הכלאה פלואורסצנטית באתרה על תכשירי הילה של DNA לחשיפת כרומוזומים שלמים, טלומרים ומיקומי גנים

1. הכנת שקופיות, עיקור ותרבית תאים מכינים 500 מ”ל של 10% HCl (v/v) ויוצקים לתוך גדולה. יש להחליק את המיקרוסקופ בנפרד לתוך החומצה ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר שנקבע על 2 x גרם.אזהרה: HCl הוא חומר מאכל ומגרה. הוא עלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים ולגירוי של העור, העיניים ומערכת הנשימה. יש להקפיד על לבישת הגנה אישית מתאימה הכוללת כפפות ניטריל, מגן עיניים ומעיל מעבדה. מרוקנים חומצה מהכוס ומחליקים עשר פעמים במי ברז ואז עשר פעמים נוספות במים נטולי יונים. יש לשטוף את המגלשות במתנול פעמיים ולשמור במתנול עד לעיקור על ידי שריפה.אזהרה: מתנול הוא נוזל דליק מאוד ורעיל בבליעה, במגע עם העור או בשאיפה. בנוסף, מתנול עלול לגרום נזק לאיברים, הוא קורוזיבי ומגרה. יש להקפיד על מגבלות החשיפה במקום העבודה ולוודא כי נלבשת הגנה אישית מתאימה, כולל כפפות גומי בוטיל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. במידת האפשר, יש לטפל בארון אדים של אוורור פליטה מקומי (LEV). בעזרת מלקחיים מתכתיים או מלקחיים ארוכים, הסירו מהכוס מגלשת מיקרוסקופ המכילה מתנול. מבעירים מעל מבער בונזן לעיקור, ומעבירים לכלי תרבית תאים מלבני המכיל ארבעה תאים למגלשות, הממוקם בסמוך למבער הבונזן.זהירות: בעירה מאפשרת עיקור מיידי של שקופיות מיקרוסקופ לפני השימוש; עם זאת, לשיטה זו יש סיכונים נלווים. מכיוון שמתנול דליק מאוד, חשוב שהכוס המכילה את המגלשות תמוקם הרחק ממבער הבונזן. יש להשתמש במלקחיים ארוכים או במלקחיים האוחזים בחוזקה במגלשות. רמת המתנול בכד צריכה פשוט לכסות את המגלשות, הן כדי למזער את כמות המתנול בשימוש והן כך שרק קצות המלקחיים/מלקחיים יהיו במגע עם המתנול. יש לוודא תמיד שהמתנול התאדה מהמלקחיים או המלקחיים לאחר השימוש ושאלו התקררו לפני הכנסתם חזרה לכד המכיל את המגלשות והמתנול. הכד צריך להיות מכוסה על ידי חתיכת נייר אלומיניום כדי להרעיב את החמצן אם מתנול עולה באש. לעולם אין להבה מחליקה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי Class II שבו האוויר מוזרם. לחלופין, בצעו את שלבים 1.1 עד 1.4, אך במקום להבעיר את המגלשות לאחר הדגירה עם מתנול, הניחו את המגלשות על רקמה נטולת סיבים לייבוש באוויר. לאחר הייבוש, עוטפים ברדיד אלומיניום ומניחים בתנור סטריליזטור או אוטוקלאב. לגדל תאים בתווך המתאים עם סרום לפחות 48 שעות ב 37 ° C ב 5% CO2 עד 60-70% מפגש הוא הגיע. פרוטוקול זה בוצע על מעבר מוקדם של פיברובלסטים עוריים אנושיים (HDFs) ועל פיברובלסטים קלאסיים של תסמונת האצ’ינסון-גילפורד פרוגריה (HGPS) (AG06297) ופיברובלסטים לא טיפוסיים מסוג 2 HGPS (AG08466). קצור כל סוג תא וספירה באמצעות המוציטומטר כדי לקבוע את צפיפות התא. זרע 1 x 105 תאים ב 10 מ”ל בינוני לכל שקופית.הערה: צפיפות התא חשובה מכיוון שלולאות דנ”א מגרעינים שונים עשויות להתכנס אם התאים הופכים לנפגשים מדי. ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות הזריעה בהתאם לסוג התא המשמש תאים מותמרים עשויים להתרבות מהר יותר, בעוד תרביות תאים במעבר מאוחר יותר עשויות להימשך זמן רב יותר כדי להגיע למפגש הרצוי. אם תאים צריכים להיעצר ב G0 כדי להיות שקט, ואז זרע 1 x 105 תאים (ב 10 מ”ל בינוני) לכל שקופית ולהשאיר לגדול במשך 24 שעות. יש לשטוף תאים פעמיים עם מדיום ללא סרום ולדגור בתווך סטנדרטי המכיל ריכוז נמוך יותר של סרום ב -0.5% (סרום עגל יילוד, NCS; או סרום בקר עוברי, FBS) במשך 7 ימים. אם מצב ההתרבות של התאים נדרש עבור בדיקת הילה של DNA, אז לקבוע תאים שעברו שלב S על ידי שילוב של 5-bromo-2′-deoxy-uridine (BrdU) לתוך ה- DNA במהלך השכפול.זרעו תאים כרגיל וגדלו במשך 24 שעות. הסר את מדיום התרבית והחלף במדיום המכיל BrdU ו- 5-fluoro-2′-deoxyuridine (3 מיקרוגרם / μL). לאחר 24 שעות נוספות, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים פעם אחת עם בינוני (10% NCS) ולאחר מכן להאכיל מחדש עם מדיום טרי (10% NCS). דגרו במשך 24 שעות נוספות ולאחר מכן הכינו את השקופיות לבדיקת הילת הדנ”א. 2. הכנת בדיקה גשושיות כרימוזום שלמות וצביעות זרועצור בדיקות כרומוזומים מהגברה של כרומוזומים ממוינים או מיקרו-חתוכים על ידי תגובת שרשרת פולימראז מנוונת של אוליגונוקלאוטיד (DOP-PCR) באמצעות השיטה של Telenius et al.16. השתמש ב- DOP-PCR כדי לתייג בדיקות כרומוזומים עם Biotin-16-dUTP או Digoxigenin-11-dUTP כפי שמוצג בטבלה 1. אנא בדוק את הוראות היצרן עבור פרופיל הגברה, עם זאת, התנאים המשמשים לניסוי זה מוצגים בטבלה 2. הכן בדיקת זרוע או כרומוזום שלם על ידי הוספת 8 μL של מוצר PCR מסומן, 7 μL של Cot-1 DNA, 3 μL של זרע הרינג, 1/20נפח של 3 M נתרן אצטט (pH 5.4) ו 2 כרכים של 100% אתנול. לדגור על פתרון הבדיקה במשך מינימום של 30 דקות ב -80 ° C.הערה: שיטה זו יכולה לשמש ליצירת בדיקות כרומוזום יחיד, או בדיקות כרומוזומים מרובות אם תוויות שונות (כלומר, Biotin-16-UTP ו- Digoxigenin-11-dUTP) משמשות עבור כל כרומוזום מעניין.אזהרה: אתנול הוא נוזל ואדים דליקים מאוד ועלול לגרום לגירוי חמור בעיניים. יש להרחיק מחום, משטחים חמים ומקורות הצתה. יש להקפיד על מגבלות החשיפה במקום העבודה ולוודא כי נלבשת הגנה אישית מתאימה, כולל כפפות גומי בוטיל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. במידת האפשר ידית בארון אדים LEV. תמיסת בדיקה צנטריפוגה ב 13,700 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. חזור על הליך הצנטריפוגה והשלך את הסופרנטנט, תוך הקפדה שלא להפריע או לאבד את גלולת ה- DNA. הניחו לגלולת הדנ”א להתייבש. הוסף 12 μL של חיץ הכלאה (50% פורממיד, 10% דקסטרן סולפט, 10% 20x מלוחים נתרן ציטראט (SSC; 3 M NaCl, 0.3 M tri-sodium ציטראט; pH 7.0), 1% (v/v) פוליאוקסאתילן סורבינל מונולאורט (Tween-20)) לגלולת ה- DNA. השאירו בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לפחות עד שגלולת הדנ”א תתמוסס לתוך מאגר ההכלאה.אזהרה: פורממיד הוא חומר מסרטן וטרטוגני ולכן עלול לגרום נזק חמור לילד שטרם נולד. אם אישה בהריון או חושדת שהיא בהריון עליהם להימנע מעבודה עם פורממיד. יש להשתמש בפורמיד במנדף LEV. יש להקפיד על מגבלות החשיפה במקום העבודה ולוודא כי נלבשת הגנה אישית מתאימה, כולל כפפות גומי בוטיל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. בידוד DNA מכרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BACs)פזרו חלק קטן ממלאי הגליצרול משיבוט BAC על צלחת אגר Luria-Bertani (LB) (1% (W/V) NaCl; 1% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) תמצית שמרים, 1.5% (w/v) אגר טכני, 12.5 מיקרוגרם/מ”ל (w/v) כלוראמפניקול). לדגור לילה ב 37 °C (77 °F). בחר מושבה אחת מהצלחת וחסן 10 מ”ל של ציר LB (1% (w/v) NaCl, 1% (w/v) bactotryptone, 0.5% (w/v) תמצית שמרים, 12.5 מיקרוגרם / מ”ל (w/v) chloramphenicol). השאירו את התמיסה באינקובטור רועד למשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.זהירות: כלוראמפניקול חשוד בגרימת סרטן. טפל בזהירות וצמצם את החשיפה. תרבית צנטריפוגות במהירות 1,700 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך סופרנאטנט ולהוסיף 300 μL של תמיסת P1 (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/mL RNase A) לכדור. מערבולת במרץ ולהעביר תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ”ל. הוסף 300 μL של תמיסת P2 (0.2 M NaOH, 1% (w/v) נתרן דודציל סולפט (SDS) טיפה לתאים. הפכו את צינור המיקרוצנטריפוגה הסגור 5 פעמים והשאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לכל היותר.אזהרה: נתרן הידרוקסידי הוא חומר מאכל ועלול לגרום לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. זה עשוי להיות קורוזיבי למתכות. טפל בזהירות וצמצם את החשיפה. יש להקפיד על מגבלות החשיפה במקום העבודה ולוודא כי נלבשת הגנה אישית מתאימה, כולל כפפות גומי ניטריל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. במידת האפשר ידית בארון אדים LEV.אזהרה: סודיום דודציל סולפט הוא מוצק דליק, מזיק בבליעה ועלול לגרום לגירוי בעור ובדרכי הנשימה. זה עלול גם לגרום נזק חמור לעיניים. יש להקפיד על לבישת הגנה אישית מתאימה הכוללת כפפות גומי ניטריל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. במידת האפשר ידית בארון אדים LEV. הוסיפו 300 מיקרוליטר של P3 (3 M אשלגן אצטט) לאט לתאים וערבבו בעדינות. מניחים את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 8,100 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור המכיל 800 μL של איזופרופנול קר כקרח. הפוך את הצינור מספר פעמים ודגר ב -20 ° C במשך הלילה.אזהרה: איזופרופנול הוא נוזל ואדים דליקים מאוד ועלול לגרום לגירוי חמור בעיניים, נמנום או סחרחורת. יש להרחיק מחום, משטחים חמים ומקורות הצתה. הקפידו על מגבלות החשיפה במקום העבודה והקפידו על לבישת הגנה אישית מתאימה, כולל כפפות גומי ניטריל, הגנה על העיניים ומעיל מעבדה. במידת האפשר ידית בארון נדף LEV). צנטריפוגה ב 8,100 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנאטנט ומעבירים לצינור אחר. הוסף 500 μL של אתנול קר כקרח 70%. הפוך צינור מספר פעמים וצנטריפוגה ב 8,100 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנאטנט ומייבשים את הגלולה באוויר בטמפרטורת החדר. לאחר שהגלולה יבשה, יש להשהות מחדש ב-40 מיקרוליטר מים המטופלים בדיאתיל פירוקרבונט (מטופלים ב-DEPC) ולהשאיר בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. לאחר השעיה מלאה להסיר 5 μL של פתרון ולטעון על ג’ל agarose 1% כדי לבדוק נוכחות של DNA. הכנת בדיקה של גן יחיד של BACs באמצעות תרגום ניקהשתמשו בערכות תיוג לתרגום ניקים הזמינות באופן מסחרי. לחלופין, השתמש בפרוטוקול הבא. ראו טבלה 3 למרכיבים וכרכים. מוסיפים את המרכיבים מטבלה 3 יחד בצינור מיקרוצנטריפוגה ומוסיפים את הדנ”א פולימראז שאני מחזיק מעמד, מערבבים בעדינות וצנטריפוגה לזמן קצר למשך מספר שניות. לדגור את התמיסה ב 15 ° C במשך 2 שעות. כדי לוודא את גודל השברים, יש להעמיס 5 μL של התמיסה על ג’ל אגרוז 2%. טווח גודל מקטע ה- DNA צריך להיות בין 200-600 bp. אם גדלי מקטעי הדנ”א גדולים יותר, המשיכו לדגור על התמיסה במשך 15 דקות נוספות ב-15°C והריצו מוצרים על ג’ל אגרוז 2%. עצור את תגובת תרגום הניק על ידי הוספת 10 mM EDTA, 0.1% SDS (2.5 μL של 0.5 M EDTA, pH 8.0 ב 100 μL ו 1 μL של 10% SDS ב 100 μL). מחממים את התמיסה ב-65°C למשך 5 דקות. כדי להסיר נוקלאוטידים לא משולבים, החל בדיקת BAC על עמודת ספין. ניתן לרכוש עמודי ספין מסחריים, או ליצור אותם באמצעות מזרק כדלקמן: הוסף 30 גרם של Sephadex G-50 עד 500 מ”ל של מאגר עמודות (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0.1% SDS). Autoclave את התערובת. כמו כן, לעשות 500 מ”ל של חיץ עמודה (ללא Sephadex G-50) ו autoclave. צור עמודי סיבוב על ידי הוספת צמר זכוכית autoclaved לתחתית מזרק 1 מ”ל. מלא את מזרק 1 מ”ל עם Sephadex G-50 במאגר עמודה. מניחים מזרק 1 מ”ל לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל בעל צינור מיקרוצנטריפוגה ללא מכסה בתחתית. צנטריפוגה בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות. הסר מזרק ולהשליך את צינור microcentrifuge בתחתית. הוסף צינור מיקרוצנטריפוגה טרי בחזרה לצינור הצנטריפוגה של 15 מ”ל. הוסף מאגר עמודות (ללא Sephadex G-50) למזרק 1 מ”ל והכנס מחדש לצינור צנטריפוגה 15 מ”ל. צנטריפוגה בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות. חזור על שלב זה שוב פעמיים. מוציאים את המזרק ומכניסים לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ”ל המכיל צינור מיקרוצנטריפוגה חדש ונקי. החל בדיקה על מזרק לאסוף בדיקה בצינור microcentrifuge. כדי לזרז את בדיקת ה- DNA להוסיף 5 μL של DNA זרע הרינג (10 מ”ג / מ”ל), 10 μL של נתרן אצטט ו 2.25 נפח של 100% אתנול לתמיסת ה- DNA. מערבבים בעדינות את התמיסה ודגרים בטמפרטורה של -80°C למשך שעה אחת לפחות. צנטריפוגה ב 13,700 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 200 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח למשך 15 דקות ב-4°C. מוציאים את הסופרנאטנט ומייבשים באוויר. לאחר הייבוש, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות או למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (4°C). הגשושית מוכנה כעת לשימוש או עשויה להיות מאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס. עבור כל שקופית, יש לערבב 5 μL DNA בדיקה עם 5 μL Cot-1 DNA ולייבש באמצעות רכז ואקום Speed Vac. לאחר שהגלולה התייבשה, יש להשהות מחדש ב-12 מיקרוליטר של תערובת הכלאה. 3. הכנת הילת DNA מוציאים את צלחת התרבית המרובעת המכילה את המגלשות והתאים המחוברים מהאינקובטור. יש להשליך מדיום, לתייג שקופיות בעזרת עיפרון ולהניח בצנצנת קופלין המכילה 50 מ”ל של שלד ציטוקלטון קר כקרח (CSK): 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.3 M סוכרוז, 10 mM 1, 4-piperazinediethanesulfonic חומצה (PIPES; pH 7.8), 0.5% (v/v) Triton X-100 מורכב במים deionized. יש לדגור במשך 15 דקות על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.אזהרה: Triton X-100 עלול לגרום לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. יש לטפל באמצעות ציוד מגן אישי מתאים כולל כפפות ניטריל, משקפי מגן ומעיל מעבדה. יש להשליך את מאגר CSK ולשטוף במהירות שקופיות ב-50 מ”ל של מאגר הילת DNA 1x (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) שלוש פעמים, כלומר, לטבול את החלק בצנצנת Coplin המכילה DHB ולהסיר. העברת שקופיות לצנצנת Coplin המכילה 50 מ”ל של מאגר מיצוי: 2 M NaCl, 10 mM PIPES (pH 6.8), 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.1% (w/v) digitonin, 0.05 mM (v/v) זרע, 0.125 mM (v/v) זרע. דוגרים במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.אזהרה: דיגיטונין רעיל בבליעה או במגע עם העור והוא קטלני אם נשאף. יש לוודא שהדיגיטונין מטופל בארון אדים מסוג LEV וללבוש מעיל מעבדה, כפפות ניטריל (כפפות כפולות), משקפי בטיחות ומסכה. גם זרע וגם זרע עלולים לגרום לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, בעוד EDTA גורם לגירוי חמור בעיניים, לכן יש לטפל בכל כימיקל בזהירות.הערה: הכינו דיגיטונין בנפרד על ידי המסת האבקה במים בטמפרטורה של 60-70°C. הוסף דיגיטונין מומס למאגר החילוץ לאחר הקירור. הוסף זרע, זרע ודיגיטונין אחרון למאגר המיצוי כדי לשמר את הפעילות הביולוגית. דגירה רצופה של שקופיות ב-50 מ”ל של 10x DHB (1.4 מ’ NaCl, 270 מ”מ KCl, 1.1 מ’ NaHPO 4, 150 מ”מ KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x ו-1x DHB למשך דקה אחת כל אחד. טבילה מחליקה (ישר פנימה וישרה) דרך סדרת אתנול רציף של 50 מ”ל של אתנול 10%, 30%, 70% ו-95% (v/v). יש לייבש את המגלשות באוויר ולאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לביצוע הכלאה דו-ממדית של פלואורסצנטיות באתרה (2D FISH). 4. הכלאה פלואורסצנטית דו-ממדית באתרה הכינו 20x SSC: 3 M NaCl, 0.3 M tri-sodium citrate, pH 7.0. חיץ זה יכול להיות autoclaved, מאוחסן בטמפרטורת החדר, ומדולל לפי הצורך. הכינו 70% (v/v) פורממיד, 2x SSC pH 7.0 וחממו ל-70°C באמבט מים. דגירה על שקופיות, במשך 5 דקות כל אחת, דרך סדרה רציפה של אתנול 50 מ”ל של 70, 90 ו-100% אתנול. מייבשים באוויר מגלשות על צלחת חימום ואופים בתנור של 70 מעלות במשך 5 דקות. ניתן להחליק על ידי הכנסת תמיסת 70% פורממיד, 2x SSC למשך 2 דקות ב-70°C.הערה: הטמפרטורה והתזמון קריטיים לשלב 4.5. אם הטמפרטורה היא הדנ”א לא יתפרק והגשושיות לא יעברו הכלאה, ולא יתקבל אות מהילה של DNA FISH. הניחו את המגלשה המפורקת ב-50 מ”ל אתנול 70% קר כקרח למשך 5 דקות ועברו דרך סדרת אתנול של 90%, 95% ו-100% בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחת. ייבוש באוויר על צלחת חימום טפל ישירות בבדיקות כרומוזום אנושיות כוללות המסומנות ישירות בהתאם להוראות היצרן. עבור ניסויים אלה השתמשנו בצבעי כרומוזום שלמים אנושיים 1, 13, 15, 17 ו-18. בנוסף, בניסוי זה נעשה שימוש בבדיקות גנים CCND1 ו- CTNNA1 .הערה: הן בדיקות הכרומוזומים השלמות והן בדיקות ספציפיות לגן BAC סומנו בביוטין-11-dUTP וזוהו על ידי סטרפטאבידין מצומד לציאנין 3 (Cy3). עבור בדיקות צביעת הכרומוזומים שנעשו על ידי (DOP-PCR) ו- BAC DNA המסומנות על ידי תרגום ניק, אלה יכונו בדיקות DNA מנקודה זו ואילך בפרוטוקול ויטופלו כדלקמן. בדיקת DNA Denature (צבע כרומוזום שלם או בדיקה ספציפית לגן) ב 75 ° C במשך 10 דקות בלוק חם או אמבט מים. יש לחמם את בדיקות הדנ”א בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות בבלוק חם או באמבט מים לפני שפיץ 10 μL על המגלשה המתאימה.הערה: שלב זה חשוב כדי לחסום רצפים כרומוזומליים חוזרים. אם לא מבוצעים, אותות לא ספציפיים עשויים להיווצר ב- DNA, Halo FISH. כיסוי בדיקה עם כיסוי 21 מ”מ x 21 מ”מ להחליק ולאטום באמצעות מלט גומי. דגירה על שקופיות למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 37°C בתא הכלאה לח.הערה: תאי הכלאה לחים יכולים להיות עשויים מקופסאות סנדוויץ’ המכילות מספר שכבות של רקמה לחה ומפלטפורמה מוגבהת הבנויה מפיפטות פלסטיק חתוכות של 10 מ”ל כדי להניח עליהן את המגלשות. זה מכוסה ברדיד אלומיניום כדי למזער את החשיפה לאור. מוציאים את מלט הגומי בזהירות בעזרת מלקחיים. דגירה על שקופיות בתמיסת פורממיד 50% 50% (v/v), 2x SSC, pH 7.0 שחוממה מראש ל-45°C למשך שלוש דגירות של 5 דקות.הערה: אפשר לתלוש הכיסוי ליפול מהשקופית בדגירה הראשונה בתמיסת 50% (v/v) פורממיד, 2x SSC, pH 7.0. זה מונע נזק להכנת הילת הדנ”א שיכול להיגרם על ידי “גרירת” הכיסוי משם. ניתן לסעיר את המגלשות בחיץ באמצעות אחיזה באמצעות מלקחיים כדי לסייע בניתוק הכיסוי. לאחר מכן, מקם שקופיות ב 50 מ”ל של 0.1x SSC, pH 7.0 פתרון שחומם מראש ל 60 ° C אבל ממוקם באמבט מים 45 ° C. דוגרים במשך 5 דקות ומחליפים את החיץ פעמיים נוספות בדגירות של 5 דקות. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מ”ל של 4x SSC, תמיסת pH 7.0 בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה שינויים של חיץ. החל 100 μL של 4% BSA, 4x SSC פתרון על כל שקופית וכיסוי עם חתיכת סרט פרפין. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. זה מונע קשירה לא ספציפית של הנוגדן. כדי לזהות את הבדיקה המסומנת (ביוטין-16-dUTP), יש לדגור עם 100 μL של סטרפטווידין-Cy3 בקנ”מ 1:200 (מיוצר ב-1% BSA, 4x SSC) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.הערה: עקוב אחר הוראות היצרן עם דילול נוגדנים ודילול הבדיקה לפני הניסוי כדי להבטיח הפקת אות טוב מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 50 מ”ל של תמיסת 4x SSC (0.5% Tween-20) pH 7.0 בטמפרטורת החדר ודגרים במשך 15 דקות עם שלושה החלפות חיץ. ניתן להתקין שקופיות בשלב זה כפי שמוצג בשלב 4.21 אם אין צורך באימונופלואורסנציה. אם נדרש מצב התרבות של תאים שהפכו להילות DNA, יש להכתים בנוגדנים נגד pKi67 לאחר שלבי FISH, לפני הרכבה או כתם עבור BrdU משולב.לשטוף שקופיות 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב 50 מ”ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS), ואחריו חסימה עם 4% NCS ב PBS במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. החל 200 μL של הנוגדן הראשוני הדרוש (ארנב אנטי אנושי pKi67; עכבר נגד BrdU) על השקופית, כיסוי עם רצועה של סרט פרפין לדגור בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים במשך 5 דקות ב-1x PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ב-200 מיקרוליטר של נוגדן משני מצומד פלואורוכרום (pKi67: חזיר נגד ארנב TRITC; BrdU: חמור נגד עכבר Cy3). בצע 3 שטיפות נוספות של 5 דקות עם PBS. כל הדילולים יבוצעו באמצעות 1% (v/v) NCS ב- PBS בטווח הדילולים המוצעים של היצרנים. הרכבה מחליקה ב 20 μL של mountant המכיל DAPI וכיסוי עם כיסוי 22 מ”מ x 50 מ”מ. 5. דגי Telomere PNA כדי לזהות טלומרים, השתמש בערכת PNA FISH של הטלומרים – FITC; בצע את ההליך עם הוראות היצרן. יש לבצע את ההליך בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. יש לטבול את המגלשות במי מלח חוצצים בתריס (TBS, pH 7.5) למשך 2 דקות ולאחר מכן להכניס 3.7% פורמלדהיד (ב-TBS; v/v) למשך 2 דקות בדיוק.זהירות: תמיסת TBS מכילה 10-30% טרומטמול ו-10-30% 2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל) פרופאן-1,3-דיול הידרוכלוריד. הדבר עלול לגרום לגירוי חמור בעיניים ובעור, לכן יש ללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן / הגנה על הפנים. יש להשתמש באזור מאוורר היטב. שטפו שקופיות בצנצנת קופלין פעמיים עם TBS במשך 5 דקות כל אחת. יש לטבול את המגלשות בתמיסה טרום-טיפולית למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם כפות למשך 5 דקות לכל כביסה. לאחר מכן, קח את השקופיות דרך סדרת אתנול קר כקרח הכולל 50 מ”ל של 70%, 85% ו 95% (v/v) אתנול במשך 2 דקות לכל ריכוז. לאחר מכן הניחו למגלשות להתייבש באוויר. יש למרוח 10 μL של Telomere PNA Probe/FITC (או Cy3) בהתאם לבחירת צבע התג הפלואורסצנטי, על כל שקופית וכיסוי כיסוי עם כיסוי כיסוי. יש לדגור בתנור שחומם מראש, להגדיר על 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ולאחר מכן מניחים בחושך במשך כשעה.אזהרה: Telomere PNA Probe/FITC מכיל 6-100% פורממיד, הגורם לגירוי חמור בעיניים והוא טרטוגני ולכן עלול לגרום נזק חמור לילד שטרם נולד. אם אישה בהריון או חושדת שהיא בהריון עליהם להימנע מעבודה עם פורממיד. יש להשתמש בפורמיד במכסה אדים LEV וללבוש הגנה מתאימה לעיניים או לפנים. כדי להסיר את הכיסויים, יש לטבול את השקופיות ב’תמיסת שטיפה’ למשך דקה אחת ולאחר מכן להכניס ל’תמיסת כביסה’ למשך 5 דקות בטמפרטורה של 65°C.זהירות: תמיסת שטיפה מכילה 1-5% פוליאוקסאתילן אוקטיל פניל אתר ו-1-5% נתרן כלורי. זהו חומר מאכל ועלול לגרום לנזק חמור לעיניים. יש להרכיב משקפי מגן או הגנה על הפנים בעת הטיפול בתמיסת הכביסה. הדגירה מחליקה דרך 50 מ”ל של סדרת אתנול קר כקרח (70%, 85% ו-95% (v/v)) למשך 2 דקות לכל ריכוז ולאחר מכן מייבשת באוויר. לאחר ההרכבה היבשה, החלק עם תושבת המכילה DAPI וכיסוי עם כיסוי. 6. לכידת תמונה וניתוח כדי להמחיש הילות DNA וטריטוריות כרומוזומים, השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (לדוגמה, מיקרוסקופ Leica DM4000) לכידת תמונות באמצעות מטרת שמן HC PL FLUOTAR 100X/1.30 ומצלמת DFC365FX. לכדו תמונות בקנה מידה אפור והגדירו צבע לכל ערוץ שצולם כדי לאפשר פסאודו-צביעה של תמונות. בניסוי זה נעשה שימוש בתוכנה מסחרית (לדוגמה, תוכנת LAS AF גרסה 4.5.0). ערוצי הצבע הבודדים יוצאו כערוצי TIFF. נתח תמונות באמצעות תוכנית עיבוד התמונה Java Fiji ImageJ. העלה תמונה על ידי לחיצה על קובץ ופתח. טען ערוצי תמונה נפרדים או פצל תמונה ללא הפרדות צבע לערוצים נפרדים בגווני אפור על-ידי לחיצה על תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים. בחר ערוץ תמונה ולחץ על תמונה | כוונן ולאחר מכן בחר בהירות וניגודיות. שנו בהתאם וחזרו על הפעולה עם ערוצים אחרים. צור מסיכה של הגרעין השיורי על-ידי בחירת התעלה המוכתמת ב- DAPI המתארת את הגרעין. לחץ על תמונה | התאם ולאחר מכן בחר סף. תופיע תיבת דו-שיח שבה ניתן לשנות סף, סמן את התיבה רקע כהה . שנה עד שהגרעין השיורי יהיה ברור ולחץ על החל וסגור את תיבת הדו-שיח.הערה: פעולה זו יוצרת מסיכה בינארית המבוססת על עוצמת הפיקסלים, כאשר פיקסלים לבנים מציגים אזורי עניין ופיקסלים שחורים מציגים רקע. חזור על אותו הליך בערוץ הבדיקה. השתמש בבחירה החופשית כדי לשרטט את הפריפריה של הגרעין השיורי ולאחר מכן לחץ על ערוך ונקה בחוץ. שכבו את תעלת הגשושית על הגרעין השיורי. ניתן לעשות זאת על ידי לחיצה על תמונה| צבע | מיזוג ערוצים. לקביעת קנה המידה ב- ImageJ, ציירו קו בסרגל קנה המידה או בין נקודות של שני מרחקים ידועים. עבור אל נתח ולחץ על הגדר קנה מידה. בתיבת הדו-שיח, הוסף את אורך המרחק ולחץ על אישור. כדי למדוד מרחקים, צייר קו בין הנקודות הנמדדות ולחץ על נתח | למדוד. פעולה זו תעביר את ערכי המרחק לחלון נתונים. מדוד את עוצמת DAPI הבהירה ביותר מכיוון שהיא חופפת למרכז הגרעין. ממדידה זו המרחק ממרכז הגרעין לקצה שטח הכרומוזומים הרחוק ביותר (CTE). למדוד את המרחק של המרכז הגרעיני לקצה הגרעיני (NE). ודא שהתוצאות מוצגות כיחס CTE/NE. כאן המרחק מהמרכז הגרעיני לכל קצה טריטוריית הכרומוזומים הרחוקה ביותר (CTE) מחולק במרחק מהמרכז הגרעיני לכל קצה גרעיני בהתאמה (NE). זה צריך להתבצע על מינימום של 50 גרעינים. זה עשוי להיות מתואר כתרשים עמודות או תיבה. לניתוח הטלומרים, נתח לפחות 30 גרעינים לכל מערך נתונים. ניתן לנתח תמונות באמצעות Fiji ImageJ או באופן ידני כדי לספור את מספר הטלומרים בתוך הגרעין השיורי ובתוך הילת הדנ”א. BrdU או pKi67 אפשרו הבחנה בין גרעינים מתרבים (BrdU/piK67+) וגרעינים מזדקנים/שקטים (BrdU/pKi67-). הנתונים עשויים להיות מתוארים בתרשימי עמודות עם קווי שגיאה המתאימים לשגיאת תקן של הממוצע (SEM). השתמש במבחן t של תלמיד (לא מזווג) כדי להשוות סטטיסטית את התוצאות עם p> 0.05 נחשב מובהק.