Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences,Brunel University London, 2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences,University of Hertfordshire
Summary
Het combineren van DNA-halopreparaten met fluorescentie in situ hybridisatie maakt een analyse met hoge resolutie van genomische interacties met het nucleoskelet mogelijk. Bijgevoegd genoom leidt tot gehybridiseerde fluorescerende signalen die zich in de resterende geëxtraheerde kernen bevinden, terwijl het niet-gehechte genoom zich in de halo van DNA rond de resterende kernen bevindt.
Abstract
Het genoom is geassocieerd met verschillende structuren in celkernen, om de activiteit ervan te reguleren en op specifieke locaties te verankeren. Deze structuren staan gezamenlijk bekend als het nucleoskelet en omvatten de nucleaire lamina, de nucleoli en nucleaire lichamen. Hoewel er veel varianten van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) bestaan om het genoom en zijn organisatie te bestuderen, zijn deze vaak beperkt door resolutie en bieden ze onvoldoende informatie over de associatie van het genoom met nucleaire structuren. De DNA-halo-methode maakt gebruik van hoge zoutconcentraties en niet-ionische detergentia om DNA-lussen te genereren die verankerd blijven aan structuren in kernen via hechtingsgebieden in het genoom. Hier worden oplosbare nucleaire eiwitten, zoals histonen, lipiden en DNA dat niet nauw gebonden is aan de kernmatrix, geëxtraheerd. Dit leidt tot de vorming van een halo van ongebonden DNA rond een restkern die zelf DNA bevat dat nauw verbonden is met interne nucleaire structuren en extractieresistente eiwitten. Deze uitgebreide DNA-strengen maken een hogere resolutie mogelijk en kunnen fysieke mapping vergemakkelijken. In combinatie met FISH heeft deze methode het extra voordeel dat het genomische interacties bestudeert met alle structuren waarmee het genoom is verankerd. Deze techniek, halo-fish genaamd, is zeer veelzijdig waarbij DNA-halo’s kunnen worden gekoppeld aan nucleïnezuursondes om genloci, hele chromosomen, alfasatellieten, telomeren en zelfs RNA te onthullen. Deze techniek geeft inzicht in nucleaire organisatie en functie in normale cellen en in ziekteprogressie zoals bij kanker.
Introduction
De “nucleaire matrix” werd voor het eerst beschreven door Berezney en Coffey in 19741. Na het uitvoeren van extracties met hoge zoutkiezen en nucleasebehandeling op leverkernen van ratten, identificeerden ze een eiwitachtig structureel raamwerk. De DNA-haloprocedure werd vervolgens aangepast van deze methode en omvat de verwijdering van oplosbare eiwitten, zodat alleen de nucleaire matrix (NM) en NM-geassocieerde eiwitten en chromosomen blijven bestaan. DNA-aanhechtingsgebieden bevinden zich aan de basis van DNA-lussen en worden matrix attached regions (MARs) of scaffold attachment regions (SAR’s) genoemd, die resistent zijn tegen extractie met hoge zoutconcentraties en respectievelijk ionisch wasmiddel lithium-3,5-diiodosalicylaat (LIS). In DNA-halo’s wordt DNA geassocieerd met MARs / SAR’s gebonden binnen de resterende kern, terwijl de DNA-lussen zich uitstrekken van deze plaatsen en de DNA-halo vormen. We weten nu dat het genoom via lamina-geassocieerde domeinen (LADs) is verankerd aan de nucleaire lamina en via nucleolaire geassocieerde regio’s (NADs) en mogelijk via andere nucleaire structuren zoals specifieke nucleaire lichamen.
De DNA-halo-methode kan worden gebruikt voor het fysiek in kaart brengen van DNA, genen en chromosomale regio’s, omdat het uitgebreide DNA en chromatine een grotere resolutie bieden omdat het chromatine is ontdaan van histonen en het DNA 2,3,4,5,6 is uitgerekt. Er zijn echter enkele beperkingen bij het gebruik van DNA-halo’s voor deze toepassing. DNA dat nauw verbonden is met restkernen van DNA-halo’s kan bijvoorbeeld ontoegankelijk zijn voor sondes, waardoor het wordt uitgesloten van analyse en fysieke kartering6. Andere technieken zoals fiber-FISH 2,4,5,7 en moleculair kammen8 maken ook fysieke mapping mogelijk en hebben het voordeel dat ze relatief snel en gemakkelijk uit te voeren zijn. Beide worden bij voorkeur gebruikt voor DNA-mapping van genen boven DNA-halo’s. Deze methoden extraheren chromatinevezels via het gebruik van oplosmiddel- of zoutextracties uit de kern, maar moleculair kammen heeft meestal een betere reproduceerbaarheid 8,9.
Er is een toenemend bewijs dat het nucleoskelet een rol speelt bij het ondersteunen van belangrijke nucleaire processen, zoals hechtingsplaatsen voor DNA, chromatine-remodellering, DNA-transcriptie, DNA-reparatie en DNA-replicatie11,12. Als zodanig is de DNA-halotechniek ontwikkeld om de interacties tussen het nucleoskelet en het genoom tijdens deze cellulaire activiteiten te onderzoeken en is routinematig gebruikt en gerapporteerd in onderzoek. Deze techniek is ook gebruikt om interacties tussen het genoom en het nucleoskeleton te onderzoeken in relatie tot ziekteprogressie waarbij maligniteit-geassocieerde veranderingen in de nucleaire structuur worden geïdentificeerd11.
De DNA-halotechniek is ook gebruikt om de relatie tussen het genoom en het nucleoskelet tijdens de ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken12. Een aantal studies hebben een variatie van de DNA-halotechniek gebruikt die bekend staat als halosperm13 of SpermHalo-FISH indien gekoppeld aan FISH14. Spermatozoa chromatine is nauw gebonden aan eiwitten die bekend staan als protamines en deze techniek is ontwikkeld om de toegang tot het sperma-DNA te verbeteren. Halosperm is gebruikt om de integriteit van spermatozoa DNA te onderzoeken en te bepalen of DNA-schade aanwezig is. Spermatozoa met minder DNA-schade correleren met een grotere DNA-halogrootte, terwijl spermatozoa met verhoogde niveaus van gefragmenteerd en beschadigd DNA kleine halo’s of helemaal geen halo’s hadden. Halosperm kan dus worden gebruikt als een potentiële prognostische marker van embryokwaliteit en succesvolle zwangerschap met IVF13. Dit voorbeeld benadrukt de mogelijke klinische toepassingen van deze techniek. In ons werk hebben we HALO-FISH gebruikt om veranderingen in genoomgedrag en het effect van specifieke medicamenteuze behandelingen bij de vroegtijdige verouderingsziekte Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS) te beoordelen15.
Samen benadrukken deze, en andere studies, de breedte van processen / toepassingen die de DNA-halo-techniek kan worden gebruikt om te bestuderen en het nut van de techniek.
Protocol
1. Diavoorbereiding, sterilisatie en celkweek Bereid 500 ml 10% HCl (v/v) en giet in een groot bekerglas. Laat de microscoop afzonderlijk in het zuur glijden en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker die is ingesteld op 2 x g.LET OP: HCl is bijtend en irriterend. Het kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging en irritatie van de huid, ogen en luchtwegen veroorzaken. Zorg voor de juiste persoonlijke bescherming, inclusief nitrilhandschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Decanteer zuur uit het bekerglas en de was glaasjes tien keer in leidingwater en daarna nog eens tien keer in gedeïoniseerd water. Spoel glaasjes tweemaal in methanol en bewaar in methanol tot sterilisatie door vlammen.LET OP: Methanol is een licht ontvlambare vloeistof en giftig bij inslikken, contact met de huid of bij inademing. Bovendien kan methanol schade aan organen veroorzaken, is het corrosief en irriterend. Houd u aan de blootstellingslimieten op de werkplek en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke bescherming wordt gedragen, inclusief butylrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Waar mogelijk handvat in een lokale afzuigventilatie (LEV) zuurkast. Verwijder met een metalen tang of een lange tang een microscoopglaasje uit het bekerglas met methanol. Vlam boven een Bunsen-brander om te steriliseren en over te brengen in een rechthoekig celkweekvat met vier compartimenten voor dia’s, dicht bij de Bunsen-brander.LET OP: Vlammen maakt onmiddellijke sterilisatie van microscoopglaasjes vóór gebruik mogelijk; Deze methode heeft echter wel bijbehorende gevaren. Omdat methanol licht ontvlambaar is, is het belangrijk dat het bekerglas met de glaasjes uit de buurt van de Bunsen-brander wordt geplaatst. Er moet een lange tang of tang worden gebruikt die de dia’s stevig vastgrijpt. Het methanolgehalte in het bekerglas moet alleen de dia’s bedekken, om zowel de hoeveelheid gebruikte methanol te minimaliseren als zodat alleen de uiteinden van de tang in contact komen met de methanol. Zorg er altijd voor dat de methanol na gebruik uit de tang of tang is verdampt en dat deze zijn afgekoeld voordat u deze terugplaatst in het bekerglas met de glaasjes en methanol. Het bekerglas moet worden afgedekt met een stuk aluminiumfolie om de zuurstof uit te hongeren als de methanol vlam vat. Vlam schuift nooit in een klasse II laminaire stromingskap waar de lucht wordt gecirculeerd. U kunt ook stap 1.1 tot en met 1.4 uitvoeren, maar in plaats van de dia’s te vlammen na het incuberen met methanol, plaatst u dia’s op pluisvrij weefsel om aan de lucht te drogen. Eenmaal droog, wikkel in aluminiumfolie en plaats in een sterilisatoroven of autoclaaf. Kweek cellen in het juiste medium met serum gedurende ten minste 48 uur bij 37 °C in 5% CO2 totdat 60-70% confluentie is bereikt. Dit protocol werd uitgevoerd op een vroege passage van humane dermale fibroblasten (HDF’s) en op klassieke Hutchinson-Gilford progeriasyndroom (HGPS) fibroblasten (AG06297) en atypische type 2 HGPS fibroblasten (AG08466). Oogst elk celtype en tel met behulp van een hemocytometer om de celdichtheid te bepalen. Zaai 1 x 105 cellen in 10 ml medium per glaasje.OPMERKING: De celdichtheid is belangrijk omdat DNA-lussen van verschillende kernen kunnen convergeren als cellen te confluent worden. Zaaidichtheden moeten mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het gebruikte celtype, omdat getransformeerde cellen zich sneller kunnen vermenigvuldigen, terwijl celculturen met latere passage langer kunnen duren om de gewenste confluentie te bereiken. Als cellen in G0 moeten worden gestopt om rustig te worden, zaai dan 1 x 105 cellen (in 10 ml medium) per dia en laat 24 uur groeien. Was cellen tweemaal met serumvrij medium en incubeer in standaardmedium dat een lagere concentratie serum bevat bij 0,5% (pasgeboren kalfsserum, NCS; of foetaal runderserum, FBS) gedurende 7 dagen. Als de proliferatieve status van de cellen vereist is voor de DNA Halo-test, bepaal dan cellen die de S-fase hebben doorlopen door de opname van 5-broom-2′-deoxy-uridine (BrdU) in het DNA tijdens replicatie.Zaadcellen zoals normaal en groeien gedurende 24 uur. Verwijder het kweekmedium en vervang het door een medium dat BrdU en 5-fluor-2′-deoxyuridine (3 μg/μL) bevat. Verwijder na nog eens 24 uur het medium, was de cellen eenmaal met medium (10% NCS) en voer vervolgens opnieuw met vers medium (10% NCS). Incubeer nog eens 24 uur en bereid vervolgens de dia’s voor op de DNA-halotest. 2. Sondevoorbereiding Chromosoom hele en arm schilderij sondesMaak chromosoomsondes van de amplificatie van flow gesorteerde of microdissected chromosomen door gedegenereerde oligonucleotide geprimeerde polymerasekettingreactie (DOP-PCR) met behulp van de methode van Telenius et al.16. Gebruik DOP-PCR om chromosoomsondes te labelen met Biotine-16-dUTP of Digoxigenine-11-dUTP zoals weergegeven in tabel 1. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het versterkingsprofiel, maar de omstandigheden die voor dit experiment zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2. Bereid arm of hele chromosoomsonde voor door 8 μL gelabeld PCR-product, 7 μL Cot-1 DNA, 3 μL haringsperma, 1/20e volume 3 M natriumacetaat (pH 5,4) en 2 volumes 100% ethanol bij elkaar op te tellen. Incubeer de sondeoplossing gedurende minimaal 30 minuten bij -80 °C.OPMERKING: Deze methode kan worden gebruikt om sondes met één chromosoom of meerdere chromosoomsondes te maken als verschillende labels (d.w.z. Biotine-16-UTP en Digoxigenine-11-dUTP) worden gebruikt voor elk chromosoom van belang.LET OP: Ethanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp en kan ernstige oogirritatie veroorzaken. Uit de buurt houden van warmte, hete oppervlakken en ontstekingsbronnen. Houd u aan de blootstellingslimieten op de werkplek en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke bescherming wordt gedragen, inclusief butylrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Waar mogelijk handvat in een LEV zuurkast. Centrifuge sonde-oplossing bij 13.700 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en vervolgens wassen met 70% ethanol. Herhaal de centrifugatieprocedure en gooi het supernatant weg, waarbij u ervoor zorgt dat de DNA-pellet niet wordt verstoord of verloren. Laat de DNA-pellet drogen. Voeg 12 μL hybridisatiebuffer (50% formamide, 10% dextransulfaat, 10% 20x zoutoplossing natriumcitraat (SSC; 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitraat; pH 7,0), 1% (v/v) polyoxyethyleen sorbinaal monolauraat (Tween-20)) toe aan de DNA-pellet. Laat bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur de DNA-pellet oplossen in de hybridisatiebuffer.LET OP: Formamide is kankerverwekkend en teratogeen en kan dus ernstige schade toebrengen aan een ongeboren kind. Als een vrouw zwanger is of vermoedt dat ze zwanger is, moeten ze het werken met formamide vermijden. Formamide moet worden gebruikt in een LEV-zuurkast. Houd u aan de blootstellingslimieten op de werkplek en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke bescherming wordt gedragen, inclusief butylrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. DNA-isolatie van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs)Streep een klein deel van de glycerolvoorraad van de BAC-kloon op een Luria-Bertani (LB) agarplaat (1% (W/V) NaCl; 1% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) gistextract, 1,5% (w/v) Agar Technical, 12,5 μg/ml (w/v) chlooramfenicol). Incubeer een nacht bij 37 °C. Selecteer een enkele kolonie uit de plaat en ent 10 ml LB-bouillon (1% (w / v) NaCl, 1% (w / v) bactotrypton, 0,5% (w / v) gistextract, 12,5 μg / ml (w / v) chlooramfenicol). Laat de oplossing een nacht in een broedmachine bij 37 °C liggen.LET OP: Chlooramfenicol wordt verdacht van het veroorzaken van kanker. Voorzichtig omgaan en blootstelling verminderen. Centrifugecultuur bij 1.700 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi supernatant weg en voeg 300 μL P1-oplossing (15 mM Tris (pH 8), 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A) toe aan de pellet. Vortex krachtig en breng cellen over naar een microcentrifugebuis van 2 ml. Voeg druppelsgewijs 300 μL P2-oplossing (0,2 M NaOH, 1% (m/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) druppelsgewijs toe aan de cellen. Keer de gesloten microcentrifugebuis 5 keer om en laat maximaal 5 minuten op kamertemperatuur staan.LET OP: Natriumhydroxide is corrosief en kan ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken. Het kan corrosief zijn voor metalen. Voorzichtig omgaan en blootstelling verminderen. Houd u aan de blootstellingslimieten op de werkplek en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke bescherming wordt gedragen, waaronder nitrilrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Waar mogelijk handvat in een LEV zuurkast.LET OP: Natriumdodecylsulfaat is een ontvlambare vaste stof, schadelijk bij inslikken en kan huid- en ademhalingsirritatie veroorzaken. Het kan ook ernstig oogletsel veroorzaken. Zorg voor de juiste persoonlijke bescherming, inclusief nitrilrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Waar mogelijk handvat in een LEV zuurkast. Voeg 300 μL P3 (3 M kaliumacetaat) langzaam toe aan de cellen en meng voorzichtig. Plaats de microcentrifugebuis gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 8.100 x g bij 4 °C en breng het supernatant over in een buis met 800 μL ijskoud isopropanol. Keer de buis meerdere keren om en incubeer ‘s nachts bij -20 °C.LET OP: Isopropanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp en kan ernstige oogirritatie, slaperigheid of duizeligheid veroorzaken. Uit de buurt houden van warmte, hete oppervlakken en ontstekingsbronnen. Houd u aan de blootstellingslimieten op de werkplek en zorg ervoor dat de juiste persoonlijke bescherming wordt gedragen, inclusief nitrilrubberen handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas. Waar mogelijk handvat in een LEV)zuurkast. Centrifugeer bij 8.100 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en breng het over naar een andere buis. Voeg 500 μL ijskoude 70% ethanol toe. Keer de buis om en centrifugeer meerdere keren bij 8.100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en droog de pellet aan de lucht bij kamertemperatuur. Zodra de pellet droog is, suspensie opnieuw in 40 μL diethylpyrocarbonaat-behandeld water (DEPC-behandeld) en een nacht bij 4 °C laten staan. Eenmaal volledig geresuspendeerd, verwijdert u 5 μL oplossing en laadt u een 1% agarose-gel om te controleren op de aanwezigheid van DNA. Single gen probe voorbereiding van BACs via nick vertalingGebruik in de handel verkrijgbare nick vertaling etiketteringskits. U kunt ook het volgende protocol gebruiken. Zie tabel 3 voor bestanddelen en volumes. Voeg de bestanddelen uit tabel 3 samen in een microcentrifugebuis en voeg de DNA Polymerase I als laatste toe, meng voorzichtig en centrifugeer kort gedurende een paar seconden. Incubeer de oplossing bij 15 °C gedurende 2 uur. Om de fragmentgrootte te controleren, laadt u 5 μL van de oplossing op een 2% agarose-gel. De grootte van het DNA-fragment moet tussen 200-600 bp liggen. Als de DNA-fragmentgroottes groter zijn, blijf dan de oplossing nog eens 15 minuten incuberen bij 15 °C en laat producten op 2% agarosegel lopen. Stop de nick-translatiereactie door toevoeging van 10 mM EDTA, 0,1% SDS (2,5 μL van 0,5 M EDTA, pH 8,0 in 100 μL en 1 μL van 10% SDS in 100 μL). Verwarm de oplossing gedurende 5 minuten op 65 °C. Om niet-geïncorporeerde nucleotiden te verwijderen, brengt u de BAC-sonde aan op een spinkolom. Commerciële spinkolommen kunnen als volgt worden gekocht of ze kunnen worden gemaakt met behulp van een spuit: Voeg 30 g Sephadex G-50 toe aan 500 ml kolombuffer (10 mM Tris-HCl (pH8), 1 mM EDTA, 0,1% SDS). Autoclaaf het mengsel. Maak ook 500 ml kolombuffer (zonder Sephadex G-50) en autoclaaf. Maak draaikolommen door geautoclaveerde glaswol toe te voegen aan de bodem van een spuit van 1 ml. Vul de spuit van 1 ml met Sephadex G-50 in kolombuffer. Plaats 1 ml spuit in een centrifugebuis van 15 ml met een microcentrifugebuis zonder deksel aan de onderkant. Centrifugeer op 1.600 x g gedurende 5 min. Verwijder de spuit en gooi de microcentrifugebuis aan de onderkant weg. Voeg een verse microcentrifugebuis toe aan de centrifugebuis van 15 ml. Voeg kolombuffer (zonder Sephadex G-50) toe aan de spuit van 1 ml en plaats deze opnieuw in de centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer op 1.600 x g gedurende 5 min. Herhaal deze stap nogmaals twee keer. Verwijder de spuit en plaats deze in een centrifugebuis van 15 ml die een nieuwe schone microcentrifugebuis bevat. Breng de sonde aan op de spuit en verzamel de sonde in de microcentrifugebuis. Om de DNA-sonde neer te slaan, voegt u 5 μL haringsperma-DNA (10 mg / ml), 10 μL natriumacetaat en 2,25 volume 100% ethanol toe aan de DNA-oplossing. Meng de oplossing voorzichtig en incubeer bij -80 °C gedurende minimaal 1 uur. Centrifugeer bij 13.700 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de pellet met 200 μL ijskoud 70 % ethanol gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en droog aan de lucht. Eenmaal droog hersuspensie pellet in 20 μL DEPC-behandeld water bij kamertemperatuur gedurende enkele uren of ‘s nachts bij 4 °C. De sonde is nu klaar voor gebruik of kan worden opgeslagen bij -20 °C. Meng voor elke dia 5 μL sonde-DNA met 5 μL Cot-1 DNA en droog met behulp van een Speed Vac-vacuümconcentrator. Zodra de pellet is gedroogd, suspensie opnieuw in 12 μL hybridisatiemengsel. 3. DNA Halo preparaat Verwijder de vierkante kweekschaal met de dia’s en de aangehechte cellen uit de incubator. Gooi het medium weg, etiketteer dia’s met een potlood en plaats in een Coplin-pot met 50 ml ijskoude cytoskelet (CSK) buffer: 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 M sucrose, 10 mM 1, 4-piperazinediethanesulfonzuur (PIPES; pH 7,8), 0,5% (v / v) Triton X-100 gemaakt in gedeïoniseerd water. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs of bij 4 °C.LET OP: Triton X-100 kan huidirritatie en ernstig oogletsel veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder nitrilhandschoenen, een bril en een laboratoriumjas. Gooi de CSK-buffer weg en spoel glaasjes snel af in 50 ml 1x DNA-halobuffer (DHB; 140 mM NaCl, 27 mM KCl, 110 mM NaHPO 4, 15 mM KH2PO 4; pH7.4) drie keer, d.w.z. dompel in Coplin-pot met DHB en verwijder ze. Breng de dia’s over in een Coplin-pot met 50 ml extractiebuffer: 2 M NaCl, 10 mM PIPES (pH 6,8), 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,1% (w/v) digitonine, 0,05 mM (v/v) spermine, 0,125 mM (v/v) spermidine. Incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.LET OP: Digitonine is giftig bij inslikken of in contact met de huid en is dodelijk bij inademing. Zorg ervoor dat digitonine wordt behandeld in een LEV-zuurkast en draag een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen (dubbele handschoenen), veiligheidsbril en masker. Zowel spermine als spermidine kunnen ernstige brandwonden en oogbeschadiging veroorzaken, terwijl EDTA ernstige oogirritatie veroorzaakt, dus behandel elke chemische stof met zorg.OPMERKING: Bereid digitonine afzonderlijk door het poeder op te lossen in water bij een temperatuur van 60-70 °C. Voeg opgeloste digitonine toe aan de extractiebuffer zodra deze is afgekoeld. Voeg spermine, spermidine en digitonine als laatste toe aan de extractiebuffer om de biologische activiteit te behouden. Incubeer dia’s achtereenvolgens in 50 ml 10x DHB (1,4 M NaCl, 270 mM KCl, 1,1 M NaHPO 4, 150 mM KH2PO4; PH7.4), 5x, 2x en 1x DHB gedurende 1 min elk. Dip glijdt (straight-in en straight-out) door een 50 ml sequentiële ethanolserie van 10%, 30%, 70% en 95% (v/v) ethanol. Aan de lucht drogen dia’s en bewaren bij -80 °C totdat tweedimensionale fluorescentie in situ hybridisatie (2D FISH) wordt uitgevoerd. 4. Tweedimensionale fluorescentie in situ hybridisatie Maak 20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M trinatriumcitraat, pH 7,0. Deze buffer kan worden geautoclaveerd, opgeslagen bij kamertemperatuur en indien nodig verdund. Maak 70% (v/v) formamide, 2x SSC pH 7,0 en verwarm tot 70 °C in een waterbad. Incubeer dia’s, gedurende 5 minuten elk, door een sequentiële 50 ml ethanolserie van 70, 90 en 100% ethanol. Schuif de dia’s aan de lucht op een warmhoudplaat en bak 5 minuten in een oven van 70 °C. Denaturering glijdt door plaatsing in de 70% formamide, 2x SSC-oplossing gedurende 2 minuten bij 70 °C.OPMERKING: De temperatuur en timing zijn van cruciaal belang voor stap 4.5. Als de temperatuur is, zal het DNA niet denatureren en zullen de sondes niet hybridiseren en zal er geen signaal worden verkregen van DNA halo FISH. Plaats de gedenatureerde dia gedurende 5 minuten in 50 ml ijskoude 70% ethanol en doorloop een ethanolreeks van 90%, 95% en 100% bij kamertemperatuur gedurende elk 5 minuten. Aan de lucht drogen op een warmhoudplaat Behandel direct gelabelde totale menselijke chromosoomsondes volgens de instructies van de fabrikant. Voor deze experimenten gebruikten we menselijke hele chromosoomverven 1, 13, 15, 17 en 18. Bovendien werden in dit experiment CCND1 – en CTNNA1-gensondes gebruikt.OPMERKING: Zowel de hele chromosoomsondes als bac-genspecifieke sondes werden gelabeld met biotine-11-dUTP en gedetecteerd door streptavidin geconjugeerd aan cyaan 3 (Cy3). Voor de chromosoomschildersondes gemaakt door (DOP-PCR) en BAC DNA gelabeld door nick translation, zullen deze vanaf dit punt in het protocol worden aangeduid als DNA-probes en als volgt worden behandeld. Denaturering DNA-sonde (hele chromosoomverf of genspecifieke sonde) bij 75 °C gedurende 10 minuten in een hot-block of waterbad. Warme DNA-sondes bij 37 °C gedurende 30 minuten in een hot-block of waterbad voordat 10 μL op de juiste glijbaan wordt gepipetteerd.OPMERKING: Deze stap is belangrijk om repetitieve chromosomale sequenties te blokkeren. Indien niet uitgevoerd, kunnen niet-specifieke signalen worden geproduceerd in de DNA Halo FISH. Overlay sonde met een 21 mm x 21 mm coverslip en afdichting met rubbercement. Incubeer de dia’s gedurende minimaal 18 uur bij 37 °C in een bevochtigde hybridisatiekamer.OPMERKING: Bevochtigde hybridisatiekamers kunnen worden gemaakt van sandwichdozen die verschillende lagen bevochtigd weefsel bevatten en een verhoogd platform dat is opgebouwd uit gesneden plastic pipetten van 10 ml om de dia’s op te laten rusten. Dit is bedekt met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Verwijder het rubbercement voorzichtig met een tang. Incubeer dia’s in 50 ml 50% (v/v) formamide, 2x SSC, pH 7.0 oplossing die is voorverwarmd tot 45 °C gedurende drie incubaties van 5 minuten.OPMERKING: Laat de coverslip bij de eerste incubatie van de glijbaan vallen in 50% (v/v) formamide, 2x SSC, pH 7.0 oplossing. Dit voorkomt schade aan het DNA Halo-preparaat die zou kunnen worden veroorzaakt door het ‘wegslepen’ van de coverslip. De schuiven kunnen in de buffer worden geroerd door een tang vast te pakken om de afdekplaat los te maken. Plaats vervolgens de dia’s in 50 ml 0,1x SSC, pH 7,0-oplossing die is voorverwarmd tot 60 °C maar in een waterbad van 45 °C is geplaatst. Incubeer gedurende 5 minuten en vervang de buffer nog twee keer door incubaties van 5 minuten. Plaats de dia’s in een Coplin-pot met 50 ml 4x SSC, pH 7,0-oplossing bij kamertemperatuur en incubeer gedurende 15 minuten met drie bufferwisselingen. Breng 100 μL 4% BSA, 4x SSC-oplossing aan op elke dia en overlay met een stuk paraffinefilm. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Dit voorkomt niet-specifieke binding van het antilichaam. Om de gelabelde sonde (biotine-16-dUTP) te detecteren, incubeer je met 100 μL van een 1:200 (gemaakt in 1% BSA, 4x SSC) streptavidin-Cy3 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant met verdunningen van antilichamen en testverdunning voorafgaand aan het experiment om ervoor te zorgen dat een goed signaal wordt geproduceerd Plaats de dia’s in een Coplin-pot met 50 ml 4x SSC (0,5% Tween-20) pH 7,0-oplossing bij kamertemperatuur en incubeer gedurende 15 minuten met drie bufferwisselingen. Dia’s kunnen in dit stadium worden gemonteerd zoals weergegeven in stap 4.21 als immunofluorescentie niet vereist is. Als de proliferatieve status van cellen die in DNA-halo’s zijn gemaakt vereist is, kleurt u met anti-pKi67-antilichamen na de FISH-stappen, voorafgaand aan de montage of kleurt u voor opgenomen BrdU.Was de dia’s 3 keer gedurende 5 minuten elk in 50 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door blokkering met 4% NCS in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Breng 200 μL van het benodigde primaire antilichaam (konijn anti-humaan pKi67; muis anti-BrdU) aan op de dia, overlay met een strook paraffinefilm en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de glaasjes 3 keer gedurende 5 minuten in 1x PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in 200 μL fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (pKi67: varkens anti-konijn TRITC; BrdU: ezel anti-muis Cy3). Voer nog 3 wasbeurten van 5 minuten uit met PBS. Alle verdunningen die moeten worden uitgevoerd met behulp van 1% (v/v) NCS in PBS bij het door de fabrikant voorgestelde verdunningsbereik. Monteer dia’s in 20 μL montagemiddel met DAPI en overlay met een 22 mm x 50 mm coverslip. 5. Telomere PNA VIS Om telomeren te detecteren, gebruikt u telomeer PNA FISH-kit – FITC; Voer de procedure uit met de instructies van de fabrikant. De procedure moet bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Dompel de dia’s gedurende 2 minuten onder in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,5) en plaats ze vervolgens precies 2 minuten in 3,7% formaldehyde (in TBS; v/v).LET OP: TBS-oplossing bevat 10-30% trometamol en 10-30% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propaan-1,3-diolhydrochloride. Dit kan ernstige oog- en huidirritatie veroorzaken, dus draag beschermende handschoenen en een bril / gezichtsbescherming. Gebruik in een goed geventileerde ruimte. Was de dia’s in een Coplin-pot twee keer met TBS gedurende elk 5 minuten. Dompel de dia’s gedurende 10 minuten onder in een voorbehandelingsoplossing en was vervolgens twee keer met TBS gedurende 5 minuten per wasbeurt. Neem vervolgens de dia’s door een ijskoude ethanolserie bestaande uit 50 ml 70%, 85% en 95% (v / v) ethanol gedurende 2 minuten per concentratie. Laat daarna de glijbanen aan de lucht drogen. Breng 10 μL Telomere PNA Probe/FITC (of Cy3) aan, afhankelijk van de keuze van de fluorescerende tagkleuring, op elke dia en cover overlay met een coverslip. Incubeer in een voorverwarmde oven op 80 °C gedurende 5 minuten en plaats vervolgens ongeveer 1 uur in het donker.LET OP: Telomere PNA Probe/FITC bevat 6-100% formamide, dat ernstige oogirritatie veroorzaakt en teratogeen is en dus ernstige schade kan toebrengen aan een ongeboren kind. Als een vrouw zwanger is of vermoedt dat ze zwanger is, moeten ze het werken met formamide vermijden. Formamide moet worden gebruikt in een LEV-zuurkast en er moet passende oog- of gezichtsbescherming worden gedragen. Om de afdekstroken te verwijderen, dompelt u de dia’s gedurende 1 minuut onder in ‘Spoeloplossing’ en plaatst u deze vervolgens gedurende 5 minuten in de ‘Wasoplossing’ bij 65 °C.LET OP: Wasoplossing bevat 1-5% polyoxyethyleen octylfenylether en 1-5% natriumchloride. Dit is corrosief en kan ernstig oogletsel veroorzaken. Zorg ervoor dat een bril of gezichtsbescherming wordt gedragen bij het hanteren van de wasoplossing. Incubeer glijdt door een ijskoude ethanolserie van 50 ml (70%, 85% en 95% (v/v)) gedurende 2 minuten per concentratie en droogt vervolgens aan de lucht. Eenmaal droog gemonteerd schuif met mountant met DAPI en overlay met een coverslip. 6. Vastleggen en analyseren van afbeeldingen Om DNA-halo’s en chromosoomgebieden te visualiseren, gebruikt u een epifluorescentiemicroscoop (bijv. Leica DM4000-microscoop) die beelden vastlegt met behulp van een HC PL FLUOTAR 100X / 1.30 olieobjectief en DFC365FX-camera. Leg afbeeldingen in grijstinten vast en definieer de kleur voor elk vastgelegd kanaal om pseudokleuring van afbeeldingen mogelijk te maken. In dit experiment werd commerciële software gebruikt (bijv. LAS AF versie 4.5.0 software). De afzonderlijke kleurkanalen werden geëxporteerd als TIFF’s. Analyseer afbeeldingen met behulp van het Java-beeldverwerkingsprogramma Fiji ImageJ. Upload de afbeelding door op Bestand en Openen te drukken. Laad afzonderlijke afbeeldingskanalen of splits een samengestelde afbeelding in afzonderlijke grijswaardenkanalen door op Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen. Selecteer een afbeeldingskanaal en klik op Afbeelding | Pas aan en selecteer vervolgens Helderheid & Contrast. Wijzig dienovereenkomstig en herhaal met andere kanalen. Maak een masker van de restkern door het DAPI-gekleurde kanaal te selecteren dat de kern weergeeft. Klik op afbeelding | Pas aan en selecteer vervolgens Drempel. Er verschijnt een dialoogvenster waarin de drempel kan worden gewijzigd, vink het vakje Donkere achtergrond aan. Wijzig totdat de restkern helder is en druk op Toepassen en sluit het dialoogvenster.OPMERKING: Hiermee wordt een binair masker gemaakt op basis van de pixelintensiteit, waarbij witte pixels interessante gebieden weergeven en zwarte pixels de achtergrond. Herhaal dezelfde procedure op het sondekanaal. Gebruik de selectie uit de vrije hand om de periferie van de restkern te schetsen en klik vervolgens op Bewerken en Buiten wissen. Leg het sondekanaal over de restkern. Dit kan door op Image| te drukken Kleur | Kanalen samenvoegen. Als u de meetschaal in ImageJ wilt instellen, tekent u een lijn op de schaalbalk of tussen de punten van twee bekende afstanden. Ga naar Analyseren en druk op Schaal instellen. Voeg in het dialoogvenster de afstandslengte toe en klik op OK. Als u afstanden wilt meten, tekent u een lijn tussen de punten die worden gemeten en klikt u op Analyseren | Meten. Hiermee worden de afstandswaarden overgebracht naar een gegevensvenster. Meet de helderste DAPI-intensiteit omdat deze samenvalt met het centrum van de kern. Hieruit wordt de afstand van het kerncentrum tot de verste chromosoomrand (CTE) gemeten. Meet de afstand van het nucleaire centrum tot de nucleaire rand (NE). Zorg ervoor dat de resultaten worden weergegeven als een CTE / NE-verhouding. Hier wordt de afstand van het nucleaire centrum tot elke verste chromosoomterritoriumrand (CTE) gedeeld door de afstand van het nucleaire centrum tot elke respectieve nucleaire rand (NE). Dit moet worden uitgevoerd op minimaal 50 kernen. Dit kan worden weergegeven als een staaf- of doosdiagram. Analyseer voor de analyse van de telomeren minimaal 30 kernen per dataset. Beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van Fiji ImageJ of handmatig om het aantal telomeren in de restkern en in de DNA-halo te tellen. BrdU of pKi67 maakte differentiatie van prolifererende (BrdU/piK67+) en senescente/rustige (BrdU/pKi67-) kernen mogelijk. Gegevens kunnen worden weergegeven in staafdiagrammen met foutbalken die overeenkomen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Gebruik de t-test van de student (ongepaard) om de resultaten statistisch te vergelijken met p> 0,05 die als significant wordt beschouwd.
Representative Results
Deze methode van DNA-halovoorbereiding heeft ons geholpen bij onze inspanningen om verschillen in genoomgedrag te bepalen in jonge en oude cellen, maar ook in cellen die zijn afgeleid van vroegtijdige verouderingsziekten met afwijkende nucleoskeletale eiwitten15. Figuur 1 toont voorbeelden van DNA-halo’s waarbij het mogelijk is om de rand van een restkern te zien, het DNA dat in de restkern achterblijft en het niet-vastgemaakte DNA dat in de omgeving is uitgespoeld, waardoor een DNA-halo ontstaat. Het toont ook de analyse die laat zien hoe de restkern wordt verkregen en de NE- en CTE-metingen. Het is mogelijk om onderscheid te maken tussen prolifererende en niet-prolifererende cellen door ofwel een gelabeld nucleotide zoals BrdU op te nemen wanneer cellen zich in de S-fase bevinden of door gebruik te maken van de diagnostische proliferatiemarker anti-pKi67, die nucleoli onthult, en regio’s van heterochromatine in G1-cellen17,18. Primaire cellen die in hoog serum worden gekweekt zonder confluentie te bereiken, die negatief zijn voor de proliferatiemarkers, worden verondersteld senescent te zijn. Primaire cellen die in een laag serum zijn gekweekt of confluent zijn geworden, d.w.z. contactremmend die negatief zijn voor de proliferatiemarkers, worden als rustig beschouwd en zouden in staat zijn om de proliferatieve celcyclus opnieuw in te voeren gezien de juiste voedingsstoffen en situatie. Het kunnen onderscheiden van Ki67 positieve en negatieve cellen heeft ons in staat gesteld om verschillen te bepalen tussen prolifererende, rustige en senescente menselijke dermale fibroblasten. Figuur 2 toont DNA-halo’s van prolifererende menselijke dermale fibroblasten gemaakt van cellen waar BrdU in is opgenomen tijdens DNA-replicatie, een mechanisme dat niet voorkomt in niet-prolifererende cellen, en vervolgens gekleurd met anti-BrdU-antilichaam. Kleuring met de proliferatieve marker anti-pKi67 antilichaam is ook zichtbaar in figuur 2. Dit is een robuust antigeen en overleeft het FISH-protocol en kan dus worden gekleurd voor post-FISH en voormontage. Prolifererende cellen zijn dus positief (rood) voor BrdU en anti-pKi67 (rood) in de linkerkolom en niet-prolifererende cellen, inderdaad senescente cellen in figuur 2, worden weergegeven in de rechterkolom. De groene signalen zijn individuele telomeren die worden onthuld met een telomeer-PNA FISH / FITC-kit. Het combineren van immunofluorescentie met DNA-halo’s maakt analyse tijdens verschillende celtoestanden mogelijk, zoals weergegeven in figuur 2 bij het onderzoeken van prolifererende, rustige en senescente cellen. Afhankelijk van het gekozen antilichaam kunnen andere aandoeningen worden onderzocht, zoals differentiatie, DNA-schade via bestraling etc. Chromosoomgebieden kunnen ook worden gevisualiseerd in DNA-halo’s met behulp van FISH. Vanwege de voorbereiding die het mogelijk maakt om DNA uit de kernen te spoelen, kan de vorm van het chromosoomgebied worden verstoord, met kleinere of grotere hoeveelheden van het chromosoom in de DNA-halo, afhankelijk van de verankering van het genoom in de resterende kern en zijn structuren. Figuur 3 toont een panel van DNA-halo’s waarbij individuele chromosomen zijn onthuld met specifieke chromosoom-schildersondes (rood) voor chromosomen 1, 13, 17 en 18. Anti-pKi67 (groen) is gebruikt om prolifererende cellen en de afwezigheid ervan binnen dezelfde cultuur te markeren, op dezelfde dia, wat senescente cellen aanduidt. Het is heel duidelijk uit de afbeeldingen en de gegevens gepresenteerd als CTE / NE dat het kleine genarme chromosoom 18 een chromosoom is dat weinig aanhechtingen heeft en verder naar buiten spoelt in de DNA-halo, weg van de resterende kernen en aanzienlijk verder van het centrum van de resterende kernen ligt dan de andere chromosomen. Dit geldt echter ook voor chromosoom 1. Met behulp van de proliferatieve marker anti-pKi67 is het ook mogelijk geweest om proliferatie te vergelijken met senescente cellen, binnen dezelfde cultuur en op dezelfde dia, en deze analyse heeft aangetoond dat chromosomen binnen deze twee zeer verschillende celstatussen niet significant van elkaar verschillen, met betrekking tot hechting aan de resterende nucleaire structuren. Interessant is dat genen ook statistisch significante verschillen vertonen tussen prolifererende en senescente cellen met betrekking tot het blijven in een restkern of zich in de DNA-halo bevinden. Figuur 4 laat dit zien met genloci afgebakend door gelabelde BAC-sondes in rood en anti-Ki67 in groen. Er zijn geen significante verschillen tussen genlocaties in de prolifererende versus de senescente cellen, na een DNA Halo-preparaat. Er zijn echter significant meer catenine alfa 1 CTNNA1 loci in de DNA halo dan cycline D1 CNDD1 loci, waar er zeer weinig zijn. Figuur 5 toont DNA-halopreparaten met telomeren in het groen. De achtergrond wordt opzettelijk hoog gelaten om telomeersignalen in de DNA-halo te kunnen visualiseren. In deze set van gegevens zijn rustige cellen, d.w.z. cellen die 7 dagen lang serumhonger hebben gehad, opgenomen en interessant genoeg zijn er aanzienlijk meer telomeren losgemaakt en gelegen in de DNA-halo’s in rustige cellen dan voor prolifererende en senescente cellen. In figuur 5a is het aandeel telomeren in de DNA-halo te zien, met name voor de afbeelding ‘Experiment 2’. Dit komt overeen met figuur 5b waar het gemiddelde percentage telomeren in DNA-halo ongeveer 17% is in rustige cellen. Er zijn aanwijzingen dat niet alle telomeren in senescente cellen kunnen worden gezien, omdat sommige misschien erg kort zijn. Deze methode van DNA-halo is succesvol geweest voor ons om genoominteractieveranderingen binnen kernen in zieke cellen te onderzoeken15. Figuur 6 toont verschillen in chromosoomaanhechting in primaire controlefibroblasten en in zieke cellen met typische (lamin A-mutatie) en atypische Hutchinson-Gilford Progeria-syndroom, waarbij een andere SUN1-isovorm en geen lamin A-mutatie tot expressie komt19. Chromosomen 1 en 13 vertonen statistisch significante verschillen in hun aanhechting binnen de restkernen in vergelijking met controle-DNA-halo’s. Figuur 6b correleert de positie van het hele chromosoomgebied met de restkern en DNA Halo. Waarden van 1 of minder geven aan dat het chromosoom zich binnen de restkern bevindt en waarden boven 1 tonen chromosomen of delen van chromosomen binnen de DNA-halo. Over het algemeen benadrukt dit het nut van HALO-FISH bij het onderzoeken van genomische interacties van hele chromosomen, specifieke genen en telomeren onder verschillende omstandigheden die de celcyclus beïnvloeden (proliferatie, rust en senescentie) of in ziektecellen, bijvoorbeeld progeria en kankercellijnen. Inderdaad, de verschillen in interacties tussen deze toestanden impliceert dat het nucleoskeleton een belangrijke rol speelt bij het reguleren van belangrijke processen binnen de kern. Figuur 1: HDF geëxtraheerde kern met de resterende kern en DNA-halo en overzicht van de analysemethode. a) Een HDF-kern bereid via DNA-halo-assay en tegengekleurd met DAPI. De felgekleurde restkern toont DNA verankerd aan het nucleoskeleton en dit is omgeven door het niet-gehechte DNA dat een halo van DNA vormt. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Het blauwe kanaal vangt de met DAPI gekleurde kern en het omringende DNA op. De restkern wordt geselecteerd en verwijderd met ImageJ. De pijl geeft de afstand weer van het kerncentrum tot de resterende nucleaire rand (NE). c) Het rode kanaal toont het sondesignaal. d) De afbeelding met de aanduiding “Resultaat” is het resultaat van het over elkaar leggen van het rode kanaal op het blauwe kanaalbeeld; dit maakt de afstand van het nucleaire centrum tot de verste chromosoomterritoriumrand (CTE) mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: DNA-halopreparaat met telomeer PNA FISH op prolifererende en senescente HDF’s. Telomere PNA FISH op HDF’s onderworpen aan DNA-halo-assay. Telomeersignalen worden gevisualiseerd in groen (FITC), rest- en halo-DNA werd tegengekleurd met behulp van DAPI (blauw) en prolifererende kernen werden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU- of anti-pKi67-antilichamen via indirecte immunofluorescentie in rood (TRITC). Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Nucleoskeleton-chromosoom interacties en analyse met behulp van DNA halo assay. a) 2D-FISH met sondes specifiek voor chromosomen 1, 13, 15, 17 en 18 werd uitgevoerd op HDF’s die werden onderworpen aan DNA-halopreparatie. Hele chromosomen werden rood geschilderd (Cy3) en kernen werden onderzocht met pKi67 om te bepalen of ze prolifereerden of senescent. Prolifererende cellen (pKi67+) werden in het groen afgebakend (FITC), terwijl senescente cellen onbevlekt bleven (pKi67-) d.w.z. geen groen signaal gedetecteerd. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Chromosoomverankering door het nucleoskelet in prolifererende en senescente HDF’s die HALO-FISH hadden ondergaan. Metingen tonen de verhouding van de verste chromosoomterritoriumrand (CTE) tot de respectievelijke nucleaire rand (NE) voor chromosomen 1, 13, 15, 17 en 18 in prolifererende (pKi67+) en senescente (pKi67-) cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. (c) Gewijzigde box plot representatie van chromosoom territoriumrand (CTE) tot respectievelijke nucleaire rand (NE) van specifieke chromosomen in pKi67+ en pKi67-kernen. Q1 = lager kwartiel; Min = laagste geregistreerde waarde; Med = mediaan; Max = maximaal geregistreerde waarde; Q3 = bovenste kwartiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Genspecifieke interacties in HDF’s met behulp van HALO-FISH. (a) DNA halo geëxtraheerde kernen werden onderzocht met genspecifieke sondes (CCND1 en CTNNA1) om hun verankering aan de NM op prolifererende en senescente cellen te onderzoeken. De gensignalen worden weergegeven in rood (Cy3) en anti-pKi67 toont prolifererende cellen en het signaal wordt gevisualiseerd in groen (FITC). Voor de prolifererende CCND1-afbeelding is de resterende kern ingesloten in de witte cirkel en de ruimte tussen de witte en groene cirkel toont de DNA-halo. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Genspecifieke signalen voor CCND1 en CTNNA1 worden vergeleken tussen de restkern en DNA-halo, en ook tussen prolifererende en senescente cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5: DNA-halotest op rustige HDF’s onderzocht met telomeer PNA-FISH. (a) Rust van HDF’s werd geïnduceerd door kweek in laag serummedium gedurende 7 dagen. De DNA-halo-assay werd uitgevoerd en PNA-FISH maakte visualisatie van telomeren mogelijk door FITC-signaal (groen) en de resterende kern en de omringende DNA-halo werd gecounterd met DAPI (blauw). Cellen werden ook gekleurd met anti-pKi67-antilichamen om ervoor te zorgen dat kernen niet-prolifereerden. Dit werd bij twee verschillende gelegenheden herhaald. Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) Vergelijking van het gemiddelde percentage telomeren gelokaliseerd in de DNA-halo in prolifererende, senescente en rustige HDF-cellen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: Onderzoek van de verankering van het hele chromosoom naar het nucleoskelet in HGPS-cellen met behulp van HALO-FISH26. (a) Controle HDF (2DD), klassieke HGPS (AG06297) en atypische type 2 HGPS (AG08466) kernen ondergingen DNA-halovoorbereiding en vervolgens 2D-FISH met behulp van hele chromosoomverven voor chromosoom 1, 13, 15 en 17. Hele chromosomen zijn in het groen afgebeeld (FITC) en DNA werd tegengekleurd met DAPI (blauw). Vergroting = x 100; schaalbalk 10 μm. (b) De positionering van chromosomen in geëxtraheerde kernen werd bepaald door de verhouding van de gemiddelde chromosoomterritoriumrand (CTE) tot de nucleaire rand (NE) te meten. Een verhouding boven 1 toont aan dat de verste CTE buiten het corresponderende NE binnen de DNA-halo ligt, terwijl een verhouding onder 1 betekent dat de verste CTE binnen het NE binnen de restkern ligt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Kiezers Volume (μL) 5XDOP-PCRbuffer 10 dNTPmix (zonderTTP) (2mM) 5 dTTP (2mM) 2 Biotine-16-dUTPorDigoxigenine-11-dUTP 10 DOPprimer (20μM) 5 TaqDNAPolymerase(1U/μL) 1 PCRgradewater 12 Sjabloon 5 Tabel 1: Tabel met de DOP-PCR componenten en volumes voor een 1x reactie Stap Cycli Temp (graad Celsius) Tijd Initiële denaturatie 1 95 3 min Denaturatie 34 98 20 s Primer gloeien 62 1 min Extensie 72 30 s Definitieve uitbreiding 1 72 5 min Verkoeling 4 Houden Tabel 2: Tabel met de DOP-PCR-cyclus, temperatuur en tijdprofiel. Bestanddeel Volume (μL) 10x NT buffer (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA) 5 0,1 M bèta-mercaptoethanol 5 10X Nucleotide voorraad (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotine-16-dUTP) 5 Dnase I (1 ng/ml) 2 DNApolymerase I 5U per μg DNA DNAtemplate (1 μg) 1 DEPC-behandeld water Tot 50 μL Tabel 3: Tabel met de nick translatiecomponenten en volumes voor een enkele sonde.
Discussion
De DNA-halo-methode is een uitstekende methode bij het analyseren van interacties tussen het nucleoskelet en het genoom, maar er zijn ook enkele kritieke stappen die moeten worden gevolgd. Een van de belangrijkste parameters is de optimalisatie van de celzaaidichtheid. Als cellen overconfluent worden, zullen de DNA-halo’s overlappen met naburige cellen, waardoor het onmogelijk wordt om de analyse uit te voeren. De CSK- en extractiebuffers moeten altijd vers worden gemaakt op de dag van gebruik, waarbij spermine, spermidine en digitonine aan het einde van het bereidingsproces aan de extractiebuffer worden toegevoegd om hun biologische activiteit te behouden. Bij het uitvoeren van Halo-FISH is het uiterst belangrijk om de juiste denaturatietemperatuur van de DNA-halo’s te gebruiken om de sonde of verf vervolgens te laten hybridiseren.
Elektronenmicroscopie is gebruikt om de nucleaire matrix te visualiseren, waarbij filamenteuze structuren worden geïdentificeerd20. Elektronenmicroscopie is echter beperkt omdat matrixassociaties met chromatine niet gemakkelijk kunnen worden afgeleid. Inderdaad, de DNA Halo-methode is veelzijdiger in vergelijking met elektronenmicroscopie, omdat specifieke genen, chromosomen en celtoestanden allemaal kunnen worden onderzocht. Verder wordt proteomische analyse van nucleaire matrixeiwitten bestudeerd21,22. Deze methode is goed voor het vergelijken van nucleaire matrixcomponenten, vooral bij het vergelijken van zieke cellen, maar het biedt niet de ruimtelijke verdeling en bijlagen die worden gemarkeerd door de standaard DNA Halo-techniek.
DNA Halo-testen hebben beperkingen. Ten eerste, omdat de matrix wordt geëxtraheerd, kan dit alleen worden uitgevoerd op vaste cellen, dus live beeldvorming is niet mogelijk. Hoewel de DNA Halo-methode relatief snel en gemakkelijk uit te voeren is, kan het algehele proces tijdrovend zijn wanneer celkweek, sondegeneratie, Halo-FISH en analyse allemaal in aanmerking worden genomen.
Beeldopname van DNA Halo’s en HALO-FISH met behulp van superresolutiemicroscopie zou de resolutie van DNA-specifieke sondes en antilichamen aanzienlijk verbeteren. Omdat fluorochromen gemakkelijker spectraal kunnen worden opgelost, kan het bovendien mogelijk zijn om een aantal DNA-sondes in één experiment te gebruiken, wat nog meer informatie oplevert. Verbeteringen in moleculair biologische technieken zoals chromosoomconformatievangst (3C) zijn gebruikt om interacties van genloci te bepalen en de ruimtelijke organisatie op chromatine in de cel te analyseren. DNA Halo-assays en 3C kunnen worden gecombineerd, een term die bekend staat als M3C23, wat opnieuw het aanpassingsvermogen van de DNA Halo-techniek aantoont.
De oorspronkelijke gegevens die hier worden gepresenteerd, zijn bedoeld om de mogelijkheden voor genoomgedragsondervraging aan te tonen en hoe die gegevens moeten worden gepresenteerd. Met deze gegevens hebben we aangetoond dat het mogelijk is om significante verschillen in genoomaanhechtheid te bepalen met behulp van (1) chromosoomschildersondes, in deze studie blijkt dat chromosoom 18 het minst gehechte chromosoom is van de geanalyseerde (figuur 3); (2) Genloci met significante verschillen tussen twee genloci en (figuur 4) (3) telomeren, die minder sterk gehecht zijn in rustige cellen in vergelijking met prolifererende en senescente cellen (figuur 5). We zijn in staat om onderscheid te maken tussen prolifererende en niet-prolifererende cellen via de aanwezigheid van de proliferatiemarker Ki67-antigeen, een onoplosbaar eiwit dat dus bij de resterende kernen blijft, of met behulp van de opname van nucleotiden om cellen te markeren die binnen een bepaalde periode de S-fase hebben doorlopen (figuur 2). Deze techniek heeft ons ook in staat gesteld om genoomgedrag te analyseren in cellen die zijn aangetast in hun nucleoskeletten, d.w.z. laminopathiecellen en hier en in Bikkul et al., 2018 onthullen we dat het genoom minder strak kan worden bevestigd in vergelijking met controlecellen en kan worden hersteld bij behandeling met specifieke geneesmiddelen die het effect van de lamin A-mutatie in klassieke HGPS-cellen verbeteren15. We tonen hier echter nieuwe gegevens voor de atypische HGPS AGO8466-cellen, die geen lamin A-mutatie hebben, maar een ongebruikelijke vorm van het LINC-complexeiwit SUN1 19 bevatten waar chromosoom13 minder strak in vastzit (figuur 6).
HALO-FISH is een unieke methode die de studie van genomische interacties met het nucleoskeleton in combinatie met indirecte immunofluorescentie mogelijk maakt om eiwitten op te lossen die niet uit de extractieprocedure zijn verwijderd. Het is aangetoond dat het nucleoskelet is gemodificeerd bij verschillende ziekten zoals bepaalde kankertypes19 en het belang van sommige nucleoskeleton-geassocieerde eiwitten als diagnostische biomarkers24,25. Deze techniek speelt dus een belangrijke rol bij het onderzoeken van het effect van het nucleoskeleton op chromatine-organisatie/-desorganisatie bij ziekte 15,24,25,27 en is niet beperkt tot menselijke cellen, met chromosomale schildersondes van andere dieren zou hetzelfde DNA-haloprotocol kunnen worden gebruikt 28.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen prof. Michael Bittner bedanken voor het vriendelijke geschenk van chromosoomarmschildersondes. LG werd ondersteund door het door de EU gefinancierde EURO-Laminopathieën-project en het Brunel Progeria Research Fund.
Materials
| 10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
| 5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
| Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
| Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
| Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
| Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
| Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
| Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
| Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
| DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
| Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
| Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
| Ethanol | Component of extraction buffer | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
| Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
| Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
| HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
| Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
| KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
| Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
| Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
| Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
| Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
| Nick translation kit | Invitrogen | ||
| PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
| PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
| Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
| QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
| Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
| Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
| Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
| Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
| Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
| SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
| Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
| TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
| Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
| Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |
References
- Berezney, R., Coffey, D. S. Identification of a nuclear protein matrix. Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).
- Haaf, T., Ward, D. C. High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes. Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).
- Parra, I., Windle, B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization. Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).
- Senger, G., et al. Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization. Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).
- Florijn, R. J., et al. High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes. Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).
- Elcock, L. S., Bridger, J. M. Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres. Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).
- Heiskanen, M., et al. Visual mapping by fiber-FISH. Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).
- Bensimon, A., et al. Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface. Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).
- Michalet, X., et al. Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies. Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).
- Wilson, R. H., Coverley, D. Relationship between DNA replication and the nuclear matrix. Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).
- Wilson, R. H. C., Coverley, D. Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos. Science Reports. 7 (1), 6475 (2017).
- Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).
- Tandara, M., et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).
- Repping, S., et al. The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number. Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).
- Bikkul, M. U., et al. Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts. Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).
- Telenius, H., et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).
- Bridger, J. M., et al. Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells. Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).
- Sales Gil, R., Vagnarelli, P. Ki-67: More Hidden behind a ‘Classic Proliferation Marker’. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).
- Bikkul, M. U., et al. Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform. Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).
- Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat. EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).
- Albrethsen, J., et al. Unravelling the nuclear matrix proteome. Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).
- Mika, S., Rost, B. NMPdb: Database of nuclear matrix proteins. Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).
- Gavrilov, A. A., et al. of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).
- Sjakste, N., et al. Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis. Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).
- Leman, E. S., Getzenberg, R. H. Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).
- Volpi, E. V., Bridger, J. M. FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique. Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).
- Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. Human Interphase Chromosomes. , (2021).
- Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues. BMC Cell Biology. 13 (1), 30 (2012).
Cite This Article
Godwin, L. S., Roberts, E., Bridger, J. M., Foster, H. A. Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci. J. Vis. Exp. (169), e62017, doi:10.3791/62017 (2021).