le plus éloigné (CTE) est divisée par la distance entre le centre nucléaire et chaque bord nucléaire respectif (NE). Cela devrait être effectué sur un minimum de 50 noyaux. Cela peut être représenté sous la forme d’un graphique à barres ou en boîte. Pour l’analyse des télomères, analysez un minimum de 30 noyaux par ensemble de données. Les images peuvent être analysées à l’aide de Fiji ImageJ ou manuellement pour compter le nombre de télomères dans le noyau résiduel et dans le halo d’ADN. BrdU ou pKi67 a permis de différencier les noyaux proliférants (BrdU/piK67+) et sénescents/quiescents (BrdU/pKi67-). Les données peuvent être représentées dans des diagrammes à barres avec des barres d’erreur correspondant à l’erreur type de la moyenne (MEB). Utilisez le test t de Student (non apparié) pour comparer statistiquement les résultats avec p> 0,05 considéré comme significatif.