Культура эксплантата 3-D хвоста для изучения сегментации позвоночных у рыбок данио
Summary
Здесь мы представляем протокол для 3-D культуры тканей задней оси тела рыбок данио, позволяющий изучать сегментацию позвоночных в реальном времени. Эта эксплантная модель обеспечивает контроль над удлинением оси, изменением источников морфогенов и субклеточным разрешением на тканевую визуализацию на уровне живую.
Abstract
Эмбрионы позвоночных моделируют свою основную ось тела как повторяющиеся сомиты, предшественники позвонков, мышц и кожи. Сомит прогрессивно отрезок от пресомитической мезодермы (PSM), поскольку хвостовой конец эмбриона удлиняется к заднему лонгу. Сомиты формируются с регулярной периодичностью и масштабом в размерах. Рыбка данио является популярным модельным организмом, поскольку она генетически податлива и имеет прозрачные эмбрионы, которые позволяют проводить живую визуализацию. Тем не менее, во время сомитогенеза эмбрионы рыбы оборачиваются вокруг большого, округлого желтка. Эта геометрия ограничивает живую визуализацию ткани PSM у эмбрионов рыбок данио, особенно при более высоких разрешениях, которые требуют близкого объективного рабочего расстояния. Здесь мы представляем метод сплющенной 3-D культуры тканей для живой визуализации эксплантов хвоста рыбки данио. Хвостовые экспланты имитируют интактные эмбрионы, демонстрируя пропорциональное замедление удлинения оси и укорочение ростроковых длин сомита. Кроме того, мы можем остановить скорость удлинения оси благодаря культуре эксплантата. Это впервые позволяет нам распутать химический вход сигнальных градиентов от механистического входа осевого удлинения. В будущих исследованиях этот метод может быть объединен с микрофлюидной установкой, чтобы обеспечить контролируемые по времени фармацевтические возмущения или скрининг сегментации позвоночных без каких-либо проблем с проникновением лекарств.
Introduction
Метамерная сегментация организмов широко используется в природе. Повторяющиеся структуры необходимы для функциональности боковых органов, таких как позвонки, мышцы, нервы, сосуды, конечности или листья в плане тела1. В результате таких физиологических и геометрических ограничений осевой симметрии большинство типов Bilateria, таких как кольчатые черви, членистоногие и хордовые, демонстрируют сегментацию своих эмбриональных тканей (например, эктодермы, мезодермы) с задней стороны.
Эмбрионы позвоночных последовательно сегментируют свою параксиальную мезодерму вдоль главной оси тела в сомиты с видоспецифичными интервалами, подсчетами и распределением размеров. Несмотря на такую устойчивость среди отдельных эмбрионов внутри вида, сегментация сомита универсальна между видами позвоночных. Сегментация происходит в обширном режиме временных интервалов (от 25 мин у рыбок данио до 5 ч у человека), размеров (от ~20 мкм в хвостовых сомитах рыбок данио до ~200 мкм у хоботных сомитов мышей) и подсчетов (от 32 у рыбок данио до ~300 у кукурузных змей)2. Что еще более интересно, эмбрионы рыб могут развиваться в широком диапазоне температур (от ~ 20,5 ° C до 34 ° C для рыбок данио), сохраняя при этом свои сомиты нетронутыми с правильным распределением размеров, компенсируя как интервалы сегментации, так и скорости осевого удлинения. Помимо таких интересных особенностей, рыбки данио остаются полезным модельным организмом для изучения сегментации у позвоночных из-за внешнего, синхронного и прозрачного развития обильной популяции эмбрионов братьев и сестер, а также их доступных генетических инструментов. Неблагоприятно с точки зрения микроскопии, телеостные эмбрионы развиваются на громоздком сферическом желтке, растягивая и округляя гаструлирующие ткани вокруг него(рисунок 1А). В этой статье мы представляем сплющенный 3-D тканевый эксплант культуры для хвостов рыбок данио. Эта эксплантная система обходит сферические ограничения желточной массы, позволяя получить доступ к живым изображениям эмбрионов рыб с высоким разрешением для сомит-паттерна.
Рисунок 1:Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Эмбрионы рыбок данио имеют преимущества для живой визуализации, такие как прозрачность гаструлирующей эмбриональной ткани (синий), но ткань образуется вокруг громоздкой сферической желточной массы (желтый), которая предотвращает почти объективную визуализацию с высоким разрешением у неповрежденных эмбрионов. Хвост эксплантов можно рассечь, начиная с микрохирургического ножа (коричневого), вырезанного из ткани с передней части сомитов (красного) и продолжая на границе с желтком с задней стороны. (B) Рассеченные хвостовые экспланты могут быть размещены на покровном (светло-синем) дорсовентральном; сохранение нервной ткани (светло-серого) сверху и нотохорды (темно-серого) внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол метода эксплантатов тканевых культур, который мы разработали и недавно использовали5 для эмбрионов рыбок данио. Наша методика основана на предыдущих методах эксплантата у цыплят8 и рыбок данио9,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим AECOM Zebrafish Core Facility и Cincinnati Children’s Veterinary Services за содержание рыбы, Cincinnati Children’s Imaging Core за техническую помощь, Didar Saparov за помощь в производстве видео и Hannah Seawall за редактирование рукописи. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM140805 для E.M.Ö. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | for dechorionating embryos and manipulations |
| 200 Proof Ethanol, Anhydrous | Decon Labs | 2701 | for immunostaining |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | for tissue dissection media |
| Calcium Chloride Anhydrous, Powder | Sigma-Aldrich | 499609 | for tissue dissection media |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | for immunostaining |
| Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel | Integra-Miltex | MIL4-411 | for preparing tape slide wells |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | (optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | A3160601 | additional for tissue culture media |
| Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | secondary antibody for immunostaining |
| L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red | GIBCO | 21083-027 | for tissue dissection media |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | for immunostaining |
| Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade | Surgical Specialties | 72-2863 | for tissue dissection |
| Mouse monoclonal anti-ppERK | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | for ppERK immunostaining |
| NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37106 | (optional) for live staining of cell nuclei |
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | for fixation of samples for immunostaining |
| Rat Tail Collagen Coating Solution | Sigma-Aldrich | 122-20 | (optional) for chemically activating slide chambers |
| Stage Top Incubator | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | (optional) for temperature control during live imaging |
| Transparent Tape 3/4'' | Scotch | S-9782 | for preparing tape slide wells |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | for immunostaining |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunostaining |
| Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | transgenic fish with nuclear localized EGFP |
| Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | transgenic fish with cell membrane localized EGFP |
References
- Assheton, R. . Growth in length: Embryological Essays. , (1916).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (1700003), (2017).
- Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish. Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).
- Dubrulle, J., Pourquié, O. fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo. Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).
- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
- Stern, H. M., Hauschka, S. D. Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants. Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquié, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).
- Manning, A. J., Kimelman, D. Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors. Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
