ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي
Summary
هنا، نقدم بروتوكول زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد لمحور الجسم الخلفي لسمك الحمار الوحشي، مما يتيح الدراسة الحية للتجزئة الفقارية. يوفر هذا النموذج explant السيطرة على استطالة المحور، وتغيير مصادر مورفوجين، والتصوير الحي على مستوى الأنسجة دون الخلوية.
Abstract
الأجنة الفقارية نمط محور الجسم الرئيسي كما السخام المتكررة، والسلائف من الفقرات والعضلات والجلد. Somites الجزء تدريجيا من mesoderm presomitic (PSM) كما نهاية ذيل الجنين elongates الخلفي. سوميتس شكل مع دورية منتظمة وحجم في الحجم. حمار وحشي هو كائن نموذجي شعبية كما هو قابل للسحب وراثيا والأجنة الشفافة التي تسمح للتصوير الحي. ومع ذلك ، خلال تكوين السميتوجين ، يتم لف أجنة الأسماك حول صفار كبير مستدير. تحد هذه الهندسة من التصوير الحي لأنسجة PSM في أجنة سمك الحمار الوحشي ، خاصة في القرارات الأعلى التي تتطلب مسافة عمل موضوعية وثيقة. هنا ، نقدم طريقة زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد المسطحة للتصوير الحي لمخلفات ذيل الحمار الوحشي. تحاكي النباتات الخلفية الأجنة السليمة من خلال عرض تباطؤ نسبي في استطالة المحور وتقصير أطوال السوسميت الوردية. نحن قادرون على المماطلة سرعة استطالة محور من خلال ثقافة explant. وهذا، للمرة الأولى، يمكننا من فك المدخلات الكيميائية لتدرجات الإشارات من الإدخال الآلي للاستطالة المحورية. في الدراسات المستقبلية ، يمكن الجمع بين هذه الطريقة مع إعداد microfluidic للسماح بالاضطرابات الصيدلانية التي يتم التحكم فيها زمنيا أو فحص تجزئة الفقاريات دون أي مخاوف من اختراق الأدوية.
Introduction
يستخدم التقسيم الميتاميري للكائنات الحية على نطاق واسع في الطبيعة. الهياكل المتكررة ضرورية لوظائف الأعضاء الجانبية مثل الفقرات والعضلات والأعصاب والأوعية والأطراف أو الأوراق في خطة الجسم1. نتيجة لمثل هذه القيود الفسيولوجية والهندسية للتماثل المحوري ، فإن معظم فيلا بيلاتيريا – مثل الأنليدس والمفصليات وتجزئة عرض chordates من أنسجة الجنين (على سبيل المثال ، ectoderm ، mesoderm) antero-posteriorly.
تجزئ الأجنة الفقارية بشكل متسلسل مؤشر منتصف العمر المحوري على طول محور الجسم الرئيسي إلى زحمات مع فترات محددة للأنواع والأعداد وتوزيعات الحجم. على الرغم من هذه المتانة بين الأجنة الفردية داخل الأنواع ، فإن تجزئة السوسميت متعددة الاستخدامات بين الأنواع الفقارية. يحدث التقسيم في نظام واسع من الفواصل الزمنية (من 25 دقيقة في حمار وحشي إلى 5 ساعة في البشر) ، والأحجام (من ~ 20 ميكرومتر في ذيل somites من حمار وحشي إلى ~ 200 ميكرومتر في سومتس الجذع من الفئران) والتعول (من 32 في حمار وحشي إلى ~ 300 في ثعابين الذرة)2. والأكثر إثارة للاهتمام أن أجنة الأسماك يمكن أن تتطور في مجموعة واسعة من درجات الحرارة (من ~20.5 درجة مئوية إلى 34 درجة مئوية لسمك الحمار الوحشي) مع الحفاظ على السخامات سليمة مع توزيعات الحجم المناسبة من خلال التعويض عن كل من فترات التقسيم وسرعات الاستطالة المحورية. وإلى جانب هذه السمات المثيرة للاهتمام، يبقى سمك الحمار الوحشي ككائن حي نموذجي مفيد لدراسة التقسيم في الفقاريات بسبب التطور الخارجي المتزامن والشفاف لكثرة الأجنة الشقيقة وكذلك أدواتها الوراثية التي يمكن الوصول إليها. من منظور المجهر ، تتطور أجنة teleost على صفار كروي ضخم ، وتمتد وتتقريب الأنسجة الغازية حوله(الشكل 1A). في هذه المقالة، نقدم ثقافة explant الأنسجة ثلاثية الأبعاد بالارض لذيول حمار وحشي. هذا النظام explant يتحايل على القيود الكروية من كتلة صفار، مما يسمح بالوصول إلى التصوير الحي عالية الدقة من أجنة الأسماك لأنماط السوسميت.
الشكل 1:نظام Explant غرفة الشريحة لأجنة حمار وحشي. (أ) أجنة حمار وحشي لها مزايا للتصوير الحي، مثل شفافية الأنسجة الجنينية الغازية (الأزرق)، ولكن الأنسجة تتشكل حول كتلة صفار كروية ضخمة (صفراء) تمنع التصوير شبه الموضوعي وعالي الدقة في الأجنة السليمة. يمكن تشريح النباتات السابقة الذيل بدءا من سكين المجهرية (البني) قطع من الأنسجة الأمامية من السخام (الأحمر) والاستمرار على الحدود مع صفار الخلفي. (ب)يمكن وضع البهلوات الذيل تشريح على غطاء (الأزرق الفاتح) dorsoventrally; الحفاظ على الأنسجة العصبية (رمادي فاتح) على أعلى وnochord (رمادي داكن) في الجزء السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتقنية زراعة الأنسجة التي طورناها واستخدمناها مؤخرا5 لأجنة حمار وحشي. تقنيتنا يبني على أساليب explant السابقة في الفرخ8 وسمك الحمار الوحشي9،10،11 نموذج الكائنات الحية. يمكن explants الذي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق AECOM Zebrafish Core والخدمات البيطرية للأطفال في سينسيناتي على صيانة الأسماك ، وجوهر تصوير الأطفال في سينسيناتي للمساعدة التقنية ، وديدار ساباروف للمساعدة في إنتاج الفيديو وهانا سيوال لتحرير المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM140805 إلى E.M.Ö. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. . Growth in length: Embryological Essays. , (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
