תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש
Summary
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.
Abstract
עוברי חוליות מעצבים את ציר הגוף העיקרי שלהם כסומיטים שחוזרים על עצמם, מבשרי החוליות, השרירים והעור. Somites בהדרגה קטע מן mesoderm presomitic (PSM) כמו קצה הזנב של העובר מתארך אחורית. סומיטים יוצרים עם מחזוריות רגילה וגודל קנה מידה. זברהפיש הוא אורגניזם מודל פופולרי כפי שהוא ניתן להנדס גנטית ויש לו עוברים שקופים המאפשרים הדמיה חיה. עם זאת, במהלך somitogenesis, עוברי דגים כרוכים סביב חלמון גדול, עיגול. גיאומטריה זו מגבילה הדמיה חיה של רקמת PSM בעוברים של דגי זברה, במיוחד ברזולוציות גבוהות יותר הדורשות מרחק עבודה אובייקטיבי קרוב. כאן, אנו מציגים שיטת תרבית רקמה תלת-ממדית שטוחה להדמיה חיה של תוכחות זברה- זנב. תרשימי זנב מחקים עוברים שלמים על ידי הצגת האטה פרופורציונלית של התארכות הציר וקיצור אורכי הסומיטה rostrocaudal. אנו מסוגלים עוד יותר לעכב את מהירות התארכות הציר באמצעות תרבות explant. זה, בפעם הראשונה, מאפשר לנו להתיר את הקלט הכימי של מעברי צבע איתות מן הקלט המכניסטי של התארכות צירית. במחקרים עתידיים, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם התקנה מיקרופלואידית כדי לאפשר הפרעות תרופות מבוקרות זמן או הקרנה של פילוח בעלי חוליות ללא כל חששות חדירה לתרופות.
Introduction
פילוח מטמרי של אורגניזמים נמצא בשימוש נרחב בטבע. מבנים חוזרים ונשנים חיוניים לפונקציונליות של איברים לרוחב כגון חוליות, שרירים, עצבים, כלי דם, גפיים או עלים בתוכנית גוף1. כתוצאה מאילוצים פיזיולוגיים וגיאומטריים כאלה של הסימטריה הצירית, רוב הפילה של בילטריה – כגון אנלדים, פרוקי רגליים ואקורדטים – מציגים פילוח של הרקמות העובריות שלהם (למשל, אקטודרם, מזודרם) באופן אנטרו-אחורי.
עוברי חוליות מחלקים ברצף את מזודרם הפרקסיאלי שלהם לאורך ציר הגוף הראשי לסומיטים עם מרווחים, ספירות והתפלגויות גודל ספציפיים למינים. למרות החוסן הזה בקרב עוברים בודדים בתוך מין מסוים, פילוח סומיטי הוא רב-תכליתי בין מינים של בעלי חוליות. פילוח קורה במשטר עצום של מרווחי זמן (מ 25 דקות ב zebrafish כדי 5 שעות בבני אדם), גדלים (מ ~ 20 מיקרומטר בסומיטות זנב של זברה כדי ~ 200 מיקרומטר בסומיטים גזע של עכברים) וסופר (מ 32 ב zebrafish כדי ~ 300 ב נחשי תירס)2. באופן מעניין יותר, עוברי דגים יכולים להתפתח במגוון רחב של טמפרטורות (מ ~ 20 °C (עד 34 °C (70 °F) עבור דגי זברה) תוך שמירה על somites שלהם ללא פגע עם התפלגות גודל נאותה על ידי פיצוי הן מרווחי פילוח ומהירויות התארכות צירית. מעבר לתכונות מעניינות כאלה, זברה-פיש נשאר כאורגניזם מודל שימושי לחקר פילוח בחולייתנים בשל ההתפתחות החיצונית, הסינכרונית והשקופה של בשפע של עוברים אחים כמו גם הכלים הגנטיים הנגישים שלהם. מנקודת מבט מיקרוסקופית, עוברים טלוסטים מתפתחים על חלמון כדורי מגושם, מותחים ומעגלים את רקמת הגז סביבו (איור 1A). במאמר זה, אנו מציגים תרבות שטוחה 3-D רקמה explant עבור זנבות זברה. מערכת הסבר זו עוקפת את האילוצים הכדוריים של מסת החלמון, ומאפשרת גישה להדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של עוברי דגים לדוגמת דומיטי.
איור 1: מערכת Explant קאמרית שקופית לעוברים של דגי זברה. (A) לעוברים של דגי זברה יש יתרונות להדמיה חיה, כגון שקיפות של רקמה עוברית מתכלה (כחולה), אך הרקמה נוצרת סביב מסת חלמון כדורית (צהובה) מגושמת המונעת הדמיה כמעט אובייקטיבית ברזולוציה גבוהה בעוברים שלמים. ניתן לנתח את פתיתי הזנב החל מסכין מיקרוכירורגית (חומה) שנחתכה מהרקמה של סומיטס (אדום) וממשיכה בגבול עם החלמון האחורי. (B)פירורי זנב מנותח ניתן להניח על כיסוי (כחול בהיר) dorsoventrally; שמירה על רקמה עצבית (אפור בהיר) מלמעלה ונונוצ’ורד (אפור כהה) בתחתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של טכניקת explant תרבות רקמה שפיתחנו והשתמשנו לאחרונה5 עבור עוברי זברה. הטכניקה שלנו מתבססת על שיטות ההסבר הקודמות בחומוס8 ובזברפיש9,10,11 אורגניזמים מודל. גישושים זנב מוכן עם פרוטוקול זה י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן הליבה של AECOM Zebrafish ולשירותים הווטרינריים לילדים בסינסינטי על תחזוקת הדגים, ליבת ההדמיה לילדים בסינסינטי על הסיוע הטכני, דידר ספירוב על הסיוע בהפקת וידאו וחנה סיוול על עריכת כתב היד. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R35GM140805 כדי E.M.Ö. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. . Growth in length: Embryological Essays. , (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
