Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra
Summary
Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell’asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull’allungamento dell’asse, l’alterazione delle sorgenti di morfogeno e l’imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.
Abstract
Gli embrioni di vertebrati modellano il loro asse corporeo principale come somiti ripetitivi, precursori di vertebre, muscoli e pelle. I somiti si segmentano progressivamente dal mesoderma presomitico (PSM) mentre l’estremità posteriore dell’embrione si allunga posteriormente. I somiti si formano con periodicità regolare e dimensioni di scala. Zebrafish è un organismo modello popolare in quanto è geneticamente trattabile e ha embrioni trasparenti che consentono l’imaging dal vivo. Tuttavia, durante la somitogenesi, gli embrioni di pesce sono avvolti attorno a un grande tuorlo rotondo. Questa geometria limita l’imaging vivo del tessuto PSM negli embrioni di zebrafish, in particolare a risoluzioni più elevate che richiedono una distanza di lavoro oggettiva ravvicinata. Qui presentiamo un metodo di coltura tissutale 3D appiattito per l’imaging vivo delle espianto della coda di zebrafish. Gli espianto della coda imitano embrioni intatti mostrando un rallentamento proporzionale dell’allungamento dell’asse e accorciamento delle lunghezze del somite rostrocaudale. Siamo inoltre in grado di bloccare la velocità di allungamento dell’asse attraverso la coltura di espianto. Questo, per la prima volta, ci permette di districare l’ingresso chimico dei gradienti di segnalazione dall’ingresso meccanicistico dell’allungamento assiale. Negli studi futuri, questo metodo può essere combinato con una configurazione microfluidico per consentire perturbazioni farmaceutiche controllate nel tempo o screening della segmentazione dei vertebrati senza problemi di penetrazione del farmaco.
Introduction
La segmentazione metamerica degli organismi è ampiamente utilizzata in natura. Le strutture ripetute sono essenziali per la funzionalità di organi laterale come vertebre, muscoli, nervi, vasi, arti o foglie in un piano corporeo1. Come risultato di tali vincoli fisiologici e geometrici della simmetria assiale, la maggior parte della phyla della Bilateria- come anellidi, artropodi e cordati-mostrano segmentazione dei loro tessuti embrionali (ad esempio, ectoderma, mesoderma) antero-posteriormente.
Gli embrioni di vertebrati segmentano sequenzialmente il loro mesoderma parassiale lungo l’asse corporeo principale in somiti con intervalli specifici per specie, conteggi e distribuzioni delle dimensioni. Nonostante tale robustezza tra i singoli embrioni all’interno di una specie, la segmentazione del somite è versatile tra le specie di vertebrati. La segmentazione avviene in un vasto regime di intervalli di tempo (da 25 minuti in zebrafish a 5 h nell’uomo), dimensioni (da ~ 20 μm in somiti di coda di zebrafish a ~ 200 μm in somiti tronco di topi) e conti (da 32 in zebrafish a ~ 300 nei serpenti di mais)2. Ancora più interessante, gli embrioni di pesce possono svilupparsi in una vasta gamma di temperature (da ~ 20,5 ° C fino a 34 ° C per il pesce zebra) mantenendo intatti i loro somiti con una corretta distribuzione delle dimensioni compensando sia gli intervalli di segmentazione che le velocità di allungamento assiale. Al di là di tali caratteristiche interessanti, zebrafish rimane un organismo modello utile per studiare la segmentazione nei vertebrati a causa dello sviluppo esterno, sincrono e trasparente di una plenitudine di embrioni fratelli e dei loro strumenti genetici accessibili. Negativamente dal punto di vista della microscopia, gli embrioni di teleost si sviluppano su un ingombrante tuorlo sferico, allungando e arrotondando il tessuto gastrulante intorno ad esso (Figura 1A). In questo articolo, presentiamo una coltura appiattita di espianto di tessuti 3D per le code di zebrafish. Questo sistema di espianto aggira i vincoli sferici della massa del tuorlo, consentendo l’accesso all’imaging vivo ad alta risoluzione di embrioni di pesce per il modello somite.
Figura 1: Sistema di espianto a camera di scorrimento per embrioni zebrafish. (A) Gli embrioni di zebrafish hanno vantaggi per l’imaging dal vivo, come la trasparenza del tessuto embrionale gastrulante (blu), ma il tessuto si forma attorno a una massa di tuorlo sferico ingombrante (giallo) che impedisce immagini quasi oggettive e ad alta risoluzione in embrioni intatti. Le esplant di coda possono essere sezionate a partire da un coltello microchirurgico (marrone) tagliato dal tessuto anteriore dei somiti (rosso) e continuando al confine con il tuorlo posteriormente. (B) Le espianto di coda sezionate possono essere posizionate su un dorsoventrally coverslip (azzurro); mantenendo il tessuto neurale (grigio chiaro) in cima e notocordo (grigio scuro) nella parte inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di una tecnica di espianto di coltura tissutale che abbiamo sviluppato eutilizzato di recente 5 per gli embrioni di zebrafish. La nostra tecnica si basa sui precedenti metodi di espianto negliorganismi modello chick 8 e zebrafish9,10,11. Le esplant di coda preparate con questo protocollo possono sopravvivere fino a >12 ore in una s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’AECOM Zebrafish Core Facility e cincinnati Children’s Veterinary Services per la manutenzione del pesce, il Cincinnati Children’s Imaging Core per l’assistenza tecnica, Didar Saparov per l’assistenza nella produzione video e Hannah Seawall per la modifica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di premio R35GM140805 a E.M.Ö. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Materials
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
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